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문제 정의
- 팔물탕은 안색이 나쁘고, 현기증과 안화(頭暈眼花), 사지가 권태롭고(四肢倦怠), 기가 소진되어 말이 어눌해지고(氣短懶言), 가슴이 두근거리고 불안한 증상(心悸怔忡), 식욕부진에 적용한다고 알려져 있다18). 본 연구에서는 약리성분의 강화 및 흡수를 돕고자 유산균을 이용하여 발효팔물탕을 제조하였으며, 그 안전성을 비교 확인하기 위하여 팔물탕과 발효팔물탕의 급성경구독성 실험을 실시하였다.
- 팔물탕의 안전성 검증을 위하여 급성 단회투여 및 4주 반복투여독성에 대한 연구가 보고되어 있으나13, 14) 발효팔물탕의 안전성에 대한 연구는 전무하다. 이에 본 실험은 팔물탕과 발효팔물탕을 실험동물에 단회경구 투여하여, 팔물탕 및 발효팔물탕의 독성을 질적 및 양적으로 평가하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 대조군 및 팔물탕과 비교하여 발효팔물탕의 투여로 인한 급성독성 여부를 확인하고자 임상증상, 체중 및 체중대비 장기무게, 혈액학 및 혈액생화학적 수치 등을 비교하였다.
- OECD가이드라인 및 의약품 등의 독성시험 기준 해설서에서 추천하는 단회투여독성시험의 경구투여 상한용량에 따라 투여용량을 2000mg/kg으로 설정하였다. 팔물탕과 발효팔물탕 2000 mg/kg를 경구로 단회투여 후 14일간 실험동물을 관찰한 결과, 모든 암, 수 ICR 마우스에서 사망례가 관찰되지 않았다.
- 투여 14일째에서 모든 실험동물을 부검하여 내부장기를 관찰하였고 육안상으로 내부장기에서의 이상은 보이지 않았으므로 조직병리학적 검사는 생략하였다. 간, 신장, 비장, 심장, 폐는 독성물질에 의한 1차적인 영향을 받는 주요 장기이므로 적출 후 무게를 측정하였다(Table 3). 시험물질에 의한 장기손상 여부를 진단하기 위하여 체중대비 장기무게(상대적 장기무게)를 산출한 결과 팔물탕 혹은 발효팔물탕과 대조군 사이의 유의적인 장기무게의 차이가 없었다.
- 투여경로는 팔물탕의 임상적용경로에 따라 경구투여법을 사용하였으며, 한약재는 투여 전 3차 증류수에 용해시켜 시험에 사용하였다. 동물을 6시간 절식시킨 후 일회용 플라스틱제 존데(Fuchigami Kikai Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 강제 경구투여 하였다.
- 모든 동물에 대하여 투여 전 후, 1, 3, 7, 14일에 체중을 측정하였다. 동물을 희생시키기 전날 밤 절식시킨 후 다음날 아침에 Avertin(2,2,2-tribromoethanol, Aldrich, Milwaukee, WI, USA)으로 마취하여 복대정맥에서 채혈 후 방혈을 실시하여 안락사시킨 후 부검하였다.
- 임상증상은 투여 직후부터 6시간동안 매시간 관찰하였으며, 그 후 14일간 1일 1회 일반증상 관찰법에 의하여 관찰하였다. 모든 동물에 대하여 투여 전 후, 1, 3, 7, 14일에 체중을 측정하였다. 동물을 희생시키기 전날 밤 절식시킨 후 다음날 아침에 Avertin(2,2,2-tribromoethanol, Aldrich, Milwaukee, WI, USA)으로 마취하여 복대정맥에서 채혈 후 방혈을 실시하여 안락사시킨 후 부검하였다.
- 모든 실험동물에 대하여 복대정맥으로부터 채혈하여 얻은 혈액 중 약 500 ul를 K2-EDTA Vacuatiner(Becton-Dickison)에 분주하여 헤모글로빈(HGB), 적혈구용적률(HCT), 적혈구 수(RBC), 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구헤모글로빈(MCH), 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC), 백혈구 수(WBC), 혈소판(PLT), 평균혈소판용적(MPV)을 혈구자동측정기 ADVIA 2120i (Simens Diagnostics, Deerfield, USA)로 측정하였다.
- 모든 실험동물의 혈청으로부터 혈청 내 효소 AST, ALT, ALP와 Urea, Creatinine을 확인하였다(Table 4). AST, ALT, ALP는 간 기능을 진단하는데 활용되는 지표로 혈청내 증가가 곧 간손상을 의미하며, 이중 ALT가 가장 민감한 간특이효소이다.
- 본 실험은 실험동물윤리위원회의 심의를 거쳤으며, 사육실험실 환경은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수는 시간당 12-16회, 조명시간 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도 150-300Lx로 조절하였다.
- 시험물질로 인한 독성 여부를 판단하기 위하여 모든 실험동물에 대하여 1일 1회 임상증상을 관찰하였다. 관찰기간 동안, 시험물질 투여에 기인한 보행장애, 행동이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡촉박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유연은 관찰되지 않았다.
- 식품의약품안전청 고시 및 OECD의 시험 지침에 따라 경구투여 상한용량인 2000 mg/kg을 기준으로 대조군과 팔물탕, 발효팔물탕 투여군을 암, 수 각각 3개의 군(n=5)으로 실험하였다15, 16). 본 연구에서는 대조군 및 팔물탕과 비교하여 발효팔물탕의 투여로 인한 급성독성 여부를 확인하고자 임상증상, 체중 및 체중대비 장기무게, 혈액학 및 혈액생화학적 수치 등을 비교하였다.
- 4주령의 암, 수 ICR마우스를 (주)샘타코로부터 구입하여 한국한의학연구원 동물실험실 내에서 1주일간 순화를 거쳐 일반증상에 이상이 없음을 확인한 건강한 동물을 실험에 사용하였다. 암, 수 15마리씩 선정하여 polycarbonate cage에 5마리씩 수용하고, 실험동물용 고형사료(PMI nutrition, USA)와 음수를 자유롭게 공급하였다. 본 실험은 실험동물윤리위원회의 심의를 거쳤으며, 사육실험실 환경은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수는 시간당 12-16회, 조명시간 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도 150-300Lx로 조절하였다.
- 임상증상은 투여 직후부터 6시간동안 매시간 관찰하였으며, 그 후 14일간 1일 1회 일반증상 관찰법에 의하여 관찰하였다. 모든 동물에 대하여 투여 전 후, 1, 3, 7, 14일에 체중을 측정하였다.
- 채혈한 혈액 중 혈액학적 검사에 사용할 500 ul를 제외한 나머지 혈액을 실온에 30분 이상 방치하여 응고시킨 다음, 원심분리시켜 얻은 혈청으로부터 알칼라인 포스파타아제(ALP), 아스페테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 크레아티닌(Creatinin), 요소(Urea)를 자동생화학분석기(XL-200, Erba Diagnostics Mannheim, Germany)로 측정하였다.
- 투여 14일째에서 모든 실험동물을 부검하여 내부장기를 관찰하였고 육안상으로 내부장기에서의 이상은 보이지 않았으므로 조직병리학적 검사는 생략하였다. 간, 신장, 비장, 심장, 폐는 독성물질에 의한 1차적인 영향을 받는 주요 장기이므로 적출 후 무게를 측정하였다(Table 3).
대상 데이터
- 4주령의 암, 수 ICR마우스를 (주)샘타코로부터 구입하여 한국한의학연구원 동물실험실 내에서 1주일간 순화를 거쳐 일반증상에 이상이 없음을 확인한 건강한 동물을 실험에 사용하였다. 암, 수 15마리씩 선정하여 polycarbonate cage에 5마리씩 수용하고, 실험동물용 고형사료(PMI nutrition, USA)와 음수를 자유롭게 공급하였다.
- 한약재는 영천약업사(영천, 한국)에서 구입한 후 전문가(충남대학교, 배기환)의 감별 후에 사용하였다. 경서추출기(한국, cosmos-660)를 이용하여 3시간의 전탕추출법에 의하여 시험물질을 추출하였으며, 추출한 시험물질은 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하였다. 시험물질의 발효는한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI) 식품미생물 유전자은행에서 분양받은 Lactobacillus acidophilus을 1%(v/v)로 접종한 후, 37℃ 항온에서 48시간동안 통기배양으로 액체 발효를 실시한 후 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말형태로 조제하였다.
- 경서추출기(한국, cosmos-660)를 이용하여 3시간의 전탕추출법에 의하여 시험물질을 추출하였으며, 추출한 시험물질은 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하였다. 시험물질의 발효는한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI) 식품미생물 유전자은행에서 분양받은 Lactobacillus acidophilus을 1%(v/v)로 접종한 후, 37℃ 항온에서 48시간동안 통기배양으로 액체 발효를 실시한 후 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말형태로 조제하였다.
- 실험에 사용한 팔물탕의 한약재 구성은 Table 1에 요약하였다. 한약재는 영천약업사(영천, 한국)에서 구입한 후 전문가(충남대학교, 배기환)의 감별 후에 사용하였다. 경서추출기(한국, cosmos-660)를 이용하여 3시간의 전탕추출법에 의하여 시험물질을 추출하였으며, 추출한 시험물질은 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하였다.
데이터처리
- 통계분석은 SPSS Package program Ver 12.0(SPSS Inc.IL, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 실시하였으며, 대조군과 투여군사이의 비교분석을 위해 사후검정으로 Dunnett 시험을 이용하였다. 유의수준은 p<0.
이론/모형
- 본 연구에서는 대조군 및 팔물탕과 비교하여 발효팔물탕의 투여로 인한 급성독성 여부를 확인하고자 임상증상, 체중 및 체중대비 장기무게, 혈액학 및 혈액생화학적 수치 등을 비교하였다. 투여경로는 팔물탕의 임상적용경로에 따라 경구투여법을 사용하였으며, 한약재는 투여 전 3차 증류수에 용해시켜 시험에 사용하였다. 동물을 6시간 절식시킨 후 일회용 플라스틱제 존데(Fuchigami Kikai Co.
성능/효과
- 2. 팔물탕 및 발효팔물탕 투여로 인한 임상증상이 관찰되지 않았다.
- 3. 시험물질 투여로 인한 체중변화, 장기병변이 관찰되지 않았다.
- 4. 모든 동물군에 대하여 혈액학 및 혈액생화학적 검사 결과 이상이 관찰되지 않았다.
- 시험물질로 인한 독성 여부를 판단하기 위하여 모든 실험동물에 대하여 1일 1회 임상증상을 관찰하였다. 관찰기간 동안, 시험물질 투여에 기인한 보행장애, 행동이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡촉박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유연은 관찰되지 않았다.
- 대조군, 팔물탕 및 발효팔물탕 투여 후 체중 변화는 암수 모두에서 10%이내의 체중증가가 관찰되었으며, 각 관찰 시점에서 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다(p>0.05).
- 대조군과 비교하여 모든 실험군의 헤모글로빈과 적혈구 용적률, 적혈구 수, 평균적혈구 용적, 평균적 혈구헤모글로빈, 평균적 혈구헤모글로빈농도에서 유의성 있는 변화가 보이지 않았다(Table 5). 발효팔물탕을 투여한 암컷마우스의 백혈구 수가 유의성 있게 증가(p<0.
- AST, ALT, ALP는 간 기능을 진단하는데 활용되는 지표로 혈청내 증가가 곧 간손상을 의미하며, 이중 ALT가 가장 민감한 간특이효소이다. 시험군의 ALT, AST 및 ALP 의 수치는 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 팔물탕 및 발효팔물탕은 간기능에 영향이 없을 것으로 사료된다.
- 시험물질 투여 후 체중을 측정한 결과, 각 시험군의 체중은 대조군과 비교하여 암․수 모두에서 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다(p>0.05).
- 간, 신장, 비장, 심장, 폐는 독성물질에 의한 1차적인 영향을 받는 주요 장기이므로 적출 후 무게를 측정하였다(Table 3). 시험물질에 의한 장기손상 여부를 진단하기 위하여 체중대비 장기무게(상대적 장기무게)를 산출한 결과 팔물탕 혹은 발효팔물탕과 대조군 사이의 유의적인 장기무게의 차이가 없었다.
- 이상의 결과로 보아 팔물탕 및 발효팔물탕은 암, 수 마우스에 대하여 2000 mg/kg 용량에서 급성독성이 없는 안전한 한의약물로 판단된다. 특히 발효팔물탕의 경우 추후 연구를 통해 발효로 배가된 약효나 새로운 효능을 규명하면 다양한 적용을 할 수 있을 것으로 기대된다.
- 팔물탕 및 발효팔물탕을 투여한 암컷 마우스에서 urea가 대조군과 비교하여 유의성 있는 증가(p<0.05)가 관찰되었으나 creatinine에서는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다.
- OECD가이드라인 및 의약품 등의 독성시험 기준 해설서에서 추천하는 단회투여독성시험의 경구투여 상한용량에 따라 투여용량을 2000mg/kg으로 설정하였다. 팔물탕과 발효팔물탕 2000 mg/kg를 경구로 단회투여 후 14일간 실험동물을 관찰한 결과, 모든 암, 수 ICR 마우스에서 사망례가 관찰되지 않았다. 본 용량에서 시험물질 투여에 따른 사망이 일어나지 않았으므로 경구투여에 의한 팔물탕과 발효팔물탕의 반수치사량(LD50)은 2000 mg/kg보다 높은 것으로 판단된다.
후속연구
- 05)가 관찰되었으나 creatinine에서는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다. 시험군의 Urea 및 creatinin의 수치는 생물학적 변동범위에 포함되므로 신장에서 독성효과가 없는 것으로 판단되나, 반복투여독성시험 등에서 확인 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 팔물탕 및 발효팔물탕은 암, 수 마우스에 대하여 2000 mg/kg 용량에서 급성독성이 없는 안전한 한의약물로 판단된다. 특히 발효팔물탕의 경우 추후 연구를 통해 발효로 배가된 약효나 새로운 효능을 규명하면 다양한 적용을 할 수 있을 것으로 기대된다.
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