[논문]전통 청국장의 발효 기간 동안 변화하는 수용성 단백질 개요

아일린산토스; 손일영; 최현수; 박선민; 유성희; 권대영; 박천석; 김정환; 김정상; 임진규

전통 청국장의 발효 기간 동안 변화하는 수용성 단백질 개요
Changes of Protein Profiles in Cheonggukjang during the Fermentation Period 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.39 no.4 = no.194, 2007년, pp.438 - 446

아일린산토스 (경북대학교 동물공학과) , 손일영 (경북대학교 동물공학과) , 최현수 (경북대학교 동물공학과) , 박선민 (경북대학교 동물공학과) , 유성희 (경북대학교 동물공학과) , 권대영 (한국식품연구원) , 박천석 (경희대학교 식품생명공학과) , 김정환 (경상대학교 식품공학과) , 김정상 (경북대학교 동물공학과) , 임진규 (경북대학교 동물공학과)

초록
AI-Helper

콩 발효식품인 청국장은 어느 정도는 그 기능성 때문에 많은 사람들이 선호하고 있다. 청국장의 발효 과정은 발효미생물이 분비하는 단백질 분해 효소를 포함하는 여러 효소들에 의해 이루어지기 때문에 발효기간 동안 청국장의 단백질체 분석은 발효의 최적화를 이루기 위해서 그리고 청국장에 생성되는 기능성물질 생성 과정을 이해하는 데 도움이 된다. 청국장의 수용성 단백질을 phenol/chloroform 추출 방법으로 분리하여 2-D gel 분석에 방해되는 물질들을 제거하였다. 각 발효 단계에서 단백질 분석을 하였을 때 20시간 안에 대부분의 단백질들이 작은 분자로 분해되었고 수용성 단백질에는 미생물 유래 단백질들이 점차 증가하였다. 청국장의 단백질 프로파일은 natto의 것과는 매우 다른 양상을 2-D gel 상에서 보였다. 각 gel에서 50개의 단백질을 임의로 선발하여 MALDI-TOF MS 분석을 하고 PMF로 단백질을 동정하였다. 결과는 콩이나 발효 미생물들의 유전체 정보가 부족하여 청국장에서 9종 natto에서 15종의 단백질만을 동정할 수 있었다. MS/MS 분석을 통한 아미노산 서열 분석을 통해 얻은 정보를 가지고 BLASTP 검색엔진으로 database를 검색한 결과 제한된 수의 단백질이 낮은 신뢰도 범위에서 동정되었다. 그렇지만 청국장과 같이 복잡한 단백질체를 분석하기에는 본 연구에서 고안한 전체 단백질 분리 기술과 2-D gel 분석적 접근은 단백질을 전체적으로 분석함에 있어 훌륭한 방법이다. 앞으로 청국장의 단백질 변화에 대한 연구는 의미 있는 변화를 보이는 소수의 단백질을 선발하고 이들에 대해 집중적으로 질량분석 하여 단백질을 동정하는 것이 필요하다.

Abstract ▼ AI-Helper

The fermented soybean product, cheonggukjang, is favored by many people, partly due to its bio-functional ingredients. Since the fermentation process of cheonggukjang is mediated by enzymes, including proteases, produced by microbes, analysis of the proteome profile changes in cheonggukjang during fermentation would provide us with valuable information for fermentation optimization, as well as a better understanding of the formation mechanisms of the bio-functional substances. The soluble proteins from cheonggukjang were prepared by a phenol/chloroform extraction method, in order to remove interfering molecules for high resolution 2-D gel analysis. Proteomic analysis of the cheonggukjang different fermentation periods suggested that most of the soluble soy proteins were degraded into smaller forms within 20hr, and many microbial proteins, such as mucilage proteins, dominated the soluble protein fraction. The proteomic profile of cheonggukjang was very different from natto, in terms of the 2-D gel protein profile. Among the separated protein spots on the 2-D gels, 50 proteins from each gel were analyzed by MALDI-TOF MS and PMF for protein identification. Due to database limitations with regard to soy proteins and microbial proteins, identification of the changed proteins during fermentation was restricted to 9 proteins for cheonggukjang and 15 for natto. From de novo sequencing of the proteins by a tandem MS/MS, as well as by database searches using BLASTP, a limited number of proteins were identified with low reliability. However, the 2-D gel analysis of proteins, including protein preparation methods, remains a valuable tool to analyze complex mixtures of proteins entirely. Also, for intensive mass spectrometric analysis, it is also advisable to focus on a few of the interestingly changed proteins in cheonggukjang.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

sp.를콩에 접종하여 청국장을 만드는 통제된 조건인 반면 순창지역의 전통적 발효제조 방법에 의해 생산되는 청국장의 수용성 단백질의 변화를 2-D gel로 분리하여 단백질 발현의 proRle변화를 분석하고 변화된 단백질을 proteomics 방법으로 동정함으로써 우리의 전통 식품인 청국장 발효의 최적화와 기능성 식품으로서 기능성 물질들이 형성되는 과정을 보다 과학적으로 설명하고 청국장 발효 시 생성되는 생리활성물질의 변화와 상관관계가 있는 단백질들을 선발하는데 활용될 수 있는 정보를 얻고자 발효과정 중 변화하는 수용성 단백질들의 총체적 분석을 시도하였다.
발효가 완료된 전통 청국장에서 추출한 수용성 단백질을 이차원 전기영동이 가능한 시료로 만들기 위해 다양한 방법을 시도하였다. 일반적으로 사용되는 desalting column을 이용한 desalting, 10% TCA 침전을 이용한 desalting, phenol 층 추출과 ammonium acetate를 이용한 침전 후 침전물을 다시 10% TCA로 침전시켜 salt를 제거하는 방법들을 시도하여 최종적으로 phenol 추출법에서 얻은 단백질 시료가 이차원 전기영동에서 가장 좋은 분해 능력을 보였기 때문에(data not shown) 본 실험에서는 이 방법으로 실험을 진행하였다.
본 연구에서는 전통 청국장에 들어있는 기능성 물질에 대한 탐색을 위한 기초적 연구로써 단백질을 분석하였기 때문에 발효 과정 중에서 변화를 보이는 수용성 단백질에 관심을 갖고 실험을 진행하였다. 청국장으로부터 추출한 수용성 단백질 중에는 이론적으로 미생물이 생산한 단백질과 단백질 분해 효소에 의해 변형된 콩 단백질 그리고 발효과정 중 수용성이 증가한 콩 단백질 등이 있다.
또 다른 방법으로, 단백질을 MS/ MS 분석을 통해 de novo sequencing하고 얻어진 아미노산의 서열을 가지고 BLASTP와 같은 단백질 검색 엔진을 이용하여 단백질을 동정하는 것이다. 본 연구에서도 청국장과 natto의 수용성 단백질을 일차원 전기영동으로 분리하고 단백질 band에서 peptide를 얻어 MS/MS로 de novo sequencing하여 단백질을 동정하고자 하였는데 여전히 80% 정도의 아미노산 서열의 일치를 보이는 수준에서 제한된 단백질의 동정을 할 수 있었다(Fig. 4, Table 3). 이 결과는 청국장의 콩 재료가 일반적으로 알려진 콩과 유전적으로 상이하거나, 전통 청국장은 자연발효 산물이므로 미생물의 종류가 다양하기 때문에 미생물 유래 단백질도 proteomics에 의한 분석이 용이하지 않은 것으로 판단된다.

가설 설정

등을 고려한 청국장 제조에 관한 연구 및 ii) 청국장 발효 동안 생성되는 생리활성물질의 분리 및 동정이다. 생리활성물질 분리 및 동정에 관한 연구로는 혈전 용해능(3-5), 항산화능(6), 항고혈압 활성(7), 항미생물 활성(8), 플라보노이드 활성(9) 및 그 외에 가능한 활성들을 찾는 연구들이 진행되고 있다.

제안 방법

1% v/v TFA, 2% w/v ammonium citrate)에 1:1 로 섞어 주고 MMMDI용 시료 판에 시료 당 1㎕씩 점적하고 말렸다. DE-STR MALDI-TOF(Applied Biosystem, Framingham, MA, USA) 와 MALDI-TOF-TOF(Applied Biosystem)를 이용하여 MS 및 MS/ MS data를 얻었다. MS survey scanning에서 MS/MS로 옮겨진 m/z 800-3000 영역의 peak를 argon 가스와 충돌시켜 collision-induced dissociation(CID) MS/MS data를 얻었다.
5% w/v iodoacetamide, 소량의 bromophenol blue)에서 15분 반응 시켰다. IPG strip을 12% polyacrylamide gel(8 x 6 cm) 위에 놓고 0.5% agarose로 엎은 뒤 120Y 15℃에서 bromophenol blue가 gel의 끝 부분에 도달 할 때까지 전기영동을 진행하였다. 전기영동 후에는 gel을 CBB로 염색하고 UMAX Powerlook 1100 scannere.
MALDI-TOF MS와 MS/MS 분석을 위해 시료를 matrix 용액 (5 mg/mL Alpha<yano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)/50% ACN, 0.1% v/v TFA, 2% w/v ammonium citrate)에 1:1 로 섞어 주고 MMMDI용 시료 판에 시료 당 1㎕씩 점적하고 말렸다. DE-STR MALDI-TOF(Applied Biosystem, Framingham, MA, USA) 와 MALDI-TOF-TOF(Applied Biosystem)를 이용하여 MS 및 MS/ MS data를 얻었다.
DE-STR MALDI-TOF(Applied Biosystem, Framingham, MA, USA) 와 MALDI-TOF-TOF(Applied Biosystem)를 이용하여 MS 및 MS/ MS data를 얻었다. MS survey scanning에서 MS/MS로 옮겨진 m/z 800-3000 영역의 peak를 argon 가스와 충돌시켜 collision-induced dissociation(CID) MS/MS data를 얻었다. Ms-Fit(http://prospector.
전기영동이 끝나면 gel에 분리된 단백질 bands를 coomassie brilliant blue(CBB) 로 염색하고 UMAX Powerlook 1100 scannerfUMAX Technologies, Dallas, TX, USA)로 image를 얻었다. 이차원 전기영동은 rehydration bufier0)] 녹아 있는 시료 400 g°] 120 L rehydration buffer0!] 녹아 있도록 하여 Immobilized pH gradient(IPG) strip(7 cm, pH 3-10, 또는 pH 4-7 nonlinear, BioRad)에 넣고 IEF-Cell(BioRM)에서 일차원 전기영동 isoelectric fSusing(IEF)를 진행하였다: 수동적 또는 능동적으로 50V에서 12 시간 동안 rehydration, 250V에서 2시간, 500V에서 1시간 ramping, 4000V에서 6시간 fbcusing하였다. IEF 후에는 IPG strip을 equilibration buffer 1(50mM Tris-HCl, pH 8.
전기영동 후에는 gel을 CBB로 염색하고 UMAX Powerlook 1100 scannere. gel의 image를 얻고 gel image를 PDQUEST(BioRad) 이미지 분석 프로그램으로 보내서 gel 간의 단백질 변화를 비교하였다.
청국장의 단백질 프로파일은 natto의 것과는 매우 다른 양상을 2-D gel 상에서 보였다. 각 gel에서 50개의 단백질을 임의로 선발하여 MALDI-TOF MS 분석을 하고 PMF로 단백질을 동정하였다. 결과는 콩이나 발효 미생물들의 유전체 정보가 부족하여 청국장에서 9종 natto에서 15종의 단백질만을 동정할 수 있었다.
com) 을 이용하여 peptide mass fingerprinting(PMF)^}- peptide sequence 를 찾았다. 검색 변수로는 methionine의 산화, cysteine의 carbam- idomethylation, 불완전한 tiypsin 분해를 고려하여 SWISS-PROT와 NCBI protein databases를 검색하였다.
4). 더 세밀한 분석을 위해 pH 영역이 3- 10인 IEF gel과(Fig. 1) pH 영역이 4-7인 gel을 사용하여 단백질 분리 profile을 비교하였다(Fig. 3). 대부분의 단백질이 pH 7이하의 산성영역에 위치하였으며 발효 전의 수용성 콩 단백질은 분자량 40 kDa 이하의 크기가 주를 이룬 반면 발효가 완료된 청국장에서는 40 kDa 이하의 단백질은 단백질 분해효소에 의해 분해가 일어나고 40-80kDa 정도 크기의 단백질이 주종을 이루었다.
순창에서 생산된 한국산 백태를 20/ 의 물에 18시간 담가두었다가 12TC에서 15분 간 멸균하고 42℃ 에서 43-45시간 동안 청국장 생산 발효실에서 발효 시키면서 자 , 연 종균 접종이 되도록 하였다. 발효가 진행되는 동안 일정 시간 간격으로 6개의 발효 상자에서 각각 200 g 정도의 시료를 채취 : 하여 섞은 다음 50g의 시료를 따로 채취하여 수용성 단백질 추 ; 줄을 진행하였다.
순창 지역의 전통 청국장의 발효기간 동안의 단백질 변화와 발효가 완료된 제품의 수용성 단백질들을 분석하기 위해 각 단계에서 채취한 시료 50g씩을 protease 저해제가 들어있는 O.lx PBS 100mL에 넣고 1시간 동안 얼음위에서 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 먼저 12%와 18% SDS-PAGE로 분석하여 단백질의 변화를 보았다.
따라 제조하였다. 순창에서 생산된 한국산 백태를 20/ 의 물에 18시간 담가두었다가 12TC에서 15분 간 멸균하고 42℃ 에서 43-45시간 동안 청국장 생산 발효실에서 발효 시키면서 자 , 연 종균 접종이 되도록 하였다. 발효가 진행되는 동안 일정 시간 간격으로 6개의 발효 상자에서 각각 200 g 정도의 시료를 채취 : 하여 섞은 다음 50g의 시료를 따로 채취하여 수용성 단백질 추 ; 줄을 진행하였다.
시료 50 g에 protease inhibitor(Roche, Indianapolis, IN, USA) 가들어 있는 0.1 x phosphate buffered saline(PBS) lOOmL을 가하여 0»C에서 서서히 교반하며 수용성 단백질을 추출하였다. 부유물과 고형물을 10분 간 저속원심분리(500g)로 제거하고 다시 30분 간 4。(2에서 20, 000g로 고속원심분리 하여 고형물을 제거한 뒤# 여과막을 통과 시켰다.
1 x PBS 100 mL에 넣어 1시간 얼음 위에서 교반함으로써 수용성이 높은 단백질을 얻었다. 이렇게 얻은 단백질은 전기영동시에 분리가 잘 일어나지 않는 문제를 일으키므로 방해 물질을 제거하기 위해 단백질을 10% TCA로 침전시키고 100% 에탄올로 3회 닦아주어 방해 물질을 제거하고 일차원 전기영동을 하였다. 이러한 노력에도 불구하고 이차원 전기영동에서는 반복성이 있고 분해능력이 높은 gel을 얻기가 어려웠다.
1 mg trypsin(sequencing grade; Promega, Madison, WI, USA)이 든 용액으로 수화시키고 37℃에서 16 시간 이상 반응시켰다. 이렇게 해서 만들어진 peptide# 얻기 위해 50gL 50% ACN/5% tri-fluoroacetic acid(TFA)로 2회 추출하였다. 얻어진 peptide용액을 SpeedVac 농축기로건조하고 10 gL 0.
염분 및 방해성분을 제거해야만 한다. 이를 위하여 10% TCA 를 처리하여 단백질을 침전시키고 침전된 단백질을 원심분리로 모아 100% 알코올로 3-4회 닦아 주었다. 염분이 제거된 시료일지라도 여전히 일차원 전기영동을 저해하는 물질이 남아 있어 반복적인 전기영동 결과를 얻는데 어려움이 있었다.
단백질을 농축시키기 위해 동결건조 장치로 시료를 건조시키고 10mL의 초순수 물에 녹여 단백질을 10배 농축하였다. 이차원 전기영동을 위해 시료에 들어 있는 염분 및 전기영동 저해물질을 제거하기 위해 Natarean 등(29) 의 방법을 변형하여 사용하였다. 단백질을 0.
전기영동이 가능한 시료로 만들기 위해 다양한 방법을 시도하였다. 일반적으로 사용되는 desalting column을 이용한 desalting, 10% TCA 침전을 이용한 desalting, phenol 층 추출과 ammonium acetate를 이용한 침전 후 침전물을 다시 10% TCA로 침전시켜 salt를 제거하는 방법들을 시도하여 최종적으로 phenol 추출법에서 얻은 단백질 시료가 이차원 전기영동에서 가장 좋은 분해 능력을 보였기 때문에(data not shown) 본 실험에서는 이 방법으로 실험을 진행하였다.
5%(v/v) ampholyte [pH 3-10])에 녹였다. 일차원 전기영동을 위해서 단백질 분말을 sodium dodecylsulfate-polyaciylamide (SDS-PAGE)용 sample buffer(0.05 M Tris-HCl [pH 6.8], 10% glycerol, 0.2% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue)에 녹이고 95, C에서 10분간 가열하였다.
질량분석기와 2-D gel 전기영동을 이용한 단백질체의 발전은 오늘날의 단백질 분석의 개념을 바꾸어 놓았다. 2-D gel 상에 분리된 단백질들을 개별적으로 잘라내고 trypsin과 같은 단백질 분해효소로 분해하여 얻은 peptide를 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight(MALDI-TOF) 질량분석기로 분석하여 정확한 질량을 측정하거나, 각 peptide들을 연속질량분석기로 분해하여 얻은 product ions의 질량 값 profile을 얻어서 이것 들과 컴퓨터가 단백질 또는 유전자 database로부터 계산하여 얻은 이론값과 비교하여 각 단백질을 동정할 수 있기 때문에 빠른 시간 안에 다수의 단백질을 분석할 수 있다(26).
청국장의 발효 과정은 발효미생물이 분비하는 단백질 분해 효소를 포함하는 여러 효소들에 의해 이루어지기 때문에 발효기간 동안 청국장의 단백질체 분석은 발효의 최적화를 이루기 위해서 그리고 청국장에 생성되는 기능성 물질생성 과정을 이해하는데 도움이 된다. 청국장의 수용성 단백질을 phenol/chloroform 추출 방법으로 분리하여 2-D gel 분석에 방해하는 물질들을 제거하였다. 각 발효 단계에서 단백질 분석을 하였을 때 20시간 안에 대부분의 단백질들이 작은 분자로 분해되었고 수용성 단백질에는 미생물 유래 단백질들이 점차 증가하였다.
lx PBS 100mL에 넣고 1시간 동안 얼음위에서 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 먼저 12%와 18% SDS-PAGE로 분석하여 단백질의 변화를 보았다. Fig.
-2CTC에서 밤새 침전시켰다. 침전물을 20, 000 g로 원심분리 하여 모으고 100% 에탄올로 3회, 70% 에탄올로 1회 닦아 준 다음 동결건조기로 건조시켰다. 건조된 단백질 분말을 이차원 전기영동을 위한 rehydration bufifer(8 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 0.
콩 단백질의 database가 충분치 못함으로 tandem MS/MS 방법으로 de novo sequencing을 하여 얻은 아미노산 서열을 가지고 NCBI나 SWISSPROT에 있는 단백질 d* atabase BLASTP 검색엔진으로 단백질을 동정하는 방법을 사용하기 위해 먼저 청국장과 natto에서 추출한 수용성 단백질을 8-18% 농도구배 SDS-PAGE gel에서 분리하고(Fig. 4) gel을 10등분하여 각 gel 조각에 들어 있는 단백질을 trypsin으로 분해하여 얻은 peptide의 amino acid 서열을 질량분석방법으로 조사하였다(Table 3). 전통 청국장의 발효 과정에 관여하는 미생물 군이 다양하고 사용하는 콩의 품종이 다른 점 등을 고려할 때 database의 결핍으로 콩 단백질의 확인은 어려웠지만 database에서 확인 되는 식물이나 미생물의 단백질과 80% 이상의 서열일치를 나타낸 것을 가능성 있는 단백질로 정하였다.

이론/모형

MS survey scanning에서 MS/MS로 옮겨진 m/z 800-3000 영역의 peak를 argon 가스와 충돌시켜 collision-induced dissociation(CID) MS/MS data를 얻었다. Ms-Fit(http://prospector. ucsfedu/prospector/) 및 MASCOT(http://www.matrixscience.com) 을 이용하여 peptide mass fingerprinting(PMF)^}- peptide sequence 를 찾았다. 검색 변수로는 methionine의 산화, cysteine의 carbam- idomethylation, 불완전한 tiypsin 분해를 고려하여 SWISS-PROT와 NCBI protein databases를 검색하였다.
3). 이차원 전기영동 gel 상에 나타난 단백질들을 임의로 50개 선발하여 trypsin으로 분해하고 추출한 peptides를 MALDI-TOF MS로 질량 값을 정확히 얻어 MS- Fite ( http://prospector.ucsf.edu/prospector/ ) Mascot(http://www. matrixscience.com/ ) 탐색기능을 이용하여 databases를 검색하는 peptide mass fingerprinting(PMF) 방법으로 단백질을 동정하였으나 콩의 유전체 정보가 충분치 않은 이유로 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 없었지만 유사 단백질들에 대한 정보를 얻게 되었다(Table 1).
청국장은 Ahn 등(17)의 방법에 따라 순창지역 전통 청국장 제조 방법에 따라 제조하였다. 순창에서 생산된 한국산 백태를 20/ 의 물에 18시간 담가두었다가 12TC에서 15분 간 멸균하고 42℃ 에서 43-45시간 동안 청국장 생산 발효실에서 발효 시키면서 자 , 연 종균 접종이 되도록 하였다.

성능/효과

대부분의 단백질이 pH 7이하의 산성영역에 위치하였으며 발효 전의 수용성 콩 단백질은 분자량 40 kDa 이하의 크기가 주를 이룬 반면 발효가 완료된 청국장에서는 40 kDa 이하의 단백질은 단백질 분해효소에 의해 분해가 일어나고 40-80kDa 정도 크기의 단백질이 주종을 이루었다. 43시간 발효 후 추출한 수용성 단백질들 중 상당수가 당 단백질 특유의 구슬을 나열한 듯 한 배열을 나타내는 것으로 미루어 볼 때 콩에서 유래한 당 단백질일 가능성이 높음을 보였다 (Fig. 3). 그 외에 새로 나타나는 단백질들은 미생물 유래 또는 미생물이 분비한 단백질 분해효소에 의해 절단된 단백질 단편으로 나타난 것으로 추정하였다(Fig.
추출된 단백질을 먼저 12%와 18% SDS-PAGE로 분석하여 단백질의 변화를 보았다. Fig. 1에서와 같이 발효시간 30시간이 경과하면 단백질 profile상으로는 큰 변화를 보이지 않는 것이 관찰되었고 발효가 완료된 청국장에는 대부분의 수용성 단백질은 분자량 10 kDa이하의 작은 peptide로 분해되었으나 일부 단백질은 발효가 진행되어도 분해가 잘되지 않는 성질이 있음을 보였다.
결과는 콩이나 발효 미생물들의 유전체 정보가 부족하여 청국장에서 9종 natto에서 15종의 단백질만을 동정할 수 있었다. MS/MS 분석을 통한 아미노산 서열 분석을 통해 얻은 정보를 가지고 BLASTP 검색엔진으로 d* atabase 검색한 결과 제한된 수의 단백질이 낮은 신뢰도 범위에서 동정되었다. 그렇지만 청국장과 같이 복잡한 단백질체를 분석하기에는 본 연구에서 고안한 전체 단백질 분리 기술과 2-D gel 분석적 접근은 단백질을 전체적으로 분석함에 있어 훌륭한 방법이다.
각 gel에서 50개의 단백질을 임의로 선발하여 MALDI-TOF MS 분석을 하고 PMF로 단백질을 동정하였다. 결과는 콩이나 발효 미생물들의 유전체 정보가 부족하여 청국장에서 9종 natto에서 15종의 단백질만을 동정할 수 있었다. MS/MS 분석을 통한 아미노산 서열 분석을 통해 얻은 정보를 가지고 BLASTP 검색엔진으로 d* atabase 검색한 결과 제한된 수의 단백질이 낮은 신뢰도 범위에서 동정되었다.
최대 44개의 단백질을 동정하였다. 그 결과 주로 밝혀진 단백질들은 glycinin류의 단백질이 전체의 기5를 차지하였고, sucrose binding protein(14%), hypothetical proteins(12%) 등으로 나타나 콩의 주성분 단백질을 위주로 단백질이 밝혀지거나 아직 기능이 잘 밝혀져 있지 않은 단백질로 나타났다. 그러나 본 연구에서는 콩 및 청국장의 수용성 단백질을 분리하여 분석하였기 때문에 기존의 결과와는 다른 양상을 보이고 있다.
MS/MS 분석을 통한 아미노산 서열 분석을 통해 얻은 정보를 가지고 BLASTP 검색엔진으로 d* atabase 검색한 결과 제한된 수의 단백질이 낮은 신뢰도 범위에서 동정되었다. 그렇지만 청국장과 같이 복잡한 단백질체를 분석하기에는 본 연구에서 고안한 전체 단백질 분리 기술과 2-D gel 분석적 접근은 단백질을 전체적으로 분석함에 있어 훌륭한 방법이다. 앞으로 청국장의 단백질 변화에 대한 연구는 의미 있는 변화를 보이는 소수의 단백질을 선발하고 이들에 대해 집중적으로 질량분석하여 단백질을 동정하는 것이 필요하다.
청국장과 natto에서 볼 수 있듯이 확인 된 단백질 중 YuaB, morphogenic protein 과 같은 포장 형성 단백질이 검출되는 것으로 보아 발효가 완료된 청국장에는 Bacilhis의포자형성이 진행되고 있거나 포자를 형성하고 있음을 보인다. 또한 alkaline serine protease, extracellular protease와 같은 단백질 분해효소가 검출되어 발효가 완료된 후에도 지속적으로 단백질 분해가 진행됨을 보이고 있다. 전통 청국장과 natto를 단백질 적측 면에서 생화학적으로 비교하여 우열을 가리는 데는 무리가 있지만 natto는 단일 균주를 사용하기 때문에 불쾌취를 줄일 수 있고 외형상으로도 mucilage를 많이 생성하여 소비자의 선호를 이끌어 내는 데 유리한 점이 있다.
본 연구에서 선발한 50개의 단백질 시료를 PMF로 분석한 결과 data의 신뢰를 나타내는 score가 낮게 나왔으며, 동정된 단백질들의 공통적인 특징은 발견할 수 없었다. 전통 청국장 에서는 9개의 단백질이 동정되었는데 그 중 미생물 유래 단백질은 6개, 식물유래 단백질은 3개였다(Table 1).
이러한 노력에도 불구하고 이차원 전기영동에서는 반복성이 있고 분해능력이 높은 gel을 얻기가 어려웠다. 이 결과는 콩 단백질에 이차원 전기영동을 방해하는 물질이 많이 있음을 의미하는데 이러한 물질을 제거하기 위해 phenol로 시료를 추출하여 방해 물질을 없애고 phenol 층에 녹아 있는 단백질을 침전하여 단백질을 얻은 결과 성공적인 이차원 전기영동을 할 수 있었다(Fig. 1).
전통 청국장의 2-D gel 상의 수용성 단백질 profile과 단일 균주인 Bacillus s* ubtil 나 Bacillus nattc를 사용한 nattoe\ 수용성 단백질의 profile을 비교하기 위해 같은 방법으로 단백질을 분석했을 때 단백질 중 다수가 8acillus균에서 유래한 단백질임이 밝혀졌다(Table 2).
청국장과 natto에서 공통적으로 발견되는 단백질은 Bacillus 유래의 YqgD 유전자가 만드는 단백질인데 아미노산 226개로 이루어져 있으며 superoxide dismutase 기능을 갖는 domain을 갖고 있으면서 Bacilluse 포자형성에 관여하는 유전자 군에 속한다(30). 청국장과 natto에서 볼 수 있듯이 확인 된 단백질 중 YuaB, morphogenic protein 과 같은 포장 형성 단백질이 검출되는 것으로 보아 발효가 완료된 청국장에는 Bacilhis의포자형성이 진행되고 있거나 포자를 형성하고 있음을 보인다. 또한 alkaline serine protease, extracellular protease와 같은 단백질 분해효소가 검출되어 발효가 완료된 후에도 지속적으로 단백질 분해가 진행됨을 보이고 있다.

후속연구

이 한계를 극복하기 위하여 Mooney와 Thelen(28)은 콩의 EST database로부터 contig를 만들어서 분석하는 단백질을 동정하고자 했으나 콩의 주종을 이루는 제한된 단백질을 동정하는 수준의 결과를 얻었다. 그러나 EST database는 계속 늘어나고 있으며 sequence의 정확도가 보장된다면 proteomics 를 이용한 콩 단백질체의 분석은 더 신뢰할 수 있고 확장된 범위로 진행 될 수 있을 것이다. 또 다른 방법으로, 단백질을 MS/ MS 분석을 통해 de novo sequencing하고 얻어진 아미노산의 서열을 가지고 BLASTP와 같은 단백질 검색 엔진을 이용하여 단백질을 동정하는 것이다.
순창 지역의 전통 청국장 발효는 자연발효 조건을 이용하고 있는데 이 발효조건의 최적화라는 측면에서도 단백질만을 고려했을 때 사용 콩의 표준화 및 사용 균주의 표준화가 이루어져야 보다 더 과학적이고 체계적이고 반복성 높게 제품을 생산할 수 있을 것이다. 따라서 콩 및 균주가 표준화된 발효 조건에서 청국장 수용성 단백질 profile을 중심으로 한 발효의 최적화 시도가 필요하며 이를 바탕으로 청국장에 생성된 기능성 물질과 특정 단백질과의 연관관계를 추적해 나갈 수 있을 것으로 사료된다.
전통 청국장과 natto를 단백질 적측 면에서 생화학적으로 비교하여 우열을 가리는 데는 무리가 있지만 natto는 단일 균주를 사용하기 때문에 불쾌취를 줄일 수 있고 외형상으로도 mucilage를 많이 생성하여 소비자의 선호를 이끌어 내는 데 유리한 점이 있다. 순창 지역의 전통 청국장 발효는 자연발효 조건을 이용하고 있는데 이 발효조건의 최적화라는 측면에서도 단백질만을 고려했을 때 사용 콩의 표준화 및 사용 균주의 표준화가 이루어져야 보다 더 과학적이고 체계적이고 반복성 높게 제품을 생산할 수 있을 것이다. 따라서 콩 및 균주가 표준화된 발효 조건에서 청국장 수용성 단백질 profile을 중심으로 한 발효의 최적화 시도가 필요하며 이를 바탕으로 청국장에 생성된 기능성 물질과 특정 단백질과의 연관관계를 추적해 나갈 수 있을 것으로 사료된다.
그렇지만 청국장과 같이 복잡한 단백질체를 분석하기에는 본 연구에서 고안한 전체 단백질 분리 기술과 2-D gel 분석적 접근은 단백질을 전체적으로 분석함에 있어 훌륭한 방법이다. 앞으로 청국장의 단백질 변화에 대한 연구는 의미 있는 변화를 보이는 소수의 단백질을 선발하고 이들에 대해 집중적으로 질량분석하여 단백질을 동정하는 것이 필요하다.

참고문헌 (34)

Joo HK. Studies on the manufacturing of cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 3: 64-67 (1971)

원문보기 상세보기
Lee KH, Lee HJ, Jung MK. Studies on cheonggukjang-on the changes of soy-bean protein in manufacturing cheonggukjang. J. Korean Agr. Chem. Soc. 14: 191-200 (1971)
Jang JH, Shim UY, Kim SH, Ji KM, Cha SK. Fibrinolytic and immunostimulating activities of Bacillus spp. strains isolated from cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 37: 255-260 (2005)
Kil JO, Kim GN, Park IS. Production and characterization of fibrinolysis enzyme: optimal condition for production of the enzyme from Bacillus sp. KP-6408 isolated from cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Nutr. 27: 51-56 (1998)
Kang SM, Lee CS, Yoo CK, Seo WS. Purification and characterization of fibrinolytic enzyme excreted by Bacillus subtilis K-54 isolated from cheonggukjang. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 26: 507-514 (1998)
Lee JJ, Cho CH, Kim JY, Kee DS, Kim HB. Antioxidant activity of substances extracted by alcohol from cheonggukjang powder. Korean J. Micorbiol. 37: 177-181 (2001)
Cho YJ, Cha WS, Bok SK, Kim MU, Chun SS, Choi UK. Production and separation of anti-hypertensive peptide during cheonggukjang fermentation with Bacillus subtilis CH-1023. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 42: 247-252 (2000)
Youn HK, Choi HS, Hur SH, Hong JH. Antimicrobial activities of viscous substance from cheonggukjang fermented with different Bacillus sp. J. Food Hyg. Saf. 16: 188-193 (2001)
Shon MY, Seo KI, Park SK, Cho YS, Sung NJ. Some Biological activities and isoflavone content of cheonggukjang prepared with black beans and Bacillus strains. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 30: 662-667 (2002)
Yu SM, Jang CM. Study on the processing adaptability of soybean cultivars for Korean traditional cheonggukjang preparation. J. Korean Soc. Agric. Chem. 42: 91-98 (1999)
Choi JS, Yu SM, Kim HR, Kim JS, Jang CM. Volatile compounds of cheonggukjang prepared by different fermentation methods and soybean cultivars. J. Korean Soc. Agric. Biotechnol. 42: 111-115 (1999)
Shin DH, Kwon OJ, Ji YD, Choi UK, Kwon O-J, Lee EJ, Jo YJ, Cha WS, Jung YG. The quality changes of cheonggukjang prepared by Bacillus sp. CS-17 during fermentation time. J. Korean Soc. Agric. Biotechnol. 43: 1-6 (2000)
Kim YS, Jung HJ, Park MS, Yu TS. Characteristics of flavor and functionality of Bacillus subtilis K-20 cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 475-478 (2003)
Lee YR, Kim SH, Jung NH, Lim MH. A study on the production of viscous substance during the cheonggukjang fermentation. J. Korean Agric. Chem. Soc. 35: 202-209 (1992)
Lee BY, Kim DM, Kim KH. Physico-chemical properties of viscous substance extracted from cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 23: 599-604 (1991)

원문보기 상세보기
Lee BY, Kim DM, Kim KH. Studies on the change in rheological properties of cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 23: 478-484 (1991)
Ahn YS, Kim YS, Shin DH. Isolation, identification and fermentation characteristics of Bacillus sp. with high protease activity from traditional cheonggukjang. Korean J. Food Sci. Technol. 38: 82-87 (2006)
Kim DM, Kim SH, Lee JM, Dung NT, Kang SC. Monitoring of color changes and organoleptic properties of cheonggukjang products during storage for shelf-life establishment. J. Korean Soc. Appl. Chem. 48: 140-149 (2005)
Youn KC, Kim DH, Kim JO, Park BJ, Yook HS, Cho JM, Byun MW. Quality characteristics of the cheonggukjang fermented by the mixed culture of Bacillus natto and B. licheniformis. J. Korean Food Sci. Nutr. 31: 204-210 (2002)

원문보기 상세보기
Youn SM, Chang CM. Study on processing adaptability of soybean cultivars for Korean traditional cheonggukjang preparation. J. Korean Agric. Chem. Soc. 31: 204-210 (1999)
Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H. A novel fibrinolytic enzyme (natto kinase) in the vegetable cheese natto: a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experientia 43: 1110-1117 (1987)

상세보기
Kameda Y, Ouhira S, Matsui K, Kanatomo S. Anti-tumor activity of Bacillus natto V. Isolation and characterization of surfactin in the culture medium of Bacillus natto KMD 2311. Chem. Pharm. Bull. 22: 938-944 (1974)

상세보기
Seo JH, Lee SP. Production of fibrinolytic enzyme from soybean grits fermented by Bacillus firmus NA-1. J. Med. Food 7: 442- 449 (2004)

상세보기
Tanimoto H, Mori M, Motoki M, Torii K, Kadowaki M, Noguchi T. Natto mucilage containing poly-gamma-glutamic acid increases soluble calcium in the rat small intestine. Biosci. Biotech. Bioch. 65: 516-21 (2001)

상세보기
Ashiuchi M, Kamei T, Baek DH, Shin SY, Sung MH, Soda K, Yagi T, Misono H. Isolation of Bacillus subtilis (cheonggukjang), a poly- ${\gamma}$ -glutamate producer with high genetic competence. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57: 764-769 (2001)

상세보기
Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, Appel RD, Humphery- Smith, I, Hochstrasser DF, Williams KL. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol. Genet. Eng. 13: 19-50 (1995)
Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249-256 (1997)

상세보기
Mooney BP, Thelen JJ. High-throughput peptide mass fingerprinting of soybean seed proteins: automated work flow and ability of UniGene expressed sequence tag databases for protein identification. Phytochemistry 65: 1733-1744 (2004)

상세보기
Natarajan S, Xu C, Capema TJ, Garrett WM. Comparison of protein solubilization methods suitable for proteomic analysis of soybean seed proteins. Anal. Biochem. 342: 214-220 (2005)

상세보기
Mizuno M, Masuda S, Takemaru K, Hosono S, Sato T, Takeuchi M, Kobayashi Y. Systematic sequencing of the 283 kb 210 degrees-232 degrees region of the Bacillus subtilis genome containing the skin element and many sporulation genes. Microbiology 142: 3103-3111 (1996)

상세보기
Amenta M, Cascio MT, Di Fiore P, Venturini I. Diet and chronic constipation. Benefits of oral supplementation with symbiotic zir fos (Bifidobacterium longum W11 + FOS Actilight). Acta Biomed. 77: 157-162 (2006)
Kacmaz Z, Kasici M. Effectiveness of bran supplement in older orthopaedic patients with constipation. J. Clin. Nurs. 16: 928-936 (2007)

상세보기
Maleki SJ, Kopper RA, Shin DS, Park CW, Compadre CM, Sampson H, Burks AW, Bannon GA. Structure of the major peanut allergen Ara h 1 may protect IgE-binding epitopes from degradation. J. Immunol. 164: 5844-5849 (2000)

상세보기
Lehmann K, Schweimer K, Reese G, Randow S, Suhr M, Becker WM, Vieths S, Rosch P. Structure and stability of 2S albumintype peanut allergens: implications for the severity of peanut allergic reactions. Biochem. J. 395: 463-472 (2006)

상세보기

저자의 다른 논문 :

LOADING...

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증