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문제 정의
- LPS 는 대식세포의 toll-like receptor (TLR) 4 에 작용하여 핵 인자 카파 비(nuclear factor κappa B ; NF-κB)와 미토겐활성 단백질인산화효소(mitogen-activated protein kinase ; MAPK)가 활성화되면서 사이토카인관련 유전자의 발현을 통해 염증매개물질들이 생산되어 분비된다 [26]. 본 연구에서는 노회, 석류, 석곡, 자화지정 등 네 가지 약용식물 추출물에 대하여 신호전달체계 활성화 억제기전을 확인하는 실험을 통해 그 적용가능성을 보다 상세하게 검토하여 아토피 피부염의 증상을 개선 완화할 수 있는 약용식물 추출물 소재를 개발하고자 한다.
제안 방법
- 즉 RAW 264.7 세포에 다양한 농도의 약용식물 추출물을 30분간 전처리한 다음, LPS (0.5 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- 대식세포를 LPS로 자극시 발현되는 사이토카인인 인터루킨 IL-6, IL-1β의 유전자발현을 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction ; RT-PCR)으로 측정하여 약용식물 추출물에 의한 염증성 사이토카인 유전자 발현억제효과를 평가하였다.
- 배양액으로는 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco, USA)배지에 10 % fetal bovine serum (Gibco), 100-units/mL penicillin (Gibco), 100 ng/ml streptomycin (Gibco), 0.25 g/mL amphotericin B (Gibco), 1X non-essential amino acids solution (Gibco)을 첨가하였다.
- 저자에 의한 이전 연구에서는[25] 아토피 피부염 증상완화에 효과적인 약용식물 추출물을 발굴하기 위하여 의학서에 기록된 한약재에 관련한 문헌조사를 통해 선정된 한약재 120 종을 1, 2 차 스크리닝 실험을 통해 노회(蘆薈, Aloe vera L., AV), 자화지정(紫花地丁, Viola mandshurica W. Becker, VM), 석류(石榴, Punica granatum L., PG), 석곡(石斛, Dendrobium nobile L., DN) 등 4 종의 약재를 선정하였고 이들 약용식물 추출물에 대하여, 세포독성과 항산화, 항염증, 항알레르기 등의 효능을 in vitro 및 in vivo test 방법으로 평가하였다. 특히 항염효능에 있어서 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 활성화된 대식세포(macrophage)에 대한 약용식물 추출물의 nitric oxide(NO) 생성억제 실험결과, 노회, 석류, 석곡, 자화지정 및 혼합추출물 모두 농도 의존적으로 LPS 에 의한 NO 생성을 억제하였다.
- Total RNA는 RT-PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 GAPDH, IL-6, IL-1β primer (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 즉 RAW 264.7 세포에 각각 10 ppm, 100 ppm 의 약용식물 추출물을 전처리한 후 30 분간 배양하고 LPS (0.1 μg/ml) 를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- NF-κB luciferase reporter 유전자를 대식세포에 transient transfection처리한 후 대식세포가 LPS에 의해 세포내의 NF-κB가 활성화되면 luciferase에 의해 발광되는 원리를 이용하여 NF-κB의 활성화 정도를 확인하였다.
- 대식세포가 LPS 에 의해 세포내 MAPK 가 활성화되는 정도를 웨스턴 브롯 분석(western blot analysis)으로 확인하였다. 즉 RAW 264.
- 아토피 피부염증상완화에 효과적인 약용식물 추출물을 발굴하기 위해 노회, 자화지정, 석류, 석곡 등 4 종의 약재에 대하여 대식세포를 lipopolysaccharide(LPS)로 자극시 염증성 사이토카인 IL-6 과 IL-1β 의 유전자발현 억제실험과 염증반응의 신호전달체계인 NF-κB 과 MAP kinase 활성 억제실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 대식세포 (macrophage)인 RAW 264.7 세포를 Dulbecco's modified Eagle's medium 으로 배양한다.
- 본 실험에 사용된 약용식물인 노회, 자화지정, 석류, 석곡은 국내 약초시장인 경동시장에서 구입하였다. 시약류는 분석시약급을 사용하였다.
- 본 시험에 사용된 기기는 감압농축기 (EYELA, Japan), UV spectrophotometer (Shimadazu, Japan), CO2 incubator (Jeotech, Korea)이었다.
이론/모형
- 약용식물 추출물의 NF-κB 활성억제 효과는 luciferase assay system (Promega, USA)를 이용하여 측정하였다 [29].
성능/효과
- 대식세포에 대한 TNF-α 생성억제 실험결과, 노회, 석곡, 자화지정은 TNF-α 생성억제효과가 큰 것으로 나타났으며 석류의 경우는 그 효과가 적었다.
- 특히 노회의 경우는 NO 및 TNF-α 생성 모두를 가장 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- , DN) 등 4 종의 약재를 선정하였고 이들 약용식물 추출물에 대하여, 세포독성과 항산화, 항염증, 항알레르기 등의 효능을 in vitro 및 in vivo test 방법으로 평가하였다. 특히 항염효능에 있어서 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 활성화된 대식세포(macrophage)에 대한 약용식물 추출물의 nitric oxide(NO) 생성억제 실험결과, 노회, 석류, 석곡, 자화지정 및 혼합추출물 모두 농도 의존적으로 LPS 에 의한 NO 생성을 억제하였다. 특히, 노회및 석곡 의 경우는 LPS 에 의한 NO 생성을 거의 100% 억제 하는 효과를 나타내었다.
- Fig. 1, 2, 3, 4에서 볼 수 있듯이 약용식물 추출물의 처리농도 0.01%, 0.001% 조건하에서 나는 사이토카인 유전자발현 억제효과는 석류, 석곡, 노회에서는 억제효과가 확실하게 나타났으나 자화지정에서는 억제효과가 거의 나타나지 않았다. 이전의 연구에서는[32] LPS에 의한 NO 생성을 억제하는 효과는 노회(AV), 석류(PG), 석곡 (DN), 자화지정(VM) 모두 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하였고 LPS에 의한 TNF-α 생성억제효과는 노회, 석곡, 자화지정은 효과가 큰 것으로 나타났으며 석류의 경우는 그 효과가 적었다.
- 본 실험에서도 노회가 가장 효과적으로 인터루킨 IL-6과 IL-1β의 유전자발현을 억제하는 것으로 나타났다.
- 특히 석류와 석곡은 10ppm 의 처리농도에서 각각 95%, 90%의 억제 효과는 나타냈고, 노회와 자회지정은 같은 농도로 처리시 각각 54%, 37%의 억제효과를 보여 석류와 석곡에 비해 NF-κB 활성억제능이 떨어지는 것으로 판단되었다 (Fig. 5).
- 석류, 석곡, 자화지정, 노회 등의 약용식물 추출물에 대한 NF-κB 활성억제 실험결과와 MAPK 활성억제 실험결과를 종합하면 석류, 석곡, 자화지정은 NF-κB 활성을 억제함으로서, 그리고 노회는 NF-κB 과 JNK MAP kinase 활성을 억제함으로써 항염 효능을 나타낸다고 판단된다.
- 석류, 석곡, 자화지정, 노회 등의 약용 식물 추출물에 대한 NF-κB 활성억제 실험결과와 MAPK 활성억제 실험결과를 종합하면, 석류, 석곡, 자화지정은 NF-κB 활성을 억제함으로써, 그리고 노회는 NF-κB 과 JNK MAP kinase 활성을 모두 억제함으로써 항염 효능을 나타낸다고 판단된다.
- LPS 로 자극된 대식세포에 대한 약용식물 추출물의 사이토카인 IL-6 과 IL-1β 의 유전자발현 억제 실험결과, 약용식물 추출물의 처리농도 0.01%, 0.001% 조건하에서 석류, 석곡, 노회는 사이토카인 유전자발현 억제효과가 확실하게 나타났으나, 자화지정은 억제효과가 거의 나타나지 않았다.
- LPS 로 자극된 대식세포에 대한 약용식물 추출물의 염증관련 신호전달체계 NF-κB 의 활성화 억제실험 결과, 석류, 석곡, 자화지정, 노회 모두 10ppm 의 처리농도에서 NF-κB 활성화를 효과적으로 억제함을 보여 주었다.
- LPS 로 자극된 대식세포에 대한 약용식물 추출물의 염증관련 신호전달체계 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성화억제 실험결과, 노회 100 ppm 으로 처리한 경우 JNK MAP kinase 의 활성이 현저히 억제되었으나 p38 MAP kinase 의 활성에는 영향이 없었다. 그리고 자화지정, 석류, 석곡은 JNK 및 p38 MAP kinase 의 활성을 억제하지 못하였다.
- 상기의 결과들에 의하면 노회, 석류, 석곡, 자화지정 추출물은 항염증의 효능을 가지고 있어 아토피 피부염의 증상을 개선 완화할 수 있는 약용 식물 추출물소재로서 활용할 수 있는 것으로 판단된다.
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