[논문]팔물탕의 항산화 효과와 자외선으로 유도된 각질형성세포 손상에 대한 보호효과

김태연; 박종필

팔물탕의 항산화 효과와 자외선으로 유도된 각질형성세포 손상에 대한 보호효과
Antioxidant and Protective Effects of Palmul-tang on Ultraviolet B (UVB)-induced Damage in Human Keratinocytes 원문보기

대한예방한의학회지 = Journal of Society of Preventive Korean Medicine, v.19 no.3, 2015년, pp.141 - 154

김태연 (세명대학교 한의과대학 예방의학교실) , 박종필 (세명대학교 한방바이오산업 임상지원센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : In this paper, we investigated the anti-oxidative capacities and protective effects of water extract of palmul-tang (PMT) against Ultraviolet B(UVB)-induced oxidative damage in human keratinocytes(HaCaT). Method : To evaluate the anti-oxidative activities of PMT, we measured scavenging activities on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, superoxide anion, lipid peroxidation and reducing power of PMT. To give an oxidative stress to HaCaT cells, UVB was irradiated with $40mJ/cm^2$ to HaCaT cells. To detect the protective effects of PMT against UVB, we measured cell viability, apoptotic bodies and reactive oxygen species(ROS) generation. Results : PMT showed the anti-oxidative activities by scavenging DPPH radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, superoxide anion, lipid peroxidation. Also PMT showed high reducing values. The UVB-induced oxidative conditions led to the cell apoptosis. However, treatment with PMT reduced oxidative stress conditions, including inhibition of cell apoptosis and expression of ROS. Conclusion : PMT had anti-oxidative activities and exhibited protective effects against UVB on HaCaT cells. PMT would be useful for the development of cosmetics treating UVB-induced skin aging.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러므로 본 연구에서는 피부노화를 개선하기 위한 한방 천연 소재 발굴을 목표로 한방처방인 팔물탕의 항산화능력과 각질형성세포에서 자외선으로 유도되는 세포사멸에 대한 억제능력을 확인하는 실험을 진행하였다.
피부는 외부환경에 항상 노출되어 있으므로 노화에 따른 피부변화는 많은 부분이 외부인자들의 영향에 의한 것이라고 할 수 있는데 특히 자외선을 통해 생성되는 활성산소가 피부노화의 가장 중요한 원인으로 간주되고 있다⁵⁰⁾. 따라서 본 연구에서는 팔물탕의 항산화능력을 확인하고, 사람각질형성세포에서 팔물탕이 자외선으로 유도된 세포사멸을 억제하는지 여부 및 사람각질형성세포에서 자외선 조사로 활성화되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 미치는 영향을 규명함으로써 자외선으로 유도된 피부노화에 대한 팔물탕의 보호효과 및 그 기전을 확인하고자 하였다.
자외선을 다시 세분하면 오존층에 의해 제거되는 제일 짧은 파장의 자외선C(200~ 290 ㎚), 유리창에 의해 제거되는 중간 파장의 자외선B(290~320 ㎚)와 파장이 가장 긴 자외선인 자외선A(320~400 ㎚)로 나뉘는데 자외선B는 대체로 표피에서 흡수되므로 각질세포에 영향을 미치며, 자외선A는 보다 심층부까지 침투하므로 표피의 각질세포와 진피의 섬유아세포에 영향을 미친다⁶⁸⁾. 본 실험에서는 자외선B를 조사하여 사람각질형성세포인 HaCaT 세포에 미치는 영향을 확인하였다.
본 연구에서는 팔물탕의 항산화 효과 및 자외선으로 유도된 각질형성세포 손상에 대한 보호 효과를 확인하고자 생체 내 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH 라디칼, 히드록실 라디칼, 과산화수소, 수퍼옥사이드 음이온, 지질과산화에 대한 팔물탕 열수추출물의 소거 효과 및 환원력 평가와 사람 각질형성세포주인 HaCaT cell에서 자외선B로 유도된 활성산소종 및 세포사멸에 대한 팔물탕의 작용을 평가하는 실험을 진행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

제안 방법

25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 시료 각 20 ㎕에 62 μM nitro blue tetrazolium(NBT)와 98 μM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)를 함유한 20 mM Tris 용액(pH 8.0) 800 ㎕를 혼합한 다음, 20 mM Tris 용액 80 ㎕와 33 μM phenazine methosulfate(PMS) 100 ㎕를 각각 첨가하였다.
에 따라 팔물탕의 환원력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 1 ㎖에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1 ㎖씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA 용액을 1 ㎖ 가하여 13500×g에서 15분 동안 원심분리하고 상등액 1 ㎖에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ㎖를 혼합한 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 2 ㎕를 linolenic acid emulsion 98 ㎕와 혼합한 후에 0.8 mM H2O2 50 ㎕와 0.8 mM FeSO4 50 ㎕를 혼합하여 히드록실 라디칼을 발생시킨 용액과 5시간 동안 반응 후 0.4% 2-thiobarbituric acid(TBA)를 200 ㎕ 첨가하고 95℃에서 2시간 반응시킨 다음 실온에서 10분 동안 반응시켰다.
을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 팔물탕의 소거능력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 500 ㎕를 1.5 ㎖ tube에 넣고 0.3 mM DPPH 용액을 500 ㎕ 가하여 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 함량은 [(흡광도_{시료무첨가} – 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의 공식으로 계산하였다.
을 변형하여 과산화수소에 대한 팔물탕의 소거활성을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 각 80 ㎕를 20 ㎕의 10 mM 과산화수소 및 100 ㎕의 0.01 M 인산완충용액(pH 5.0)과 37℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 후, 15 ㎕의 1.
Brand-Williams 등의 실험방법²¹⁾을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 팔물탕의 소거능력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 500 ㎕를 1.
Choi 등의 실험방법²³⁾을 변형하여 과산화수소에 대한 팔물탕의 소거활성을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 각 80 ㎕를 20 ㎕의 10 mM 과산화수소 및 100 ㎕의 0.
Chung 등의 실험방법²²⁾을 변형하여 히드록실 라디칼에 대한 팔물탕의 소거능력을 측정하였다. 50 ㎕의 10 mM FeSO₄와 50 ㎕의 10 mM H₂O₂를 이용한 Fenton 반응으로 히드록실 라디칼을 발생시켰다.
배양 배지를 제거하고 FBS가 없는 DMEM을 첨가하여 4시간 동안 추가 배양하였다. PBS로 3회 세척 후 5개의 UVB 램프(G8T5E, Sankyo Denki, Japan)를 이용하여 40 mJ/㎠ 세기로 UVB를 조사하여 세포사멸을 유도하였다. 이후 FBS가 포함된 DMEM에 팔물탕 열수추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 48시간 동안 추가 배양 후 MTT 수용액을 최종농도 １㎎/㎖가 되도록 배지에 넣고 1시간 30분 동안 암소에서 배양하였다.
배양 배지를 제거하고 FBS가 없는 DMEM을 첨가하여 4시간 동안 추가 배양하였다. PBS로 3회 세척 후 5개의 UVB 램프(G8T5E, Sankyo Denki, Japan)를 이용하여 40 mJ/㎠ 세기로 UVB를 조사하였다. 이후 0 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물이 포함된 DMEM 배지를 각각 첨가하여 12시간 동안 배양하였다.
Shlafer 등의 실험방법25)을 변형하여 지질과산화에 대한 팔물탕의 항산화 효과를 측정하였다.
그 후, 15 ㎕의 1.25 mM ABTS 및 30 ㎕의 peroxidase를 37℃에서 10분 동안 반응시켜 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며 항산화 활성은 [(흡광도시료무첨가 – 흡광도시료) / 흡광도시료무첨가]×100의 공식으로 계산하였다.
세포의 핵을 염색하기 위하여 배지의 상층액을 제거한 후 차가운 DPBS로 3회 세척하고 4% paraformaldehyde로 상온에서 30분간 처리하여 세포를 고정하였다. 다시 DPBS로 3회 세척 후 Hoechst 33342를 DPBS에 녹인 1 ㎍/㎖ 수용액으로 15분간 염색하고 형광현미경(EVOS fl, AMG, USA)을 이용하여 apoptotic body를 관찰하였다.
발생된 라디칼을 25 ㎕의 10 mM EDTA, 25 ㎕의 10 mM 2-deoxyribose, 150 ㎕의 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4)의 존재 하에서 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물과 반응시킨 다음 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다.
배양된 세포는 10 μM DCFH-DA가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2가 공급되는 조건에서 30분간 배양한 후 PBS로 3회 세척 후 형광현미경(EVOS fl, AMG, USA)을 이용하여 관찰하였다.
세포주에 10 ㎖의 DMEM 배지를 첨가하여 100 mm culture dish에 접종하고 37℃, 5% CO₂가 공급되는 조건에서 배양하였다. 배지는 주 3회 교체하였으며 culture dish 바닥면적의 70% 이상 자랐을 때 계대배양하였다. 계대배양 시 세포를 분리하기 위하여 0.
0) 800 ㎕를 혼합한 다음, 20 mM Tris 용액 80 ㎕와 33 μM phenazine methosulfate(PMS) 100 ㎕를 각각 첨가하였다. 비효소적 PMS / NADH로 유발된 수퍼옥사이드 음이온에 의해 자주색의 formazan으로 환원된 NBT를 측정하기 위해 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 560 ㎚에서 10분 동안 반응물의 흡광도를 측정하였다. 시료의 수퍼옥사이드 음이온 소거능은 [(흡광도_{시료무첨가} – 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의 공식으로 계산하였다.
이후 0 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물이 포함된 DMEM 배지를 각각 첨가하여 12시간 동안 배양하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 배지의 상층액을 제거한 후 차가운 DPBS로 3회 세척하고 4% paraformaldehyde로 상온에서 30분간 처리하여 세포를 고정하였다. 다시 DPBS로 3회 세척 후 Hoechst 33342를 DPBS에 녹인 1 ㎍/㎖ 수용액으로 15분간 염색하고 형광현미경(EVOS fl, AMG, USA)을 이용하여 apoptotic body를 관찰하였다.
가 공급되는 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 여기에 팔물탕 열수추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24시간 동안 추가 배양 후 MTT 수용액을 최종농도 １㎎/㎖가 되도록 배지에 넣고 1시간 30분 동안 37℃, 5% CO₂가 공급되는 조건에서 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DMSO 용액을 각 well 당 200㎕ 넣은 뒤 30분 정도 쉐이커에 올려놓아 석출되게 한후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다.
. 이에 저자는 補氣補血하여 인체의 眞氣를 보양하면 피부의 노화 또한 개선될 것으로 사료되어 氣血虛를 치료하는 대표적 처방인 팔물탕을 사용하여 본 연구를 진행하였다.
PBS로 3회 세척 후 5개의 UVB 램프(G8T5E, Sankyo Denki, Japan)를 이용하여 40 mJ/㎠ 세기로 UVB를 조사하였다. 이후 0 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물이 포함된 DMEM 배지를 각각 첨가하여 12시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 10 μM DCFH-DA가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂가 공급되는 조건에서 30분간 배양한 후 PBS로 3회 세척 후 형광현미경(EVOS fl, AMG, USA)을 이용하여 관찰하였다.
PBS로 3회 세척 후 5개의 UVB 램프(G8T5E, Sankyo Denki, Japan)를 이용하여 40 mJ/㎠ 세기로 UVB를 조사하여 세포사멸을 유도하였다. 이후 FBS가 포함된 DMEM에 팔물탕 열수추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 48시간 동안 추가 배양 후 MTT 수용액을 최종농도 １㎎/㎖가 되도록 배지에 넣고 1시간 30분 동안 암소에서 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DMSO 용액을 각 well 당 1 ㎖씩 넣은 뒤 30분 정도 쉐이커에 올려놓아 석출되게 한 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다.
이후 FBS가 포함된 DMEM에 팔물탕 열수추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 48시간 동안 추가 배양 후 MTT 수용액을 최종농도 １㎎/㎖가 되도록 배지에 넣고 1시간 30분 동안 암소에서 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DMSO 용액을 각 well 당 1 ㎖씩 넣은 뒤 30분 정도 쉐이커에 올려놓아 석출되게 한 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다.
이후 배지를 제거하고 DMSO 용액을 각 well 당 200㎕ 넣은 뒤 30분 정도 쉐이커에 올려놓아 석출되게 한후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다.
본 연구에 사용된 팔물탕(Palmul-tang, PMT)에 사용된 약재는 새롬제약(한국, 안성)에서 구입하였으며 세명대학교 부속한방병원에서 조제하였다(Table 1). 팔물탕 80 g을 증류수로 씻은 뒤 1 L의 증류수를 넣고 전기약탕기(대웅바이오가전, 한국)로 3시간 동안 가열 추출하였다. 추출된 용액은 원심분리하여 상층액을 취한 뒤 감압회전농축기(BUCHI, Switzerland)로 200㎖가 되도록 감압 농축하고 –80℃에서 동결시켰다.
팔물탕 열수추출물이 HaCaT 세포주의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 96 well plate에 2 X 10⁴ cell/well이 되도록 세포주를 분주하고 37℃, 5% CO₂가 공급되는 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 여기에 팔물탕 열수추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24시간 동안 추가 배양 후 MTT 수용액을 최종농도 １㎎/㎖가 되도록 배지에 넣고 1시간 30분 동안 37℃, 5% CO₂가 공급되는 조건에서 배양하였다.
회수한 상등액은 micro-plate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정 하였으며 항산화 활성은 [(흡광도시료무첨가 – 흡광도시료) / 흡광도시료무첨가]×100의공식으로 계산하였다.

대상 데이터

(USA)로부터, 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl(DPPH), iron(II) sulfate heptahydrate, hydrogen peroxide, 2-deoxy-D-ribose, thiobar- bituric acid(TBA), trichloroacetic acid(TCA), 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), peroxidase, potassium ferricyanide, linolenic acid 및 기타 시약은 Sigma Chemical Co. (USA)로부터 구입하였다.
본 연구에 사용된 HaCaT 세포주는 Cell Line Service (Germany)에서 분양 받았으며, 세포주를 배양하기 위하여 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin/ Streptomycin, Trypsin-EDTA 그리고 Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline(DPBS)는 Life Tech- nologies(USA)로부터 구입하였다. HaCaT 세포주를 배양하기 위하여 10% FBS와 100 unit/㎖ Penicillin/ Streptomycin이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 동결된 HaCaT 세포주를 DMEM 배지를 이용하여 빠르게 해동시키고 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 여분의 동결 보존액을 제거 하였다.
배지는 주 3회 교체하였으며 culture dish 바닥면적의 70% 이상 자랐을 때 계대배양하였다. 계대배양 시 세포를 분리하기 위하여 0.25% trypsin-EDTA를 사용하였다.
본 연구에 사용된 HaCaT 세포주는 Cell Line Service (Germany)에서 분양 받았으며, 세포주를 배양하기 위하여 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin/ Streptomycin, Trypsin-EDTA 그리고 Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline(DPBS)는 Life Tech- nologies(USA)로부터 구입하였다.
본 연구에 사용된 팔물탕(Palmul-tang, PMT)에 사용된 약재는 새롬제약(한국, 안성)에서 구입하였으며 세명대학교 부속한방병원에서 조제하였다(Table 1). 팔물탕 80 g을 증류수로 씻은 뒤 1 L의 증류수를 넣고 전기약탕기(대웅바이오가전, 한국)로 3시간 동안 가열 추출하였다.
DPPH 라디칼 함량은 [(흡광도_{시료무첨가} – 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의 공식으로 계산하였다. 양성 대조군으로는 1 ㎍/㎖ vitamin C를 사용하였다.
시료의 수퍼옥사이드 음이온 소거능은 [(흡광도_{시료무첨가} – 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의 공식으로 계산하였다. 양성 대조군으로는 10 mU superoxide dismutase(SOD)를 사용하였다.
회수한 상등액은 micro-plate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정 하였으며 항산화 활성은 [(흡광도_{시료무첨가} – 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의공식으로 계산하였다. 양성 대조군으로는 10 ㎍/㎖ vitamin E를 사용하였다.
25 mM ABTS 및 30 ㎕의 peroxidase를 37℃에서 10분 동안 반응시켜 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며 항산화 활성은 [(흡광도_{시료무첨가} – 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의 공식으로 계산하였다. 양성 대조군으로는 200 ㎍/㎖ vitamin C를 사용하였다.
시료의 환원력은 [(흡광도_{시료무첨가}) / 흡광도_시료) / 흡광도_{시료무첨가}]×100의 공식으로 계산하였다. 양성 대조군으로는 5 ㎍/㎖ vitamin C를 사용하였다.

데이터처리

이후 배지를 제거하고 DMSO 용액을 각 well 당 200㎕ 넣은 뒤 30분 정도 쉐이커에 올려놓아 석출되게 한후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다. 3회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 편차를 구하였다.
실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며 통계적 유의성은 t 검증(paired t test)을 시행하여 평가하였다.

이론/모형

DPPH 라디칼 함량은 [(흡광도시료무첨가 – 흡광도시료) / 흡광도시료무첨가]×100의 공식으로 계산하였다.
Liu 등의 실험방법²⁴⁾에 따라 수퍼옥사이드 음이온에 대한 팔물탕의 소거활성을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 시료 각 20 ㎕에 62 μM nitro blue tetrazolium(NBT)와 98 μM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)를 함유한 20 mM Tris 용액(pH 8.
Oyaizu의 방법²⁶⁾에 따라 팔물탕의 환원력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 팔물탕 열수추출물 1 ㎖에 pH 6.
지질과산화 정도는 [(흡광도시료무첨가 –흡광도시료)/흡광도시료무첨가]×100의 공식으로 계산하였다.
팔물탕이 HaCaT 세포주의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 분석법을 실시하였다. 아무런 처리를 하지 않은 대조군의 흡광도 평균을 100으로 정하고 각 흡광도 값을 환산하여 계산한 결과, 팔물탕은 200 ㎍/㎖의 농도에서 대조군과의 유의한 차이가 관찰되었다.

성능/효과

1. 팔물탕은 DPPH 라디칼, 히드록실 라디칼, 과산화수소, 수퍼옥사이드 음이온에 대하여 농도 의존적 소거능력을 보였다.
2. 팔물탕은 지질과산화 억제능 및 환원력을 나타냈다.
25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 팔물탕을 처리한 후 히드록실 라디칼 소거능을 측정한 결과, 전 농도에서 대조군과 비교하여 유의성 있는 소거능이 관찰되었다.
3. 팔물탕은 HaCaT cell에서 자외선조사로 유발되는 활성산소종에 대하여 억제효과를 보였다.
4. 팔물탕은 HaCaT cell에서 자외선 조사로 유도된 세포사멸에 대하여 억제효과를 보였다.
DPPH 라디칼에 대한 팔물탕의 항산화 효과를 확인하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, DPPH 라디칼 소거능은 12.55%, 21.69%, 41.15%, 71.28%로 농도 의존적으로 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 1A).
Fenton 반응으로 발생된 히드록실 라디칼에 팔물탕을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 히드록실 라디칼 소거능은 각각 9.17%, 10.02%, 12.88%, 15.79%로 나타남을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).
UVB 조사가 ROS 생성을 유도하는지를 확인하고, UVB가 조사된 세포 내에서 ROS 생성에 미치는 팔물탕의 영향을 관찰하고자 DCFH-DA assay를 시행한 결과, UVB의 자극은 세포 내 ROS의 생성을 현저히 증가시켰으며, 이러한 ROS의 생성은 100 ㎍/㎖의 팔물탕 열수추출물 처리에 의하여 억제됨을 확인할 수 있었다.
UVB로 유도되는 세포사멸에 대한 팔물탕의 회복력을 확인하기 위하여 세포에 UVB를 40 mJ/㎠로 조사한 후 팔물탕을 0, 25, 50, 100 ㎍/㎖로 처리한 결과, 50, 100 ㎍/㎖에서 손상 회복에 의한 생존율이 증가하였다(Fig. 4). UVB로 유도된 세포사멸에서 나타나는 apoptotic body를 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰한 결과, UVB 조사 후 팔물탕 100 ㎍ /㎖를 처리한 군은 UVB 단독 조사군과 비교하여 apop- totic body를 형성한 세포(화살표)가 현저히 감소하였음을 확인하였다(Fig.
4). UVB로 유도된 세포사멸에서 나타나는 apoptotic body를 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰한 결과, UVB 조사 후 팔물탕 100 ㎍ /㎖를 처리한 군은 UVB 단독 조사군과 비교하여 apop- totic body를 형성한 세포(화살표)가 현저히 감소하였음을 확인하였다(Fig. 5). 따라서 팔물탕은 UVB로 유도된 세포손상에 대하여 회복 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
과산화수소에 대한 팔물탕의 항산화 효과를 확인하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 2.35%, 6.54%, 14.41%의 소거능을 나타내었으며 200 ㎍/㎖의 농도에서 17.06%의 소거능을 보여준 vitamin C와 유사한 항산화 능력을 확인할 수 있었다(Fig. 1C).
아무런 처리를 하지 않은 대조군의 흡광도 평균을 100으로 정하고 각 흡광도 값을 환산하여 계산한 결과, 팔물탕은 200 ㎍/㎖의 농도에서 대조군과의 유의한 차이가 관찰되었다. 따라서 팔물탕은 100 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 생존율과 증식을 저해하지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 2).
5). 따라서 팔물탕은 UVB로 유도된 세포손상에 대하여 회복 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
. 본 실험에서 xanthine과 xanthine oxidase에 의해 생성되는 수퍼옥사이드 음이온에 대한 팔물탕의 소거능을 평가한 결과, 25 ㎍/㎖에서부터 농도 의존적으로 소거능이 증가함을 확인할 수 있었다.
본 연구를 통해 팔물탕의 항산화능력과 자외선B로 유도되는 ROS 및 세포사멸 억제능을 확인함으로써 팔물탕이 자외선으로 인한 피부손상을 보호하는 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 추후 주름생성과 색소침착 등의 기전에 대한 항노화 연구가 함께 진행된다면 한방처방의 활용 범위가 안전하면서도 효과적인 화장품 소재 개발 분야로까지 확대될 수있을 것으로 기대된다.
. 본 연구에서는 지질과산화에 대한 팔물탕의 항산화 효과를 조사하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 팔물탕을 처리한 결과, 25 ㎍/㎖ 농도에서부터 대조군과 비교하여 유의성 있는 지질과산화 억제효과를 나타내었다.
사람각질형성세포인 HaCaT 세포주에서 자외선B로 유발되는 ROS에 대한 팔물탕의 효과를 확인하고자, ROS가 존재하는 환경에서 고형광의 2',7'-dichloro- fluorescein(DCF)로 빠르게 산화되는 2',7'-dichloro- dihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)73)를 이용한 염색법을 시행한 결과, 자외선 조사 후 100 ㎍/㎖의 팔물탕을 처리한 군은 자외선 단독 조사군과 비교하여 ROS 생성이 억제되었음을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여 팔물탕이 여러 종류의 활성산소종을 억제하는 항산화능력을 지니고 있음을 확인할 수 있었으며, 이러한 효과는 팔물탕의 지표 성분인 진세노사이드 Rg1(ginsenoside Rg1), 진세노사이드 Rb1 (ginsenoside Rb1), 5-히드록시메틸-2-푸르알데히드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, 5-HMF), Z-리구스틸라이드(z-ligustilide), 알비플로린(albiflorin), 패오니플로린(paeoniflorin), 리퀴리틴(liquiritin) 등이59) 지닌 항산화 효능60-64)으로 인한 결과일 것으로 사료된다.
수퍼옥사이드 음이온에 대한 팔물탕의 항산화 효과를 확인하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 8.19%, 12.83%, 24.04%, 46.69%의 유의성 있는 수퍼옥사이드 음이온 소거능을 확인할 수 있었다(Fig. 1D).
아무런 처리를 하지 않은 대조군의 흡광도 평균을 100으로 정하고 각 흡광도 값을 환산하여 계산한 결과, 팔물탕은 200 ㎍/㎖의 농도에서 대조군과의 유의한 차이가 관찰되었다.
를 이용한 염색법을 시행한 결과, 자외선 조사 후 100 ㎍/㎖의 팔물탕을 처리한 군은 자외선 단독 조사군과 비교하여 ROS 생성이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 세포내 ROS 생성 억제 효과를 바탕으로 팔물탕이 자외선B로 유도된 세포사멸에 미치는 영향을 확인하고자 MTT assay를 시행한 결과, 팔물탕의 농도 의존적 세포사멸 억제 효능을 확인할 수 있었으며, Hoechst 33342 염색상에서도 팔물탕 처리군은 자외선 단독 조사군과 비교하여 세포사멸에서 초래되는 핵 응축 현상인 apoptotic body가 감소되어 팔물탕의 세포사멸 억제능력을 재차 확인할 수 있었다.
지질과산화에 대한 팔물탕의 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 히드록실 라디칼에 노출시키고 팔물탕을 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 5.83%, 27.30%, 36.40%, 40.07%로 전 농도에서 유의성 있는 지질과산화 억제효과가 관찰되었다(Fig. 1E).
. 팔물탕은 50 ㎍/㎖에서부터 대조군과 비교하여 유의성 있는 소거능을 나타내었으며 200 ㎍/㎖ 농도에서 vitamin C(17.06%)와 유사한 소거능(14.41%)을 확인할 수 있었다.
팔물탕의 환원력을 확인하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 11.57%, 26.03%, 58.62%, 116.24%의 환원력을 관찰할 수 있었다(Fig. 1F).
항산화 능력은 항산화제에서 제공되는 수소원자가 자유라디칼과 반응하는 능력인 환원력에 의하여 좌우되므로²⁶⁾ 팔물탕의 환원력을 확인하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 농도 의존적으로 환원력이 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2F).

후속연구

본 연구를 통해 팔물탕의 항산화능력과 자외선B로 유도되는 ROS 및 세포사멸 억제능을 확인함으로써 팔물탕이 자외선으로 인한 피부손상을 보호하는 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 추후 주름생성과 색소침착 등의 기전에 대한 항노화 연구가 함께 진행된다면 한방처방의 활용 범위가 안전하면서도 효과적인 화장품 소재 개발 분야로까지 확대될 수있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	팔물탕은 어떤것을 치료하는 처방인가?	팔물탕(palmul-tang, PMT)은 補氣의 기본 처방인 사군자탕과 血虛에 사용하는 사물탕이 합쳐진 처방으로 虛勞와 氣血이 모두 虛한 것을 치료하는 처방이다14). 사군자탕은 활성산소 과잉 생성에 의한 노화과정에서 세포손상과 지질과산화를 억제하는 효과가 있다고 알려져 있으며15) 사물탕 또한 항산화능16), 항염증17), 세포손상보호18) 등의 효과가 있음이 보고되어 있다.
	팔물탕이란?	팔물탕(palmul-tang, PMT)은 補氣의 기본 처방인 사군자탕과 血虛에 사용하는 사물탕이 합쳐진 처방으로 虛勞와 氣血이 모두 虛한 것을 치료하는 처방이다14). 사군자탕은 활성산소 과잉 생성에 의한 노화과정에서 세포손상과 지질과산화를 억제하는 효과가 있다고 알려져 있으며15) 사물탕 또한 항산화능16), 항염증17), 세포손상보호18) 등의 효과가 있음이 보고되어 있다.
	팔물탕의 항산화 효과 및 자외선으로 유도된 각질형성세포 손상에 대한 보호 효과를 확인한 본 연구에서 얻은 결론은?	1. 팔물탕은 DPPH 라디칼, 히드록실 라디칼, 과산화수소, 수퍼옥사이드 음이온에 대하여 농도 의존적 소거능력을 보였다. 2. 팔물탕은 지질과산화 억제능 및 환원력을 나타냈다. 3. 팔물탕은 HaCaT cell에서 자외선조사로 유발되는활성산소종에 대하여 억제효과를 보였다. 4. 팔물탕은 HaCaT cell에서 자외선 조사로 유도된 세포사멸에 대하여 억제효과를 보였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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