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문제 정의
- 본 연구는 다른 우성마커에 비해 높은 재현성을 나타내고 비교적 실험방법과 자료 분석이 용이하여 최근 식물 집단의 유전다양성 연구에 많이 사용되고 있는 ISSR(Inter simple sequence repeat) 마커를 이용하여, 우리나라 특산식물인 매미꽃 집단의 유전적 다양성 및 구조에 대한 이해를 넓히고, 집단 및 지역 간 유전적 분화 양상 및 유연관계를 추정함으로써 매미꽃 자생 집단의 보전대책 수립을 위한 정보를 제공하고자 수행되었다.
제안 방법
- Polymerase chain reaction(PCR)은 주형 DNA 5-10 ng, 1X PCR reaction buffer, 0.1 mM dNTPs, 0.0025% BSA, 0.6 unit Taq DNA polymerase, 0.375 μM의 primer에 total volume이 총 15 μl 되도록 증류수를 조절하여 첨가하였다.
- 하지만 다른 연구 결과와의 비교를 위해서 열성 표현형의 관찰 빈도를 이용하여 Hardy-Weinberg 평형 가정 하에 기대되는 대립유전자의 빈도를 추정하여 Nei’s(1973) 유전자 다양도(h)를 추정하였다.
- 각 size 별로 관찰된 band를 유전자좌의 산물로 간주하였으며, band의 존재 유무에 따라 “1(출현)”과 “0(비출현)”으로 코딩하여 단일유전자좌의 두 가지 표현형(dominant, null)의 빈도를 근거로 data matrix를 작성하였다.
- UV 조명하에 촬영된 사진 자료로부터 재현성이 높고 다형성을 보이는 band만을 유전분석에 이용하였다. 각 size 별로 관찰된 band를 유전자좌의 산물로 간주하였으며, band의 존재 유무에 따라 “1(출현)”과 “0(비출현)”으로 코딩하여 단일유전자좌의 두 가지 표현형(dominant, null)의 빈도를 근거로 data matrix를 작성하였다.
- 3. 프로그램을 이용해서 dendrogram을 산출하였다. 또한 매미꽃 집단의 유전적 cluster의 존재여부를 파악하기 위해서 STRUCTURE ver 2.
- , 2007) 프로그램을 이용하여 Bayesian clustering 분석을 수행하였다. 연관된 대립유전자의 빈도의 가정 하에 admixture model (F model; Falush et al., 2003)을 이용하여 적절한 cluster의 수를 찾기 위해 가상의 cluster 수 K를 1부터 10까지 각각 10회 반복하여 simulation을 수행하였다. 이때 각 simulation에서 최대 반복 횟수(MCMC, Markov Chain Monte Carlo)는 200,000으로 설정하였고 최초 샘플링된 100,000개의 추정치는 모형의 안정성을 위해 제외하였다(burn-in).
- 이에 반해 광주와 남해 집단은 등산로 주변의 조림지 및 나출지로 탐방객의 답압과 탐방로 건설에 의한 자생지 훼손이 심각한 편이었다. 이처럼 다양한 생육환경을 가지는 매미꽃 8집단에 대한 유전특성을 분석하기 위해 각 집단을 대표할 수 있도록 개체간의 거리를 최소 2m 이상 유지하면서 집단의 크기에 따라 소량의 잎을 채취하였다(Fig. 1). 각 개체군의 크기 및 지리적 특성은 Table 1과 같다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 매미꽃의 분포 중심지로 알려진 지리산 및 백운산의 일부 집단과 매미꽃 분포의 변두리 집단에 속하는 남해와 광주 집단을 포함하여 총 8개 집단, 224개체를 선정하였다. 각 집단은 지리적으로 약 15-87 km 정도 떨어져 있으며, 해발 227-744 m, 경사 5-11°범위의 계곡 부를 따라 인접한 사면의 중·하부 지역에 불연속적인 개체군을 형성하고 있었다.
- (1984)의 방법에 따라 추출하였다. 50개의 UBC ISSR primer(Biotechnology Laboratory, University of British Columbia) 중에서 재현성이 높고 변이가 풍부한 7개(#815, #823, #824, #835, #843, #855, #857)를 선정하였다. Polymerase chain reaction(PCR)은 주형 DNA 5-10 ng, 1X PCR reaction buffer, 0.
데이터처리
- , 1999)을 이용하여 다형적 유전자좌의 비율(P)과 유전자좌당 대립유전자수(A), 유전자좌당 유효대립유전자 수(Ae), Shannon’s information index(SI) (Shannon and Weaver, 1949)를 각각 계산하였다. 유전다양성의 집단 내 또는 집단 간의 계층적 분포양상을 알아보기 위해 Arlequin 3.1(Excoffier and Schneider, 2005)을 이용하여 AMOVA(analysis of molecular variance) 분석을 수행하였다. 집단 간 유연관계를 알아보기 위해 유전적 거리를 근거로 PHYLIP v3.
- 프로그램을 이용해서 dendrogram을 산출하였다. 또한 매미꽃 집단의 유전적 cluster의 존재여부를 파악하기 위해서 STRUCTURE ver 2.3 (Pritchard et al., 2007) 프로그램을 이용하여 Bayesian clustering 분석을 수행하였다. 연관된 대립유전자의 빈도의 가정 하에 admixture model (F model; Falush et al.
- 조사된 8집단의 유전적 cluster의 존재 여부를 알아보기 위해 Bayesian cluster 분석을 실시한 결과 ΔK 값이 2일 때 최대값을 보여 최적의 cluster 수를 각각 2로 판단하고 모든 개체를 대상으로 각 cluster에 대한 membership coefficient를 구하였다.
이론/모형
- POPGENE 프로그램(Yeh et al., 1999)을 이용하여 다형적 유전자좌의 비율(P)과 유전자좌당 대립유전자수(A), 유전자좌당 유효대립유전자 수(Ae), Shannon’s information index(SI) (Shannon and Weaver, 1949)를 각각 계산하였다.
- DNA 추출은 Doyle and Doyle(1987)의 CTAB 방법을 수정한 Saghai-Maroof et al.(1984)의 방법에 따라 추출하였다. 50개의 UBC ISSR primer(Biotechnology Laboratory, University of British Columbia) 중에서 재현성이 높고 변이가 풍부한 7개(#815, #823, #824, #835, #843, #855, #857)를 선정하였다.
- 1(Excoffier and Schneider, 2005)을 이용하여 AMOVA(analysis of molecular variance) 분석을 수행하였다. 집단 간 유연관계를 알아보기 위해 유전적 거리를 근거로 PHYLIP v3.5c (Felsenstein, 1993)의 NEIGHBOR 프로그램에서 UPGMA (Sneath and Sokal, 1973)방법으로 유집한 후 최종적으로 FigTree v.1.3. 프로그램을 이용해서 dendrogram을 산출하였다.
성능/효과
- 각 집단은 지리적으로 약 15-87 km 정도 떨어져 있으며, 해발 227-744 m, 경사 5-11°범위의 계곡 부를 따라 인접한 사면의 중·하부 지역에 불연속적인 개체군을 형성하고 있었다. 산청, 하동, 광양, 보성 집단은 울창한 낙엽활엽수림의 계곡부를 따라 분포하고 있었으며, 고흥과 순천 집단은 조림지역으로 숲 가꾸기와 간벌 등의 산림시업으로 피압목 제거와 수광량 증가로 개체군의 밀도가 매우 높게 나타났다. 이에 반해 광주와 남해 집단은 등산로 주변의 조림지 및 나출지로 탐방객의 답압과 탐방로 건설에 의한 자생지 훼손이 심각한 편이었다.
- 종 수준에서 매미꽃 집단에 대한 Nei’s genetic diversity (h)와 Shannon index (SI)는 각각 0.177, 0.278로 나타났지만, 집단수준에서는 평균 0.142 (h), 0.218 (SI)로 나타남으로써 다소 차이를 보여주었다.
- 매미꽃 집단의 유전다양성 분석에 사용된 8개의 ISSR 프라이머에서 총 50개의 증폭산물이 관찰되었으며 이 중 37개에서 다형성을 보였다. 이 중 한 집단에서만 나타나는 고유 밴드는 2개였으며, 산청 집단과 고흥 집단에서 각각 1개씩 관찰되었다.
- 이 중 한 집단에서만 나타나는 고유 밴드는 2개였으며, 산청 집단과 고흥 집단에서 각각 1개씩 관찰되었다. 매미꽃의 종 수준에서의 다형적 유전자 좌의 비율(P)은 74%로 비교적 높게 나타났으나, 각 집단에서 계산된 평균은 47.3%로 나타났다. 각 집단별로는 광양 집단이 56%로 가장 높게 나타났으며, 광주 집단이 36%로 가장 낮은 값을 보여 주었다.
- 3%로 나타났다. 각 집단별로는 광양 집단이 56%로 가장 높게 나타났으며, 광주 집단이 36%로 가장 낮은 값을 보여 주었다. 유전자좌당 평균 대립유전자 수(A)는 광양집단이 1.
- 각 집단별로는 광양 집단이 56%로 가장 높게 나타났으며, 광주 집단이 36%로 가장 낮은 값을 보여 주었다. 유전자좌당 평균 대립유전자 수(A)는 광양집단이 1.56으로 가장 높았으며, 광주 집단이 1.36으로 가장 낮게 나타났고, 유효대립유전자수(Ae) 역시 광양 집단이 1.28로 가장 높은 값을 보여주었다. 종 수준에서 매미꽃 집단에 대한 Nei’s genetic diversity (h)와 Shannon index (SI)는 각각 0.
- 218 (SI)로 나타남으로써 다소 차이를 보여주었다. 집단별 유전적 다양성은 광양(h= 0.171, SI= 0.263) 집단이 가장 높은 값을 보여주었으며, 남해(h= 0.116, SI= 0.183)와 광주(h= 0.121, SI=0.181) 집단이 다른 집단에 비해 비교적 낮은 값을 나타내었다(Table 2).
- 조사된 8집단의 유전적 cluster의 존재 여부를 알아보기 위해 Bayesian cluster 분석을 실시한 결과 ΔK 값이 2일 때 최대값을 보여 최적의 cluster 수를 각각 2로 판단하고 모든 개체를 대상으로 각 cluster에 대한 membership coefficient를 구하였다. 특히 K=2일 때 하동, 산청, 광양, 남해 집단의 개체들과 순천, 보성, 광주, 고흥 집단의 개체들은 각각 cluster 1과 cluster 2에 대체로 포함되어 UPGMA 유집 분석 결과와 일치하는 결과를 보여주었다(Fig. 3, Table 5).
- , 2005). 매미꽃이 포함된 양귀비과(Papaveraceae s. str.)에 대한 분자계통학적 분석결과 매미꽃과 가장 유연관계가 높은 근연 분류군은 피나물(Hylomecon vernalis Maxim.)인 것으로 나타났다(S.W. Son et al., unpubl. data). 또한 매미꽃은 집단 간 파편화가 심하지 않고 비교적 연속적인 분포를 보이며, 근연 분류군인 피나물과의 분포범위가 일부 중복된다는 점으로 미루어 보아 잔존고유종이기보다는 근연 분류군으로부터 종분화에 의해 형성된 신고유종일 것으로 추정할 수 있다.
- data). 또한 매미꽃은 집단 간 파편화가 심하지 않고 비교적 연속적인 분포를 보이며, 근연 분류군인 피나물과의 분포범위가 일부 중복된다는 점으로 미루어 보아 잔존고유종이기보다는 근연 분류군으로부터 종분화에 의해 형성된 신고유종일 것으로 추정할 수 있다. 이러한 종분화 역사를 가지는 특산식물들은 비교적 제한된 분포범위들의 영향으로 인해 집단 수준에서 낮은 유전다양성을 보이는 경우가 많다(Hamrick and Godt, 1996).
- 각 집단별로 유전 다양성을 비교해 보면 주로 산청(SI=0.233, h=0153), 광양(SI=0.263, h=0.171), 순천(SI=0.241, h=0.159) 등의 분포 중심지에 해당하는 집단이 남해(SI=0.183, h=0.116)나 광주(SI=0.181, h=0.121) 등의 변두리 집단보다는 비교적 높은 유전다양성을 유지하는 것으로 나타났다. 일반적으로 집단의 크기가 제한적인 식물의 경우 유전적 부동(genetic drift), 병목현상(bottleneck effects) 및 근친교배(inbreeding) 등의 원인으로 인해 낮은 유전다양성을 보유하는 경우가 많은 것으로 보고되고 있다(Barrett and Kohn, 1991; Hilfiker et al.
- AMOVA 분석 결과에 의해 매미꽃 유전변이의 분포 양상 및 집단 간 분화정도를 추정한 결과, 전체 유전변이의 약 18%가 집단 간 유전적 차이에 기인하였으며, 나머지 82%가 집단 내 개체간의 차이에 기인하는 것으로 나타남으로써 집단 간 분화가 크지 않은 것으로 판단된다. RAPD마커를 이용한 식물 집단 간 유전적 분화정도(ΦST)는 다년생 초본류의 경우 0.
- , 2012). 이러한 분포 패턴으로 미루어 보아 매미꽃은 인접한 집단 간의 유전자 이동이 비교적 원활할 것으로 유추할 수 있는데, 실제로 매미꽃 집단에 대한 Nm (estimate of gene flow from Gst)이 2.184로 (표로 제시되지 않음) 나타남으로써 집단 간 유전자 교류가 원활히 이루어지고 있음을 뒷받침하였다.
- 매미꽃은 인근 집단 간 비교적 빈번한 유전자 교류의 영향으로 비록 집단수준에서 높은 유전적 분화를 나타내지는 않았지만 Bayesian cluster 분석 결과 조사 집단이 동서두 지역으로 cluster를 형성하면서 구조화 되는 경향을 보여주었는데, 이러한 결과는 유전적 거리에 기초한 UPGMA 분석 결과와도 일치하였다. 앞에서도 언급하였듯이 집단 간 빈번한 유전자 교류가 이루어지지만 매미꽃 집단들이 지역별로 구조화 되는 현상은 지리적 분포 패턴과 관련이 있을 것으로 추정된다.
- 조사된 8개의 집단에 대한 AMOVA 분석 결과 전체 유전변이의 약 18%가 집단 간 차이에 기인하는 것으로 설명되었고, 나머지 82%는 집단 내 개체 간에 존재하는 것으로 나타났다(Table 3).
후속연구
- 특히 우리나라 내에서도 일부지역에 제한적인 분포를 보이는 특산식물의 경우 자연적 및 인위적 요인으로 인한 멸종위험에 크게 노출되어 있어 보전생물학적으로 매우 중요한 의미를 지닌다고 할 수 있다. 따라서 희귀 및 멸종위기식물의 보전생물학적 연구를 위한 대상 종 선정 시 이러한 특산식물은 우선적으로 고려되어야 할 것이다.
- , 2010). 따라서 식물 집단의 유전적 정보들은 희귀 및 멸종위기식물에 대한 이해를 넓혀주며 향후 적절한 보전대책 수립을 위한 소중한 자료가 될 수 있다.
- 한반도 특산식물인 매미꽃 또한 이러한 종분화 과정을 통해 새로운 분류군으로 형성되어 한반도 남부지역에 제한적인 분포를 보인 것으로 추정할 수 있으며 이러한 생물종 발달 역사가 매미꽃의 낮은 유전다양성에 영향을 미친 것으로 유추 할 수 있다. 하지만 매미꽃 집단의 유전다양성을 좀 더 객관적으로 조사하기 위해서는 매미꽃의 생활사 및 수분기작 등 의 구체적인 종 생물학적 특성조사와 더불어 근연 분류군을 포함하여 다양한 마커를 이용한 추가적인 조사가 더 필요할 것으로 보인다.
- 특히 지리산 집단들과 높은 유연관계를 보인 광양 집단은 비록 호남정맥의 끝자락에 포함되기는 하지만 지리적으로 백두대간에 위치하는 지리산 집단들과 연속적인 분포 패턴을 보이는 반면 지리적 거리는 비교적 멀지 않지만 순천집단과는 고속도로나 철도 등이 지나고 있는 만큼 큰 산들이 없으며 이들 두 지역 사이에는 연속적인 분포를 보이지 않는 것으로 보아 이러한지리적 분포 특성이 매미꽃 집단의 유전자 흐름을 제한하여 유전적으로 구조화가 이루어진 것으로 추정할 수 있다. 하지만 한반도 내 매미꽃 집단의 유전적 구조 및 지리적 분화 패턴을 보다 객관적으로 파악하기 위해서는 본 조사지뿐만 아니라 더욱 다양한 집단을 포함할 필요가 있을 것으로 보이며 우성 마커와 더불어 공우성 마커를 통한 추가 분석이 요구된다고 볼 수 있다.
- , 2009). 따라서 매미꽃 역시 분포의 중심에 해당하고 비교적 풍부한 개체수와 높은 유전다양성을 유지하고 있는 지리산(산청, 하동) 집단과 백운산(광양) 집단에 대해 우선적인 현지 내(in situ) 보전전략이 수립되어야 할 것이다. 특히 지리산 집단들의 경우 대부분 자생지가 국립공원내에 위치하고 있으므로 매미꽃의 보전가치에 대한 이들 기관의 인식 제고도 필요하다.
- 이외에도 다른 집단이 가지고 있지 않는 고유의 유전 특성을 보유하고 있는 고흥집단 또한 현지 내 보전대상으로 고려되어야 할 것이다. 한편, 매미꽃 집단 유전적 공간구조에 대한 구명을 통해 효과적인 보전을 위한 집단 내 유효집단크기(effective population size)와 최소 개체수 산정도 필요할 것으로 보이며 이러한 자료를 바탕으로 적절한 수의 종자 저장 등의 현지 외(ex situ) 보전 방안도 고려해야 할 것이다.
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