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문제 정의
- . 따라서 이들 약물은 유방염의 가장 대표적인 원인균인 S. aureus 에 대해 유효한 항균 및 항염 효과를 동시에 나타낼 것이라 기대되어 본 연구를 시행하게 되었다.
- 본 연구에서는 유방염 등의 부인과 질환에서 이들 약재의 효능을 검토하기 위해, S. aureus 세균주에 대한 MIC를 표준 액체배지 희석법으로 측정하여, 항균효과를 평가하였다. 항염 및 염증 관련 cytokine의 발현에 대한 연구를 수행하기 위해 LPS로 활성화된 murine macrophage 세포 주인 Raw 264.
- aureus를 이용한 과루인, 치자, 백지의 항균 및 항염 효과에 대한 연구는 아직 접하지 못하였다. 이에 저자는 S. aureus 에 대한 이 세 가지 약재의 항균 및 항염 효과에 대한 분석을 통하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 5 Mcfarland standard와 같은 탁도로 조정한 다음, 균액을 10, 100, 1000 및 10000배로 단계 희석하여 균의 농도가 1×104 CFU/ml이 되도록 만들어 MH agar에 접종하였다. 37℃, 10% CO2 조건에서 24시간 배양한 다음 조직에 형성된 집락 수를 희석된 순서대로 OD와 비교하였다. 0.
- 1 mg/ml 농도의 MTT 용액 50 μl를 첨가하고, 4시간 배양한 후 배지를 제거하고, 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 Automatic ELISA microplate reader(Huntsville, AL, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. LPS 무처리군에 대한 ratio로 세포 생존율을 측정하였으며, 5회 반복실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여, 세포의 생존율 감소를 50% 억제하는 추출물의 ED50를 산출하였다.
- LPS 처리 24시간 후 배지를 수거하고, PGE2 ELISA Kit(Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 이용하여, manufacturer’s instruction에 따라 함량을 측정하였다.
- LPS 처리12시간 후 배지를 수거하고, 각각의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 ELISA Kit(Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 이용하여, manufacturer’s instruction에 따라 함량을 측정하였다.
- Lincomycin 역시 25 μg/ml의 농도로 멸균증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.782, 0.391, 0.195, 0.098 및 0 μg/ml 의 총 10가지 농도를 준비하고, 동일한 방법으로 bacteria suspension(1.5×106 CFU/ml)을 첨가한 다음 48시간동안 37℃에 배양하였다.
- PGE2 생성량을 측정하기 위하여 6 well plate에 cells 5×105 CFU/ml를 분주하고, 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물을 각각 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS 1 μg/ml 를 처리하였다.
- 5×106 CFU/ml)을 첨가한 다음 48시간동안 37℃에 배양하였다. Pfaller 등의 방법에 따라, MIC는 각각의 growth control well과 시료가 함유된 well의 S. aureus 성장을 육안적으로 비교 관찰하여, 균의 생장 억제가 나타나는 최소 농도로 결정하였다. 모든 실험은 5회 반복하였다.
- Raw 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 즉, 세포 배양 상등액 50 μl와 Griess시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 50 μl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Automatic ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
- S. aureus를 spectrophotometer(Milton Roy Spectronic 20D; Milton Roy Company, PA, USA)를 이용하여, 600 nm(OD600)에서의 흡광도를 0.5 Mcfarland standard와 같은 탁도로 조정한 다음, 균액을 10, 100, 1000 및 10000배로 단계 희석하여 균의 농도가 1×104 CFU/ml이 되도록 만들어 MH agar에 접종하였다.
- TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량을 측정하기 위하여 6 well plate에 cells 5×105 CFU/ml를 분주하고, 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물을 각각 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS 1 μg/ml 를 처리하였다.
- 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 S. aureus에 대한 항균력을 표준 액체배지 희석법으로 평가하였으며, LPS로 활성화된 세포주인 Raw 264.7 세포를 이용하여 항염효과를 각각 평가한 결론은 다음과 같다.
- 또 항염 및 염증관련 cytokine의 발현에 대한 연구를 수행하기 위해 LPS로 활성화된 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포를 이용하여 세포 생존율, PGE2, NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비에 미치는 영향을 각각 평가하였다.
- 05 이하인 경우 통계적 유의성을 인정하였다. 또한 ED50는 Probit 방법을 이용하여, SPSS for Windows(Release 14.0K, SPSS Inc., USA)로 산출하였고, 후보 물질의 효과를 보다 명확히 하기 위하여, LPS 처리군과 비처리 대조군과의 percent change를 아래의 공식을 이용하여 측정하였다.
- 7 세포를 이용하여 세포 생존율, PGE2, NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비에 미치는 영향을 각각 평가하였다. 본 실험에서 각각의 물 추출물의 항균력은 lincomycin과 비교하였으며, 항염 효과는 piroxicam과 비교하였다.
- 본 연구에서는 S. aureus ATCC 25923 세균주를 이용하여, 표준 액체배지 희석법(agar microdilution method)9)으로 최소 저지농도(Minimal Inhibition Concentration; MIC)를 측정한 후, 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 항균력을 평가하였다. 또 항염 및 염증관련 cytokine의 발현에 대한 연구를 수행하기 위해 LPS로 활성화된 murine macrophage 세포주인 Raw 264.
- 여기에 S. aureus의 단일 집락을 MH broth 배지에 접종한 지 48 시간 후 OD600을 spectrophotometer로 측정하여, 1.5×106 cell이 들어가도록 준비한 cell suspension 100 μl를 분주 하였다.
- 즉 각각의 물 추출물을 25 mg/ml의 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.782, 0.391, 0.195, 0.098 및 0 mg/ml의 총 10가지 농도를 준비하여 각각 멸균된 96 well plate에 100 μl씩 분주하였다.
- 즉, 각각의 물 추출물을 10 mg/ml의 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0 mg/ml의 총 6가지 농도를 준비하고, piroxicam 역시 100, 10, 5, 2.5, 1.25 및 0 μg/ml 농도의 총 6가지 농도를 준비하여, 각각 세포에 처리한 후에 37℃, 5% CO2의 환경이 유지되는 배양기에서 배양하였다.
- 즉, 세포 배양 상등액 50 μl와 Griess시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 50 μl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Automatic ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
- 7 세포를 이용하였고, 세포 생존율, PGE2, NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비에 미치는 영향을 각각 평가하였다. 항균력은 lincomycin과 항염효과는 piroxicam과 각각 비교하였다.
- 항염 및 염증 관련 cytokine의 발현에 대한 연구를 수행하기 위해 LPS로 활성화된 murine macrophage 세포 주인 Raw 264.7 세포를 이용하였고, 세포 생존율, PGE2, NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비에 미치는 영향을 각각 평가하였다.
대상 데이터
- S. aureus는 American Type Culture Collection Center(VA, USA)에서 동결건조 상태로 구입하여, BHI 배지에 녹인 후 BHI agar에 2~3회 계대 배양한 후 사용하였으며, MH agar 또는 broth에서 유지시켰다. 또한 murine macrophage 세포 주인 Raw 264.
- 시중에서 구입한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 각 100 g을 취하여, 정제수 1000 ml로 80℃에서 3시간 동안 3번 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(Buchi Rotavapor R144, Buchi Labortechnik AG, Switzland)로 감압·농축하였다. 각각 점조성의 추출물을 얻은 다음 programmable freeze dryer(Labconco Freezone1, Labconco Corp., MO, USA)를 사용하여 동결 건조시켜, 갈색, 적갈색 또는 연갈색의 瓜蔞仁, 梔子 및 白芷 물 추출물을 각각 12.06(수율 12.06%), 13.17(수율 13.17%), 13.86(수율13.86%) g을 얻어 실험에 사용하였다. 각각의 학명 및 특성은 다음과 같다(Table 1).
- 또한 96 well-plate는 Greiner(Germany)에서 구입하였으며, PGE2, TNF-α, IL-1β와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen(Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였고, 이외 대부분의 시약은 Aldrich-Sigma(MO, USA)에서 구입하여 사용 하였다.
- aureus는 American Type Culture Collection Center(VA, USA)에서 동결건조 상태로 구입하여, BHI 배지에 녹인 후 BHI agar에 2~3회 계대 배양한 후 사용하였으며, MH agar 또는 broth에서 유지시켰다. 또한 murine macrophage 세포 주인 Raw 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 Raw 264.
- 본 실험에 사용된 모든 약재는 제천한방약초(제천, 한국)에서 매입한 것을 현미경 하에서 관능 검사를 통하여 선정하여 사용하였으며, 배지 및 시약으로 사용된 BHI, MH agar 또는 DMEM은 Difco(MI, USA)에서 각각 구입하였으며, MTT, LPS(from Escherichia coli 0111:B4), 대조약물인 lincomycin hydrochloride 및 piroxicam은 Aldrich-Sigma(MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 또한 96 well-plate는 Greiner(Germany)에서 구입하였으며, PGE2, TNF-α, IL-1β와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen(Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였고, 이외 대부분의 시약은 Aldrich-Sigma(MO, USA)에서 구입하여 사용 하였다.
- 시중에서 구입한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 각 100 g을 취하여, 정제수 1000 ml로 80℃에서 3시간 동안 3번 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(Buchi Rotavapor R144, Buchi Labortechnik AG, Switzland)로 감압·농축하였다.
- 7 세포는 DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 실험 과정의 모든 세포는 80~90%의 confluence에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.
- 실험에 사용한 Raw 264.7 세포는 DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 5회 반복 실험의 평균±표준편차로 표시하였으며, 세포 생존율, NO, PGE2 및 Cytokine생성량에 미치는 효과는 다중 비교 검증을 이용하여 통계 처리를 실시하였다.
- 즉, 분산 동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하고, 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least -significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U(MW) test를 실시하여 군 간의 유의성을 검증하였다. 모든 통계처리는 SPSS for Windows(Release 14.
- 및 Cytokine생성량에 미치는 효과는 다중 비교 검증을 이용하여 통계 처리를 실시하였다. 즉, 분산 동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하고, 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least -significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U(MW) test를 실시하여 군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 S. aureus에 대한 최소 저지농도를 표준 액체배지 희석법을 이용하여 측정하였다. 즉 각각의 물 추출물을 25 mg/ml의 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여 25, 12.
- 비교적 정확한 흡광도 OD와 세균 수의 상관관계를 알아보기 위하여, 정량 평판법(Quantitative Plating Methods, Standard Plate Count)을 이용하여 균수를 측정하였다16,17). S.
성능/효과
- 1. S. aureus에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 MIC는 각각 > 25, 4.063±2.096(1.563~6.250), 1.641±0.972(0.391~3.125) mg/ml로 관찰되어, 白芷, 梔子 물 추출물 순으로 S. aureus 에 대한 항균력을 나타내었으나, 瓜蔞仁물 추출물은 별 다른 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다.
- 2. LPS 처리된 Raw 264.7 세포의 생존율, NO, PGE2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량 증가 억제에 대한 ED50를 관찰한 결과 白芷, 瓜蔞仁, 梔子의 순으로 세포 보호, 항염 또는 항산화 효과 부분에서 유의성 있는 결과를 나타내었다.
- LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-1β 생성량의 감소가 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 처리군에서 각각 0.001 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 1.25 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 IL-1β 생성량의 증가에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam의 ED50는 각각1.362 mg/ml, 1.801 mg/ml, 0.534 mg/ml, 7.101 μg/ml 로 산출되었다.
- LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-6 생성량의 감소가 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 처리군에서 각각 0.001 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.001 mg/ml, 2.5 μg/ml 부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 IL-6 생성량의 증가에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 의 ED50는 각각 0.371 mg/ml, 0.797 mg/ml, 0.202 mg/ml, 5.044 μg/ml 로 산출되었다.
- LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) NO 생성량의 감소가 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 처리군에서 각각 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.001 mg/ml, 1.25 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 NO 생성량의 증가에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam의 ED50는 각각 4.808 mg/ml, 22.015 mg/ml, 2.949 mg/ml, 6.552 μg/ml로 산출되었다.
- LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) PGE2 생성량의 감소가 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 처리군에서 각각 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 1.25 μg/ml 부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 PGE2 생성량의 증가에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam의 ED50는 각각 3.040mg/ml, 4.312 mg/ml, 0.821 mg/ml, 1.162 μg/ml로 산출되었다.
- LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) TNF-α생성량의 감소가 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 처리군에서 각각 0.01 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 1.25 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 TNF-α 생성량의 증가에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 의 ED50는 각각 9.563 mg/ml, 54.931 mg/ml, 1.240 mg/ml, 7.273 μg/ml 로 산출되었다.
- LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 세포 생존율의 증가가 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 처리군에서 각각 0.1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 5 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 세포 생존율 감소에 대한 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam의 ED50는 각각 7.635 mg/ml, 13.761 mg/ml, 6.986 mg/ml, 35.179 μg/ml로 산출되었다.
- LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 각각 1462.40%, 1452.40%, 1469.60%, 1460.60%의 TNF-α생성량의 변화를 나타내었다.
- LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 각각 2354.20%, 2386.20%, 2366.00%, 2385.60%의 IL-6 생성량의 변화를 나타내었다.
- LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 각각 366.80%, 369.40%, 368.00%, 365.60%의 IL-1β 생성량의 변화를 나타내었다.
- LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 각각 39671.00%, 40150.20%, 39529.60%, 39534.00%의 PGE2 생성량의 변화를 나타내었다.
- LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물, piroxicam 각각 426.00%, 431.60%, 397.00%, 425.80%의 NO 생성량의 변화를 나타내었다.
- 瓜蔞仁 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -15.16, -23.86, -32.90, -47.04 및 -54.19%의 변화를 나타내었고, 梔子 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -7.95, -18.94, -20.60, -48.06 및 -52.39%의 변화를 나타내었으며, 白芷 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -22.36, -30.40, -42.33, -51.64 및 -59.80%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.
- 瓜蔞仁 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -18.42, -21.89, -33.12, -50.77 및 -61.18%의 변화를 나타내었고, 梔子 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -10.52, -19.98, -28.33, -48.53 및 -60.80%의 변화를 나타내었으며, 白芷 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -17.56, -22.48, -47.39, -57.05 및 -62.09%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.
- 瓜蔞仁 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -9.58, -13.50, -25.77, -34.34 및 -51.97%의 변화를 나타내었고, 梔子 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -7.03, -11.16, -15.65, -24.75 및 -44.06%의 변화를 나타내었으며, 白芷 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -11.96, -22.39, -36.61, -47.53 및 -62.68%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.
- 瓜蔞仁 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 8.08, 19.53, 30.30, 38.72 및 49.49%의 변화를 나타내었고, 梔子 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 1.41, 13.38, 25.35, 34.15 및 43.31%의 변화를 나타내었으며, 白芷 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 7.31, 21.93, 26.25, 39.53 및 50.83%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.
- 瓜蔞仁 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독처리군에 비해 각각 -14.58, -19.62, -41.85, -62.14 및 -70.61%의 변화를 나타내었고, 梔子 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -13.02, -19.00, -34.29, -56.29 및 -65.36%의 변화를 나타내었으며, 白芷 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -21.69, -23.60, -48.72, -64.06 및 -71.73%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.
- 瓜蔞仁 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -20.19, -28.52, -32.28, -44.68 및 -53.31%의 변화를 나타내었고, 梔子 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -16.06, -21.63, -23.14, -33.07 및 -51.69%의 변화를 나타내었으며, 白芷 물 추출물은 각각의 농도 처리군에서 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -26.84, -27.85, -29.01, -50.42 및 -55.98%의 변화를 나타내었다. 마지막으로, piroxicam 1.
- 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 S. aureus 에 대한 MIC를 표준 액체배지희석법으로 평가한 결과, MIC는 각각 >25, 4.063±2.096(1.563~6.250), 1.641±0.972 (0.391~3.125) mg/ml로 관찰되어, 白芷, 梔子 물 추출물 순으로 항균력을 나타내었으나, 瓜蔞仁 물 추출물은 별 다른 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다.
- aureus에 대해 별 다른 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다. 또 白芷, 瓜蔞仁, 梔子 물 추출물의 순으로 세포 보호, 항염 또는 항산화 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -28.36, -39.39, -51.52, -63.08 및 -84.32%의 변화를 나타내었다(Fig. 21-24).
- 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 3.02, 12.75, 30.20, 47.65 및 56.04%의 변화를 나타내었다(Fig. 1-4).
- 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -27.06, -37.97, -44.97, -61.38 및 -75.39%의 변화를 나타내었다(Fig. 17-20).
- 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -29.19, -42.21, -50.07, -55.63 및 -69.88%의 변화를 나타내었다(Fig. 13-16).
- 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -41.94, -59.07, -69.96, -77.87 및 -82.52%의 변화를 나타내었다(Fig. 9-12).
- 마지막으로, piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -25.03, -30.81, -40.06, -69.49 및 -79.16%의 변화를 나타내었다(Fig. 5-8).
- 모든 동결 건조 추출물은 사용한 용매인 증류수에 25 mg/ml의 농도까지 비교적 잘 용해되었고, lincomycin 및 piroxicam은 25 및 100 μg/ml까지 비교적 잘 용해되었다.
- aureus 성장을 육안적으로 비교 관찰하여, 균의 생장 억제가 나타나는 최소 농도로 결정하였다. 모든 실험은 5회 반복하였다.
- 본 실험의 결과 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 LPS 처리 Raw 264.7세포 생존율에 대한 ED50가 각각 7.635, 13.761, 6.986 mg/ml로 관찰되어 白芷, 瓜蔞仁, 梔子의 순으로 대식 세포 보호 효과를 나타내는 것으로 판단되었으며, LPS처리 후 그 효과는 농도 의존적으로 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
- . 본 실험의 결과 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 NO 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 4.808, 22.015, 2.949 mg/ml 로 관찰되어, 白芷, 瓜蔞仁, 梔子의 순으로 과도한 대식세포의 NO 생산 억제 효과, 즉 항산화 효과를 나타내는 것으로 판단되었으며, LPS처리 후 그 효과는 농도 의존적으로 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
- . 본 실험의 결과, 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 PGE2 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 3.040, 4.312, 0.821 mg/ml로 관찰되어, 白芷, 瓜蔞仁, 梔子의 순으로 과도한 대식 세포의 PGE2 생산 억제 효과, 즉 항염 효과를 나타내는 것으로 판단되었으며, LPS 처리 후 그 효과는 농도 의존적으로 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
- 본 실험의 결과, 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 TNF-α 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 9.563, 54.931, 1.240 mg/ml로, IL-1β 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 1.362, 1.801, 0.534 mg/ml로, IL-6 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 0.371, 0.797, 0.202 mg/ml로 관찰되어, 白芷, 瓜蔞仁, 梔子의 순으로 세포보호, 항염 또는 항산화 효과를 나타내었으며, LPS처리 후 그 효과는 농도 의존적으로 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
- NO2-의 농도는 sodium nitrate를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다. 실험 결과는 무처리 대조군에 대한 ratio로 NO 생성량의 변화를 표시하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여, 각각의 물 추출물이 NO 생성량을 50% 억제하는 ED50를 산출하였다.
- LPS 처리 24시간 후 배지를 수거하고, PGE2 ELISA Kit(Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 이용하여, manufacturer’s instruction에 따라 함량을 측정하였다. 실험 결과는 무처리 대조군에 대한 ratio로 PGE2 생성량의 변화를 표시하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여, 각각의 물 추출물이 PGE2 생성량을 50% 억제하는 ED50를 산출하였다.
- 실험 결과는 무처리 대조군에 대한 ratio로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량의 변화를 표시하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여, 각각의 물 추출물이 cytokine에 대한 증가를 50% 억제하는 ED50를 산출하였다.
- 이상의 결과에서, 白芷, 梔子 물 추출물 순으로 S. aureus에 대한 항균력을 나타내었으며, 瓜蔞仁 물 추출물은 S. aureus에 대해 별 다른 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다. 또 白芷, 瓜蔞仁, 梔子 물 추출물의 순으로 세포 보호, 항염 또는 항산화 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 표준 액체배지 희석법에 의한 MIC 측정은 세균 및 다양한 감염증에 대한 후보 물질의 항균 활성을 측정하는 가장 기본적인 방법으로, 본 실험에서는 白芷, 梔子 물 추출물 순으로 S. aureus에 대한 항균력을 나타내었으나, 瓜蔞仁 물 추출물은 별 다른 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다.
후속연구
- 이 실험에서 사용된 lincomycin과 piroxicam은 세 가지 약재 물 추출물과 비교했을 때 효과 대비 용량 차이가 많이 난다. 하지만 白芷, 梔子 물 추출물은 분명한 항균 효과가 있는 것으로 관찰되었고, 白芷, 瓜蔞仁, 梔子 물 추출물에도 분명한 항염 효과가 있는 것으로 관찰되었으므로 용량 조절을 잘 한다면 瓜蔞仁, 梔子, 白芷 물 추출물이 lincomycin과 piroxicam의 부작용을 줄일 수 있는 훌륭한 대체물이 될 것으로 기대된다.
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