GABA 함량이 높은 청국장을 발효하는 Bacillus subtilis MC 31의 청국장 품질특성을 조사하였다. B. subtilis MC 31에 의해 발효된 청국장으로부터 24개의 아미노산이 검출되었고 그 중에서도 leucine이 가장 높은 함량을 나타냈다. B. subtilis MC31에 의해 발효가 된 청국장의 미생물의 생육 변화를 조사한 결과 총 균수가 정지기에 들어서면서 log$9.52{\pm}0.5$~log $9.049{\pm}0.5$ CFU/g까지 증가하였다. 청국장의 일반성분은 수분 $61.7{\pm}0.01%$, 회분$1.52{\pm}0.01%$, 조단백 $17.66{\pm}0.04%$, 조지방 $8.96{\pm}0.03%$, 조섬유가 2.61%를 함유하였다. 암모니아태, 아미노태, 환원당은 모두 삶은 콩보다 청국장의 함량이 높게 조사되었지만 산도와 총 당은 청국장이 삶은 콩보다 함량이 낮았다. 청국장의 pH는 시간이 지날수록 알칼리화되고 점질물은 $4.7{\pm}0.05%$, protease activity는 $0.519{\pm}7.36$ g/l로 나타났으며 Fibrin plate와 Robbin실험을 통하여 fibrinolytic activity도 높음을 확인하였다. 이상의 결과로 미루어 보아 B. subtilis MC 31은 우수한 청국장 품질을 띄어 제조용 균주로 사용이 가능한 것으로 사료된다.
GABA 함량이 높은 청국장을 발효하는 Bacillus subtilis MC 31의 청국장 품질특성을 조사하였다. B. subtilis MC 31에 의해 발효된 청국장으로부터 24개의 아미노산이 검출되었고 그 중에서도 leucine이 가장 높은 함량을 나타냈다. B. subtilis MC31에 의해 발효가 된 청국장의 미생물의 생육 변화를 조사한 결과 총 균수가 정지기에 들어서면서 log $9.52{\pm}0.5$~log $9.049{\pm}0.5$ CFU/g까지 증가하였다. 청국장의 일반성분은 수분 $61.7{\pm}0.01%$, 회분 $1.52{\pm}0.01%$, 조단백 $17.66{\pm}0.04%$, 조지방 $8.96{\pm}0.03%$, 조섬유가 2.61%를 함유하였다. 암모니아태, 아미노태, 환원당은 모두 삶은 콩보다 청국장의 함량이 높게 조사되었지만 산도와 총 당은 청국장이 삶은 콩보다 함량이 낮았다. 청국장의 pH는 시간이 지날수록 알칼리화되고 점질물은 $4.7{\pm}0.05%$, protease activity는 $0.519{\pm}7.36$ g/l로 나타났으며 Fibrin plate와 Robbin실험을 통하여 fibrinolytic activity도 높음을 확인하였다. 이상의 결과로 미루어 보아 B. subtilis MC 31은 우수한 청국장 품질을 띄어 제조용 균주로 사용이 가능한 것으로 사료된다.
Chungkookjang was fermented by B. subtilis MC31, a ${\gamma}$-amino butyric acid (GABA) producing microorganism. The characteristics of Chungkookjang were investigated while fermenting. Twenty four amino acids were detected in Chungkookjang, leucine was the highest of them all. Total cell...
Chungkookjang was fermented by B. subtilis MC31, a ${\gamma}$-amino butyric acid (GABA) producing microorganism. The characteristics of Chungkookjang were investigated while fermenting. Twenty four amino acids were detected in Chungkookjang, leucine was the highest of them all. Total cell populations of B. subtilis MC31 phase were between log $9.52{\pm}0.5$ ~ log $9.049{\pm}0.5$ CFU/g at stationary phase. Contents of moisture, crude ash, crude protein, crude lipid and crude fiber are $61.07{\pm}0.01%$, $1.52{\pm}0.01%$, $17.66{\pm}0.04%$, $8.96{\pm}0.03%$ and 2.61%, respectively. Contents of ammonia type nitrogen, amino type nitrogen and reducing sugar were increased during fermentation at $40^{\circ}C$ for 72 hr, however those of titratable acidity and total sugar were decreased. pH was slowly alkalized during fermentation. Viscous substance and protease contents in Chungkookjang were $4.7{\pm}0.05%$ and $0.519{\pm}7.36$ g/l, apiece. When the fibrin plate and Robbin method for fibrinolytic activity were applied, B. subtilis MC31 showed high activity. These results suggested that B. subtilis MC31 is suitable to be used as a starter to enhance the quality of Chungkookjang.
Chungkookjang was fermented by B. subtilis MC31, a ${\gamma}$-amino butyric acid (GABA) producing microorganism. The characteristics of Chungkookjang were investigated while fermenting. Twenty four amino acids were detected in Chungkookjang, leucine was the highest of them all. Total cell populations of B. subtilis MC31 phase were between log $9.52{\pm}0.5$ ~ log $9.049{\pm}0.5$ CFU/g at stationary phase. Contents of moisture, crude ash, crude protein, crude lipid and crude fiber are $61.07{\pm}0.01%$, $1.52{\pm}0.01%$, $17.66{\pm}0.04%$, $8.96{\pm}0.03%$ and 2.61%, respectively. Contents of ammonia type nitrogen, amino type nitrogen and reducing sugar were increased during fermentation at $40^{\circ}C$ for 72 hr, however those of titratable acidity and total sugar were decreased. pH was slowly alkalized during fermentation. Viscous substance and protease contents in Chungkookjang were $4.7{\pm}0.05%$ and $0.519{\pm}7.36$ g/l, apiece. When the fibrin plate and Robbin method for fibrinolytic activity were applied, B. subtilis MC31 showed high activity. These results suggested that B. subtilis MC31 is suitable to be used as a starter to enhance the quality of Chungkookjang.
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문제 정의
최근 들어 전통식품과 다양한 생리활성 물질에 대한 새로운 인식과 관심이 되살아남에 따라 우리나라의 전통발효식품인 청국장의 소비가 급증하고 뇌・신경 전달에 우수한 GABA와 청국장 관련 발효식품들의 다양한 연구 및 새로운 제품들이 계속해서 나오고 있다. B. subtilis MC 31에 의해 발효된 청국장 의 특성 분석이 다른 발효식품의 보고에 비해 미약한 점을 고려하여 본 연구에서는 청국장을 기능성 식품으로 활용하기 위한 연구로 GABA함량이 높은 청국장을 발효하는 B. subtilis MC 31의 특성과 그 품질을 조사하였다.
이를 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 colony가 25~250 colony 사이의 plate를 계수하여 SPC법에 의해 구한 뒤 log N CFU/g으로 나타내었다. 일반성분 분석 B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 규격, 순도 검사 및 영양가를 평가하기 위하여 식품 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분을 조사하였다. 분석방법은 AOAC [2]의 방법에 따라 수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 조섬유를 사용하였다.
제안 방법
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 미생물의 생육 변화를 조사하기 위하여 72시간까지 12시간 단위로 청국장을 만들어 10 g을 멸균 증류수 90 ml가해 Clean bench에서 멸균된 시약스푼으로 파쇄하여 희석한 후 LB배지(2% Agar 포함) 에 도말 하였다. 이를 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 colony가 25~250 colony 사이의 plate를 계수하여 SPC법에 의해 구한 뒤 log N CFU/g으로 나타내었다.
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 시간 별 총산 도를 조사하기 위하여 앞의 여과액 20 ml를 pH-meter로 pH 8.3이 될 때까지 소요되는 0.1 N NaOH의 양을 측정하고 초산 양으로 환산하여 나타내었다.
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 정확한 GABA 함량과 아미노산을 조사하기 위해 최적 생육조건과 발효조건을 바탕으로 청국장을 제조하여 아미노산 분석기를 이용해 측정하였다. 간단하게 실험방법을 기술하면, 시료 100 mg을 50 ml튜브에 취하고 6 N HCl을 시료 30 mg당 5 ml씩 가해약 5분간 N2 gas를 충진한 후 뚜껑을 닫아 110℃ oven에서 24시간 동안 가수분해 시킨다.
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 총당 함량을 조사하기 위하여 Dubois [8]의 phenol-sulfuric acid법을 변형 하여 실험하였다. 청국장 분말 0.
B.subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 시간 별 pH를 조사하기 위하여 청국장 0.5 g를 8,000 rpm으로 5분간 homogenizer로 마쇄하고 증류수 50 ml를 가하여 충분히 균질화 시킨뒤 시료 액을 10,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 0.2 μm microfilter를 거쳐 나온 상징액 20 ml를 100 ml비이커에 취하여 pH-meter (pH meter pH-200L, Istek, Korea)로 측정하였다.
2 μm microfilter를 거쳐 제균을 하여 사용한다. Fibrin plate에 sample을 0.02 ml씩 점적하여 37℃에서 5시간 반응시킨 후 용해 면적으로 효소 활성을 조사하였다.
청국장 제조에 사용된 대두는 2011년 국내에서 수확되는 국산 대두를 구입하여 사용하였다. 균주는 본 연구실에서 대두를 청국장이나 된장으로 발효 시 GABA가 증가한다는 다양한 보고들을 바탕으로 청국장 발효능이 뛰어난 종균을 찾기 위해 여러 가지 청국장들로부터 발효 균주들을 분리하고, 분리된 균주들 가운데 GABA의 함량이 높은 청국장을 생산하는 실험균주 B. subtilis MC 31을 사용하였다[34]. 미생물 배양용 배지로는 Luria-Bertani media (LB)를 사용하였으며 구성시약은 Difco Lab.
일반적으로 Bacillus속의 청국장 제조 균주들은 혈전용해 활성을 갖는 것으로 보고되었으나 실제로 혈전용해활성이 전혀 없는 균주도 존재한다. 앞의 Fibrin plate 의 결과를 바탕으로 혈전용해력을 정확히 조사하기 위해 α-casein을 이용하여 plasmin unit을 측정하였다.
용해시킨 용액을 0.45 μm membrane filter로 여과하여 아미노산 자동분석기(L-8800 Amino Acid Analyzer, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.
2 μm microfilter (Pall corporation, USA)를 거쳐 여과하였다. 이 여액 1 ml에 5% phenol 1 ml와 진한 황산 5 ml를 가하여 혼합한 후 15분간 반응하여 550 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 표준용액으로는 glucose를 사용 하여 당의 양과 흡광도 사이의 표준곡선을 작성한 후 그 곡선에 따라 시료 중의 총 당을 결정하였다.
청국장은 대두15 g을 24시간 동안 초순수에 침지하여 충분히 불린 후 체로 걸러 물기를 제거한 뒤 발효용기에 넣고 호일로 감싸 autoclave로 121℃에 50분간 증자하였다. 증자된 대두는 clean bench안에서 45~50℃로 냉각한 후 Luria-Bertani (LB)배지(0.5% NaCl, 0.5% Yeast extract, 1% Tryptone)에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 2% 접종하여 37℃에서 72시간 동안 발효 시켜 제조하였다.
2 여과지로 여과 후 MgO 200 mg을 가해 시료액으로 사용했다. 켈달 자동 적정기(FOSS 2200 system, Japan)를 이용하여 적정분석 하였다.
표준용액으로는 L-tyrosine을 사용하여 당의 양과 흡광도 사이의 표준곡선을 작성한 후 그 곡선에 따라 시료중의 protease량을 1unit을 기질 1 ml 당 생성된 tyrosine의 μg 수로 계산하였다.
5 g, Rochlle salt 200 g을 순서대로 증류수에 녹인 후 1,000 ml로 맞춘 후 암소에 저장하면서 사용하였다. 표준용액으로는 glucose를 사용하여 당의 양과 흡광도 사이의 표준곡선을 작성한 후 그 곡선에따라 시료중의 환원당을 결정하였다.
대상 데이터
subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 암모니아태 함량을 조사하기 위하여 Kjeldahl 방법으로 측정하였다. 삼각플라스크에 동결건조 시킨 청국장 분말 1 g을 채취 후 10% KCl용액을 100 ml가하여 1시간 진탕 침출한 뒤 Whatman filter paper No.2 여과지로 여과 후 MgO 200 mg을 가해 시료액으로 사용했다. 켈달 자동 적정기(FOSS 2200 system, Japan)를 이용하여 적정분석 하였다.
(Detroit, MI, USA)사의 제품을 사용하였다. 실험에 사용한 시약들은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA), Junsei Co. (Tokyo, Japan), 그리고 Yakuri Co. (Kyoto, Japan)의 제품을 구입하여 사용하였다.
청국장 제조에 사용된 대두는 2011년 국내에서 수확되는 국산 대두를 구입하여 사용하였다. 균주는 본 연구실에서 대두를 청국장이나 된장으로 발효 시 GABA가 증가한다는 다양한 보고들을 바탕으로 청국장 발효능이 뛰어난 종균을 찾기 위해 여러 가지 청국장들로부터 발효 균주들을 분리하고, 분리된 균주들 가운데 GABA의 함량이 높은 청국장을 생산하는 실험균주 B.
이론/모형
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 아미노태 함량을 조사하기 위하여 Formal적정법으로 측정하였다[22]. 청국장 분말 0.
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 암모니아태 함량을 조사하기 위하여 Kjeldahl 방법으로 측정하였다. 삼각플라스크에 동결건조 시킨 청국장 분말 1 g을 채취 후 10% KCl용액을 100 ml가하여 1시간 진탕 침출한 뒤 Whatman filter paper No.
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 환원당 함량을 조사하기 위하여 Park [36]의 방법에 따라 실험하였다. 청국장 분말 1 g에 증류수 200 ml로 맞춘 다음 30℃에서 120 rpm으로 2시간 교반한 후 10% TCA (v/v in water)를 0.
B. subtilis MC 31의 fibrinolytic activity를 측정하기 위하여 B. subtilis MC 31을 37℃, 24시간 배양한 배양액의 혈전용해능을 fibrin plate법을 이용하여 lysed saline의 반경을 측정하였다[3]. 0.
B. subtilis MC 31의 fibrinolytic activity를 측정하기 위하여α-casein을 이용한 plasmin unit을 측정하는 Robbin방법을 사용하였다[20].
subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 규격, 순도 검사 및 영양가를 평가하기 위하여 식품 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분을 조사하였다. 분석방법은 AOAC [2]의 방법에 따라 수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 조섬유를 사용하였다. 즉 수분은 105~110℃ 상압가열건조법, 조회분은 600℃의 전기로에서 회화시키는 직접 회화법, 조단백질은 kjedahl법, 조지방 분석은 Soxhlet추출법, 조섬유는 산, 알칼리 분해법을 사용하여 측정하였다.
분석방법은 AOAC [2]의 방법에 따라 수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 조섬유를 사용하였다. 즉 수분은 105~110℃ 상압가열건조법, 조회분은 600℃의 전기로에서 회화시키는 직접 회화법, 조단백질은 kjedahl법, 조지방 분석은 Soxhlet추출법, 조섬유는 산, 알칼리 분해법을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
B. subtilis MC 31로 발효한 청국장의 총당 함량의 변화는 삶은 콩이 17.55±0.52%에서 발효가 진행되어 72시간에는 11.74±0.2 %로 감소하였다(Table 3).
03 mg%로 전환이된 것으로 보아 본 연구의 결과보다 함량과 전환률이 낮았지만 유의적인 차이는 없는 것으로 보인다. B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 아미노태질소와 암모니아태 질소를 비교하여 증가 패턴이 유사한 것으로 보아 청국장 발효 시 시간이 경과함에 따라 구수한 맛의 증가와 함께 청국장의 암모니아취가 동시에 증가하는 것을 보여주는 것으로서 나타났다. Hwang 등[10]의 보고에서 발효기간 중 주로 미생물이 분비하는 protease가 원료 대두의 단백질에 작용하여 수용성 질소형태로 가수분해 되고 이어서 peptide를 거쳐 아미노태 질소 형태로 가수분해하여 청국장의 구수한 맛이 생성됨과 동시에 발효가 계속 진행되면서 암모니아태 질소를 형성시킨다고 하였다.
B. subtilis MC 31의 protease activity를 확인한 결과 519±7.36 unit의 함량을 보였다.
B. subtilis MC31로 발효한 청국장의 환원당 함량의 변화는 삶은 콩 1.48±0.03%에서 발효가 진행되어 72시간에는 5.15±0.07%로 3.5배 증가하였다(Table 3).
Fibrin plate방법에서 혈전용해활성이 나타난 B. subtilis MC 31의 함량을 알기 위하여 α-casein을 이용하여 plasmin unit을 측정한 결과 B. subtilis MC 31의 혈전용해효소가 1시간 동안 TCA-soluble tyrosine 0.45 ml를 32.046±0.07 PCU/ml 유리하는 것으로 나타났다.
GABA생성의 전구체인 glutamic acid의 함량은 57.33±0.23 mg%이였고, GABA의 함량은 삶은 콩 함량 보다 발효가 진행되어 20±0.01 mg%까지 증가하였다.
배양 시간 별 청국장의 pH를 측정한 결과 0시간에 pH 6.4±0.1에서 시작하여 36시간까지 지속적으로 증가하다 이후에는 pH 7.01±0.08~pH 7.02±0.08사이로 큰 변화 없이 72시간까지 일정하게 나타났다(Fig. 3A). 발효 후 청국장의 pH는 Baek 등[6]의 연구 결과와 같이 발효 전에 비해 시간이 지남에 따라 증가하였고 Kim 등[21]이 보고한 우리나라 전통 청국장의 평균 pH값인 7.
배양 시간 별 청국장의 산도를 측정한 결과 0시간에서 0.17%에서 시작하여 36시간까지 지속적으로 감소하다 이후에는 0.09±0.02%~0.1 0.02% 사이로 큰 변화 없이 72시간까지 일정하게 나타났다(Fig. 3B). 발효 후 청국장의 산도는 Jung 등[15]의 보고에 비해 산도가 낮은 편이였으나 시간이 지남에 따라 감소하다 다시 증가하는 패턴이 유사하였다.
암모니아태 질소의 과잉 생산은 청국장 냄새에 영향을 미쳐 소비기피를 유발하는 중요한 물질로 알려져 있기 때문에 본 연구에서도 이러한 영향을 확인하기 위하여 청국장 발효과정 중 암모니아태 질소 함량을 조사한 결과 Table 4과같이 삶은 콩이 63.4±0.3 mg%에서 발효가 진행됨에 따라 72시간에는 238.74±0.18 mg%로 4배 증가하였다.
청국장 발효 과정 중 B. subtilis MC 31의 생육 변화는 0시간에 log 4.5±0.31 CFU/g로 시작하여 발효가 진행됨에 따라 급격히 증가하여 12시간에 log 8.1±0.41 CFU/g를 나타내었으며, 24시간에는 log 9.6±0.11 CFU/g, 36시간에는 log 9.92±0.13 CFU/g까지 계속해서 증가하는 모습을 보였지만, 36시간 이후에서 72시간까지 log 9.52±0.5~log 9.049±0.5 CFU/g로 약간의 감소하는 패턴을 보였다(Fig. 1).
청국장 발효과정 중 아미노태 질소 함량을 조사한 결과 삶은콩 23.87±0.13 mg%에서 발효가 진행되어 72시간에는 449.25±0.21 mg%로 급격히 증가하여 B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 아미노태 질소 함량이 식품공전의 규격을 만족시켰다(Table 4).
청국장에 혈전용해효소가 존재한다는 보고[14]들을 바탕으로 B. subtilis MC 31의 혈전용해능을 측정해본 결과 혈전용해 활성을 보였다(Fig. 2).
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