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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 한의학의 본초학(本草學)적 이론에 근거하여, 아토피 피부염에 개선효과가 있을 것으로 보이는 청열(淸熱) 및 조습(燥濕) 효능을 가진 고삼(苦蔘)과 백선피(白鮮皮)에 윤폐(潤肺), 양기(養氣) 및 조화제약(調和諸藥)의 효능이 있으며 정신을 안정시키고 모든 맥(脈)의 순환을 이롭게 하며, 피부를 재생시키는 효과도 겸하고 있는 감초(甘草)[25, 26]를 배합함으로써, 스트레스에 민감한 아토피 피부염 증상에 단일 약물로서의 효과 뿐 아니라 복합 처리 시 상승효과를 볼 수 있을 것으로 기대되어 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB)로 유도된 동물모델을 활용하여 아토피 피부염 억제 활성을 검증하고자 하였다.
- 또한, 비장은 B 세포 발생의 최종단계가 진행되는 곳이며, 동시에 혈액에서 유래된 항원에 반응하는 특화된 기관으로서 기능을 갖는다[2]. 따라서 한약재 추출물이 DNCB에 의해서 유도된 아토피 피부염이 발생한 마우스의 면역장기에 미치는 영향을 관찰하기 위해 비장(spleen)의 무게를 측정하였으며, 아울러 한약재 추출물의 독성 여부를 평가하기 위하여 간(liver)의 무게를 측정하였다. Fig.
- 이에 따라 본 연구에서는 마우스의 혈장 내에 IFNγ, IL-4, IL-5 및 IL-13과 같은 면역 관련 cytokine의 발현 정도를 확인하였으며, 면역반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화를 측정하기 위하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현 정도를 측정함으로써 후보 한약재 및 복합 추출물의 cytokine 조절 능력이 아토피성 피부염 치료 및 예방 관련 연관성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 고삼(GS), 감초(GC), 백선피(BSP) 추출물 및 다양한 비율로 조성된 한약재 복합 추출물의 항아토피성 효능을 조사하였으며, 각각의 단일 추출물과 복합 추출물에서 항아토피성 조절제로서의 발굴 가능성이 있음을 확인하였다. 특히, 고삼(GS)과 감초(GC) 및 백선피(BSP) 추출물이 3:1:1로 혼합된 복합 추출물인 GGB-1이 항아토피 관련 기능성 소재 개발에 보다 안정적이며 효과적일 수 있음을 제안하고자 한다.
제안 방법
- 0.4% DNCB 용액을 3회 도포 후 충분한 아토피 염증반응이 일어났을 때 양성대조군으로 5 mg/ml의 dexamethasone (Sigma-Aldrich)과 고삼(GS), 감초(GC) 및 백선피(BSP)의 단일 추출물과 다양한 조합으로 구성된 복합 추출물(GGB, Table 1)을 이틀 간격으로 300 mg/kg의 양으로 10회 경구투여 후등 부분과 귀의 염증반응 및 손상완화 정도를 비교하였다 (Table 1).
- 1차 도포 후 7일부터는 이틀 간격으로 0.4% DNCB 용액 200 μl를 실험이 종료될 때까지 동일한 부위에 고르게 도포하여 아토피 피부염이 지속되도록 하였다(Fig. 1) [29, 32].
- DNBC에 의해 아토피성 피부염이 유발된 마우스의 혈청내 IgE 농도에 한약재 단일 추출물과 복합 추출물이 미치는 영향을 분석하기 위하여 IgE의 농도를 측정하였다. 그 결과 DNCB 처리군은 정상군에 비하여 혈청 내 IgE의 농도가 선행보고[29.
- DNCB 용액으로 마우스의 등과 귀 피부에 아토피 피부염을 충분히 유발시킨 후 DNCB 용액을 도포하면서 시료를 경구투여하여 마우스의 등과 귀 피부에 나타난 아토피 증상 변화를 관찰하여 실험의 설계가 적절히 이루어졌는지를 조사하였다. 외상 병변에서, 정상군의 피부 상태는 깨끗하였고 DNCB 처리군에서는 전형적인 아토피 피부염 유발에 동반[29, 32]되는 홍반, 부종, 인설, 가피 및 태선화 등의 다양한 아토피 증상이 뚜렷하게 나타났으며, 양성대조군인 dexamethasone 처리 군과, 감초(GC) 및 백선피(BSP) 처리군을 제외한 한약재 추출물군에서는 DNCB군에 비해 아토피 증상이 유의적으로 완화된 것을 육안으로 관찰 할 수 있었다(Fig.
- DNCB에 의해 아토피 피부염이 유발된 마우스에서 한약재 추출물의 아토피성 피부염의 완화 효과를 확인하기 위하여 10 회에 걸쳐 한약재 단일 추출물과 복합 추출물을 DNCB와 함께 동시에 처리하여 귀 두께를 관찰하였다. 귀 두께는 선행 보고의 결과[29,32]에서와 유사하게DNCB 처리군이 정상군에 비해 유의적으로 매우 두꺼워졌지만, 감초(GC)와 백선피(BSP) 를 제외한 한약재 추출물 처리군은 DNCB 처리군에 비하여 유의적으로 얇아짐을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 본 실험에서 사용한 한약재인 고삼(Sophora flavescens), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer), 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)는 대한생약(주)(Busan, Republic of Korea)에서 파쇄된 상태로 구입하였다. 각 약재는 1 kg을 주정(Duksan Pure Chemicals Co., Ansan, Republic of Korea)을 이용하여 추출하였다. 추출 시 초음파 기기에 30분씩 총 4번을 반복하여 추출하였으며, 추출된 용매를 rotary evaporator (Eyela A-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축시킨 후 증류수를 이용 하여 100 mg/ml의 농도로 stock solution을 만든 후 적정 농도로 실험동물에 투여하였다.
- 그 후 IgE를 인지하는 2차 항체를 넣은 다음 기질인 100 μl의 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB, SigmaAldrich) 용액을 첨가하여 15분간 반응시킨 후, 50 μl의 stop 용액(1M H3PO4)을 넣어 반응을 종료 시키고 ELISA reader (450 nm, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA)로 측정 하였다.
- 적출한 피부조직은 식염수로 수세한 후 optimal cutting temperature (OCT) compound로 동결 조직절편을 만들어 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하였다. 또한 비만세포의 양적 변화 관찰을 위하여 toluidine blue (TB) 염색을 추가적으로 실시하였다. 염색한 조직은 광학현미경을 이용하여 조직변화 및 비만세포의 침윤 정도를 관찰하였다.
- , Kanagawa, Japan)를 사용하여 삼일 간격으로 측정 하였다. 또한 실험 종료일에 마우스를 희생시킨 다음 비장과 간을 적출하여 그 무게를 측정하였다.
- 실험 시작과 함께 Balb/c 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화(홍반, 가려움, 건조피부, 부종, 짓무름 및 태선화 등)를 3주 동안 관찰하였다. 또한 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 변화 유무를 관찰하면서 체중과 귀 두께 변화를 측정하였다. 체중은 electric balance (Precisa, Dietikon, Swiss) 를 사용하여 측정하였고, 귀 두께는 vernier calipers (Mitu-toyo Co.
- 6B). 또한, 염증반응으로 인한 비만세포의 침윤에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 TB 염색을 시행한 후 염색된 비만세포의 침윤 상태를 관찰하였다. 그 결과, DNCB 처리군은 정상군에 비하여 침윤된 비만세포가 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었으며, 고삼(GS)과 복합 추출물 처리군에서 침윤된 비만세포의 수가 전체적으로 감소되었다(Fig.
- 실험 시작과 함께 Balb/c 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화(홍반, 가려움, 건조피부, 부종, 짓무름 및 태선화 등)를 3주 동안 관찰하였다. 또한 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 변화 유무를 관찰하면서 체중과 귀 두께 변화를 측정하였다.
- 실험 시작일부터 종료일까지 마우스의 체중을 3 일에 한번씩 측정하였다. 실험을 진행하는 동안 정상군의 체중은 꾸준한 증가를 보였고, DNCB 처리군은 정상군에 비해 현저하게 체중이 감소하였으며, 이는 아토피 피부염에 의한 스트레스에 의한 결과로 생각되어진다.
- 실험동물은 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 주야 12시간 교대로 150∼300 Lux의 환경에서 마우스용 케이지에 8~9마리씩 수용 하여 사육하면서 멸균 증류수와 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 실험동물의 심장으로부터 채취한 혈액을 원심분리 한 후 혈청 내의 cytokine (IL-4, 5, 6, 13, 1β, IFN-γ 및 TNF-α)의 농도는 ELISA kit (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용해 측정하였다.
- 또한 비만세포의 양적 변화 관찰을 위하여 toluidine blue (TB) 염색을 추가적으로 실시하였다. 염색한 조직은 광학현미경을 이용하여 조직변화 및 비만세포의 침윤 정도를 관찰하였다.
- 적출한 피부조직은 식염수로 수세한 후 optimal cutting temperature (OCT) compound로 동결 조직절편을 만들어 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하였다.
- 또한 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 변화 유무를 관찰하면서 체중과 귀 두께 변화를 측정하였다. 체중은 electric balance (Precisa, Dietikon, Swiss) 를 사용하여 측정하였고, 귀 두께는 vernier calipers (Mitu-toyo Co., Kanagawa, Japan)를 사용하여 삼일 간격으로 측정 하였다. 또한 실험 종료일에 마우스를 희생시킨 다음 비장과 간을 적출하여 그 무게를 측정하였다.
- , Ansan, Republic of Korea)을 이용하여 추출하였다. 추출 시 초음파 기기에 30분씩 총 4번을 반복하여 추출하였으며, 추출된 용매를 rotary evaporator (Eyela A-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축시킨 후 증류수를 이용 하여 100 mg/ml의 농도로 stock solution을 만든 후 적정 농도로 실험동물에 투여하였다. 각각의 한약재에 대한 수율은 10.
- 한약재 추출물이 아토피 피부염에 미치는 조직병리학적 영향을 관찰하기 위하여 마우스의 귀 조직에 대한 변화를 관찰 하였다. Fig.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 5주령의 Balb/c 암컷마우스는 샘타코 (주)(Osan, Republic of Korea)에서 공급받았으며 1주일간 동물실험실 적응 과정을 거친 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 주야 12시간 교대로 150∼300 Lux의 환경에서 마우스용 케이지에 8~9마리씩 수용 하여 사육하면서 멸균 증류수와 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 본 실험에서 사용한 한약재인 고삼(Sophora flavescens), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer), 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)는 대한생약(주)(Busan, Republic of Korea)에서 파쇄된 상태로 구입하였다. 각 약재는 1 kg을 주정(Duksan Pure Chemicals Co.
- 아토피 피부염 유발을 위하여 6주령 마우스(n =6)의 등을 귀하단에서부터 제모하고 24시간 방치 후 1% 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB, acetone:olive oil =3:1, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액 200 μl를 제모 부위에 도포하고, 3일후 2차 도포하였다.
데이터처리
- 실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 mean ± S.D. 로 요약하였으며, student’s t-test로 분석하여 p-value가 0.05이하일 경우 유의성을 인정하였다.
성능/효과
- 4). 각 시료군의 귀 두께를 정상군의 귀 두께와 비교하였을 때, DNCB 처리군의 귀 두께는 2.4배 정도 두꺼워졌으나, 복합 추출물 GGB-1처리군에서는 1.7 정도의 값을 나타냈으며 양성대조군인 dexamethasone 처리군에 비하여 효과적인 결과를 보였다. 또한 GGB-4 처리군과 고삼(GS) 처리군에서도 dexamethasone 처리군과 유사한 값을 나타내어 고삼 단일 추출물과 복합 추출물 GGB-1 및 -4가 아토피 피부염 억제에 비교적 유의적인 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
- DNBC에 의해 아토피성 피부염이 유발된 마우스의 혈청내 IgE 농도에 한약재 단일 추출물과 복합 추출물이 미치는 영향을 분석하기 위하여 IgE의 농도를 측정하였다. 그 결과 DNCB 처리군은 정상군에 비하여 혈청 내 IgE의 농도가 선행보고[29.32]에서처럼 급격하게 증가하였으나, 감초(GC) 처리 군을 제외한 한약재 단일 추출물과 복합 추출물의 처리군에서 혈청 내의 IgE의 농도가 유의적으로 감소하였다. 특히, 고삼 (GS)과 복합 추출물 GGB-1 처리군의 혈청 내 IgE 농도는 양성대조군인 dexamethasone 처리군에 비해 30~40% 낮은 농도를 나타내었다(Fig.
- 또한, 염증반응으로 인한 비만세포의 침윤에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 TB 염색을 시행한 후 염색된 비만세포의 침윤 상태를 관찰하였다. 그 결과, DNCB 처리군은 정상군에 비하여 침윤된 비만세포가 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었으며, 고삼(GS)과 복합 추출물 처리군에서 침윤된 비만세포의 수가 전체적으로 감소되었다(Fig. 7A). 특히, 복합 추출물 GGB-1은 고삼(GS) 처리군에 비하여 유의적으로 비만세포의 침윤이 억제되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 7 정도의 값을 나타냈으며 양성대조군인 dexamethasone 처리군에 비하여 효과적인 결과를 보였다. 또한 GGB-4 처리군과 고삼(GS) 처리군에서도 dexamethasone 처리군과 유사한 값을 나타내어 고삼 단일 추출물과 복합 추출물 GGB-1 및 -4가 아토피 피부염 억제에 비교적 유의적인 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다. 특히 복합 추출물 GGB-1은 한약재 단일 추출물의 함량에 비해 각각의 한약재 단일 추출물의 함량이 낮음에 비하여 더 효과적이거나 유사한 결과를 나타내어 한약재 단일 추출물보다 아토피 피부염을 억제하는데 더 효과적인 시료임을 알 수 있었다.
- 또한 이들 면역반응에 따른 염증반응과 관련된 혈장 내 cytokine인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현 변화를 측정한 결과 면역반응과 관련된 cytokine의 결과와 유사한 경향을 나타내었다(Fig. 10).
- 실험을 진행하는 동안 정상군의 체중은 꾸준한 증가를 보였고, DNCB 처리군은 정상군에 비해 현저하게 체중이 감소하였으며, 이는 아토피 피부염에 의한 스트레스에 의한 결과로 생각되어진다. 반면, 고삼(GS)과 복합 추출물 (GGB-1, -2, -3 및 -4) 처리군은 DNCB 처리군에 비해 체중감소가 크지 않았고, 체중의 증감 폭이 적게 나타났다(Fig. 3)
- 본 연구에서는 고삼(GS), 감초(GC), 백선피(BSP) 추출물 및 다양한 비율로 조성된 한약재 복합 추출물의 항아토피성 효능을 조사하였으며, 각각의 단일 추출물과 복합 추출물에서 항아토피성 조절제로서의 발굴 가능성이 있음을 확인하였다. 특히, 고삼(GS)과 감초(GC) 및 백선피(BSP) 추출물이 3:1:1로 혼합된 복합 추출물인 GGB-1이 항아토피 관련 기능성 소재 개발에 보다 안정적이며 효과적일 수 있음을 제안하고자 한다.
- 실험 시작일부터 종료일까지 마우스의 체중을 3 일에 한번씩 측정하였다. 실험을 진행하는 동안 정상군의 체중은 꾸준한 증가를 보였고, DNCB 처리군은 정상군에 비해 현저하게 체중이 감소하였으며, 이는 아토피 피부염에 의한 스트레스에 의한 결과로 생각되어진다. 반면, 고삼(GS)과 복합 추출물 (GGB-1, -2, -3 및 -4) 처리군은 DNCB 처리군에 비해 체중감소가 크지 않았고, 체중의 증감 폭이 적게 나타났다(Fig.
- DNCB 용액으로 마우스의 등과 귀 피부에 아토피 피부염을 충분히 유발시킨 후 DNCB 용액을 도포하면서 시료를 경구투여하여 마우스의 등과 귀 피부에 나타난 아토피 증상 변화를 관찰하여 실험의 설계가 적절히 이루어졌는지를 조사하였다. 외상 병변에서, 정상군의 피부 상태는 깨끗하였고 DNCB 처리군에서는 전형적인 아토피 피부염 유발에 동반[29, 32]되는 홍반, 부종, 인설, 가피 및 태선화 등의 다양한 아토피 증상이 뚜렷하게 나타났으며, 양성대조군인 dexamethasone 처리 군과, 감초(GC) 및 백선피(BSP) 처리군을 제외한 한약재 추출물군에서는 DNCB군에 비해 아토피 증상이 유의적으로 완화된 것을 육안으로 관찰 할 수 있었다(Fig. 2). 특히, 단일 추출물인 고삼(GS)과 고삼, 감초 및 백선피가 3:1:1로 혼합된 복합추출물인 GGB-1 처리군에서 완화효과가 더욱 뚜렷하게 관찰되었다.
- 5C). 이 결과를 통하여 독성이 없는 농도 하에서 고삼 (GS) 추출물과 복합 추출물 GGB-1이 아토피 피부염에 효과적인 시료임을 알 수 있었다.
- 8). 이러한 결과는 한약재 단일 추출물과 복합 추출물이 혈청 내 IgE 농도를 유의적으로 감소시키는 효과가 있으며, 특히 고삼(GS)과 복합 추출물 GGB-1 처리군은 IgE의 농도 억제를 통하여 피부염의 증상을 완화시키는데 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
- 7B). 즉 복합 추출물 GGB-1은 DNCB로 유발된 마우스의 아토피성 피부염의 귀 조직 팽창과 비만세포 침윤의 억제에 가장 효과적임을 알 수 있었다.
- 그러나 고삼(GS) 처리군과 복합 추출물 GGB-1 처리군에서는 이러한 증상이 감소되었음을 알 수 있었다. 특히 복합 추출물 GGB-1 처리군에서는 고삼(GS) 처리군과 비교하여 유의적으로 귀 조직의 팽창이 감소됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 6B). 또한, 염증반응으로 인한 비만세포의 침윤에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 TB 염색을 시행한 후 염색된 비만세포의 침윤 상태를 관찰하였다.
- 또한 GGB-4 처리군과 고삼(GS) 처리군에서도 dexamethasone 처리군과 유사한 값을 나타내어 고삼 단일 추출물과 복합 추출물 GGB-1 및 -4가 아토피 피부염 억제에 비교적 유의적인 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다. 특히 복합 추출물 GGB-1은 한약재 단일 추출물의 함량에 비해 각각의 한약재 단일 추출물의 함량이 낮음에 비하여 더 효과적이거나 유사한 결과를 나타내어 한약재 단일 추출물보다 아토피 피부염을 억제하는데 더 효과적인 시료임을 알 수 있었다.
- 32]에서처럼 급격하게 증가하였으나, 감초(GC) 처리 군을 제외한 한약재 단일 추출물과 복합 추출물의 처리군에서 혈청 내의 IgE의 농도가 유의적으로 감소하였다. 특히, 고삼 (GS)과 복합 추출물 GGB-1 처리군의 혈청 내 IgE 농도는 양성대조군인 dexamethasone 처리군에 비해 30~40% 낮은 농도를 나타내었다(Fig. 8). 이러한 결과는 한약재 단일 추출물과 복합 추출물이 혈청 내 IgE 농도를 유의적으로 감소시키는 효과가 있으며, 특히 고삼(GS)과 복합 추출물 GGB-1 처리군은 IgE의 농도 억제를 통하여 피부염의 증상을 완화시키는데 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
- 2). 특히, 단일 추출물인 고삼(GS)과 고삼, 감초 및 백선피가 3:1:1로 혼합된 복합추출물인 GGB-1 처리군에서 완화효과가 더욱 뚜렷하게 관찰되었다.
- 7A). 특히, 복합 추출물 GGB-1은 고삼(GS) 처리군에 비하여 유의적으로 비만세포의 침윤이 억제되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 7B). 즉 복합 추출물 GGB-1은 DNCB로 유발된 마우스의 아토피성 피부염의 귀 조직 팽창과 비만세포 침윤의 억제에 가장 효과적임을 알 수 있었다.
- 혈장 내 면역 반응 관련 cytokine인 IFN-γ, IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현 양을 측정한 결과 DNCB 처리군에서 정상군에 비하여 현저하게 증가되었으며, 감초(GC)를 제외한 고삼(GS) 및 백선피(BSP) 단일 처리군과 복합 추출물 처리 군에서 DNCB군에 비하여 이들의 발현 양이 유의적으로 감소되었다(Fig. 9).
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