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문제 정의
- 따라서 최근 웰빙(well-being)과 함께 건강식품으로 알려진 현미의 영양학적 가치를 높이기 위한 기초 연구로 본 연구에서는 현미에 김치에서 분리한 phytase 활성 우수Lactobacillus(L.) sakei wikim001 균주 첨가를 통한 발효에 의한 현미의 phytate 함량 변화 및 적정 발효 조건에 대한 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 phytate를 myo-inositol과 무기태인으로 분해시키는 효소인 phytase 생산균주의 분리 및 현미의 phytate 저감 최적 온도 및 pH에 관한 것이다. 먼저 phytase 활성측정을 통하여 우수한 phytase 활성을 가지는 균주를 김치로부터 분리 및 선발하고 내산성과 내열성 실험으로 균주의 특성을 파악하고, 당 이용성 조사 및 16S rRNA sequence분석으로 L.
제안 방법
- Genomic DNA는 G-spin genomic DNA extraction kit(iNtRon Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 분리하고 제조사의 protocol에 따라 genomic DNA를 추출하였다. 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다.
- Genomic DNA는 PCR 기계(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 증폭하였으며 각각의 primer 1 μL(40pmol), 10×buffer 2.5 μL, dNTP 2 μL(2.5 mM, Takara, Shiga, Japan), Taq polymerase(5 unit/μL, Takara) 0.1 μL가 포함된 25 μL 혼합액에 1 μL template DNA를 넣어 증폭시켰다.
- L. sakei Wikim001의 pH 영역별 phytate 저감능을 확인하였다(Fig. 6). Phytate 함량 변화로 추론한 L.
- 3). L. sakei Wikim001의 열 안정성은 MRS 배지에 투여한 다음 30, 40, 50, 60oC에서 20분간 정치 후 생존하는 수를 조사하였다(Fig. 4). 30oC에서는 5.
- 각 반응은 95oC에서 5분간 예비변성(predenaturation)을 1회 실시한 후, 본변성(denaturation)은 95oC에서 1분, 풀림(annealing)은 45oC에서 1분, 확장(extension)은 72oC에서 1분간의 중합반응 과정으로 30회 실시하였고 마지막으로 추가확장을 72oC에서 10분간 더 실시하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동으로 확인 후 염기서열을 분석하였다. 그 결과 확인된 염기서열을 균 동정을 위하여 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하였다.
- Phytase의 활성도는 Quan 등(16)과 Shimizu(17)의 방법을 변형하여 분석하였으며, 세포내 phytase 활성(intracellular phytase activity)은 배양액을 원심분리 하여 균체를 수확한 후 0.85% NaCl 용액으로 2～3회 세척하고 0.2 M acetate 완충용액(pH 3.5)에서 유산균체의 phytase 활성을 측정하였다. 세포 내 phytase 활성은 단위 배양액이 함유하는 세포의 효소활성을 용량을 기준으로 한 세포내 효소활성의 합으로 나타내었다.
- Phytate 함량을 비교하기 위하여 증류수로 10배 희석한 배양액 3 mL에 Wade 시약 1 mL를 가한 후 vortex mixer로 10초간 혼합하고 0.45 μm syringe filter로 여과하여 500nm에서 여과액의 흡광도를 측정하였다.
- 곱게 갈은 현미의 상층액을 1%로 첨가한 MRS broth에 phytase 활성을 가지는 유산균을 첨가하여 24시간 방치한 후 phytate 함량을 비교하였다. pH에 대한 phytase의 영향을 알아보기 위하여 MRS broth를 0.1 N HCl로 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.5로 조정한 다음 곱게 갈은 현미의 상층액을 1%가 되게 첨가한 배지에 phytase 활성을 가지는 유산균을 첨가하여 30oC에서 24시간 방치한 후 phytate 함량을 비교하였다. Phytate 함량을 비교하기 위하여 증류수로 10배 희석한 배양액 3 mL에 Wade 시약 1 mL를 가한 후 vortex mixer로 10초간 혼합하고 0.
- 1 μL가 포함된 25 μL 혼합액에 1 μL template DNA를 넣어 증폭시켰다. 각 반응은 95oC에서 5분간 예비변성(predenaturation)을 1회 실시한 후, 본변성(denaturation)은 95oC에서 1분, 풀림(annealing)은 45oC에서 1분, 확장(extension)은 72oC에서 1분간의 중합반응 과정으로 30회 실시하였고 마지막으로 추가확장을 72oC에서 10분간 더 실시하였다. PCR 산물은 1.
- 온도에 대한 phytase의 영향은 30, 40, 50, 60oC에서 실시하였다. 곱게 갈은 현미의 상층액을 1%로 첨가한 MRS broth에 phytase 활성을 가지는 유산균을 첨가하여 24시간 방치한 후 phytate 함량을 비교하였다. pH에 대한 phytase의 영향을 알아보기 위하여 MRS broth를 0.
- 광주 지역의 맛집과 김치 생산업체들의 배추김치를 수거하여 4oC의 저온에서 숙성시켰다. 상기 김치시료가 pH 4.
- Genomic DNA는 G-spin genomic DNA extraction kit(iNtRon Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 분리하고 제조사의 protocol에 따라 genomic DNA를 추출하였다. 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. Genomic DNA는 PCR 기계(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 증폭하였으며 각각의 primer 1 μL(40pmol), 10×buffer 2.
- 김치로부터 분리한 L. sakei Wikim001의 특성 확인을 위하여 내산성 및 열 안전성을 확인하였다. 내산성 실험 결과 L.
- 내산성 시험은 HCl과 NaOH 용액을 사용하여 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.5로 각각 조정한 MRS 액체배지에 유산균 배양액을 10% 접종하고, 37oC incubator(SJ-402M, Sejong Scientific Co., Gyeonggi, Korea)에서 2시간 배양한 다음 MRS 평판배지에 도말하여 48시간 배양한 후, 총균수를 측정하였다.
- 본 연구는 phytate를 myo-inositol과 무기태인으로 분해시키는 효소인 phytase 생산균주의 분리 및 현미의 phytate 저감 최적 온도 및 pH에 관한 것이다. 먼저 phytase 활성측정을 통하여 우수한 phytase 활성을 가지는 균주를 김치로부터 분리 및 선발하고 내산성과 내열성 실험으로 균주의 특성을 파악하고, 당 이용성 조사 및 16S rRNA sequence분석으로 L. sakei가 동정되어 이 균주를 L. sakei Wikim001으로 명명하였다. L.
- 열 안정성은 MRS 액체배지에 유산균 배양액을 10% 접종하고 30, 40, 50, 60oC incubator(SJ-402M, Sejong Scientific Co.)에서 20분간 정치한 다음 MRS 평판배지에 도말하여 48시간 배양한 후, 총균수를 측정하였다.
- 효소에 대한 온도와 pH의 영향을 알아보기 위하여 배양액 중 phytate 함량은 변형된 Wade 방법으로 측정하였다. 온도에 대한 phytase의 영향은 30, 40, 50, 60oC에서 실시하였다. 곱게 갈은 현미의 상층액을 1%로 첨가한 MRS broth에 phytase 활성을 가지는 유산균을 첨가하여 24시간 방치한 후 phytate 함량을 비교하였다.
- 증류수로 10배 희석한 시료 3 mL에 Wade 시약(증류수에 0.03% FeCl3․6H2O와 0.3% sulfosalicylic acid 용해) 1 mL를 가한 후 vortex mixer로 10초간 혼합하고 0.45 μm syringe filter로 여과하여 500 nm에서 여과액의 흡광도를 측정하였다.
- 표준 기질에서의 반응 pattern을 기반으로 실제 식품에서의 기질인 현미에 김치유산균주를 처리하고 그 반응 양상을 관찰하였다. 현미에 김치유산균을 접종하여 24시간 동안 배양한 결과 L.
대상 데이터
- 1과 같다. 김치 시료로부터 분리한 균주는 선발한 순서에 따라 명명하였으며, 이들 중 효소 생산성이 높은 균주 B04을 선발하였다. 그리고 API 50 CHL kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 분리균의 당 이용성 조사(Table 1)를 통한 균 동정 결과 L.
- 김치로부터 분리한 48개의 김치유산균의 세포 내 phytase활성을 측정하였으며 결과는 Fig. 1과 같다. 김치 시료로부터 분리한 균주는 선발한 순서에 따라 명명하였으며, 이들 중 효소 생산성이 높은 균주 B04을 선발하였다.
데이터처리
- 5% agarose gel에서 전기영동으로 확인 후 염기서열을 분석하였다. 그 결과 확인된 염기서열을 균 동정을 위하여 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하였다.
- 모든 자료는 mean±SE이며, 통계학적 유의성 검정은 Student's t-test에 의하여 검정하였다.
이론/모형
- 45 μm syringe filter로 여과하여 500 nm에서 여과액의 흡광도를 측정하였다. Phytate 함량은 Na-phytate 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- 효소에 대한 온도와 pH의 영향을 알아보기 위하여 배양액 중 phytate 함량은 변형된 Wade 방법으로 측정하였다. 온도에 대한 phytase의 영향은 30, 40, 50, 60oC에서 실시하였다.
성능/효과
- 30oC에서는 5.90×108 CFU/mL, 40oC에서는 2.15×108 CFU/mL, 50oC에서는 7.35×106 CFU/mL, 60oC에서는 5.16×104 CFU/mL 정도 생존하여 30oC가 가장 우수한 생육 조건임을 알 수 있었다.
- sakei Wikim001으로 명명하였다. L. sakei Wikim001에 의한 현미의 phytate 분해능을 확인하였으며, L. sakei Wikim001의 현미의 phytate 분해의 적정반응 pH는 5.0～6.5이며 온도는 30～40oC로 나타났다.
- 6). Phytate 함량 변화로 추론한 L. sakei Wikim001 최적 phytase 활성을 가지는 최적반응 pH는 5.0～6.5로 나타났으며, pH 4.0 이하에서는 L. sakei Wikim001의 phytase에 의해 현미의 phytate는 거의 분해되지 않았다. 일반적으로 세균의 phytase는 pH 6.
- 김치 시료로부터 분리한 균주는 선발한 순서에 따라 명명하였으며, 이들 중 효소 생산성이 높은 균주 B04을 선발하였다. 그리고 API 50 CHL kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 분리균의 당 이용성 조사(Table 1)를 통한 균 동정 결과 L. sakei와 매우 유사한 것으로 판정되었다. 보다 정확한 동정을 위하여 분리균주의 16S rRNA 염기서열을 NCBI의 BLAST program을 이용하여 상동성을 비교한 결과 L.
- 많은 유산균은 프로바이오틱스로서 소화 흡수를 돕고 장내부패를 억제하며 설사 변비의 치료 효과, 장내 유해균의 억제, 비타민의 생성, 혈중 콜레스테롤 저하능, 항암 효과, 인체의 면역 능력 증강 등 다양한 기능성이 보고되고 있다(20-23). 다른 미생물은 균의 phytase를 분리하여 식품이나 사료에 적용해야 하지만 본 연구에서 사용한 L. sakei Wikim001 균주는 phytase 분리 없이 균 자체를 식품이나 사료에 적용 가능할 것으로 판단된다. 본 연구에 사용된 L.
- sakei와 매우 유사한 것으로 판정되었다. 보다 정확한 동정을 위하여 분리균주의 16S rRNA 염기서열을 NCBI의 BLAST program을 이용하여 상동성을 비교한 결과 L. sakei 균주(GenBank accession number AB600196.1)와 99%의 상동성을 나타내어 이 균주를 L. sakei Wikim001으로 명명하였다(Fig. 2).
- sakei Wikim001 균주는 phytase 분리 없이 균 자체를 식품이나 사료에 적용 가능할 것으로 판단된다. 본 연구에 사용된 L. sakei Wikim001 균주 역시 비교적 높은 온도에서 적정반응을 보일 것으로 기대하였으나 기존에 보고된 균주들의 적정반응 온도보다 낮은 30～40oC로 나타났다(Fig. 7). 이러한 낮은 적정반응 온도는 오히려 생균상태의 L.
- 0의 pH 영역에서 최적반응 pH를 갖는 산성 phytase이다(18). 본 연구에서 사용한 L. sakei Wikim001 균주 역시 중성 범위의 pH에서 가장 우수한 phytate 분해능을 보임으로써 다른 세균과 유사한 결과를 나타내었다. Fig.
- 표준 기질에서의 반응 pattern을 기반으로 실제 식품에서의 기질인 현미에 김치유산균주를 처리하고 그 반응 양상을 관찰하였다. 현미에 김치유산균을 접종하여 24시간 동안 배양한 결과 L. sakei Wikim001 김치유산균주는 현미의 phytate 함량을 유의적으로 감소시켰다(Fig. 5). 발효에 의한 여러 기질의 이용효율을 파악하기 위해서는 pH, in vitro에서의 단백질과 전분 소화율, in vivo 실험 등을 수행해야 정확한 자료를 도출할 수 있다.
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