[논문]발효 애엽(艾葉) 추출물이 인간 간암세포주 HepG2 활성에 미치는 영향

한효상

doi:10.6116/kjh.2013.28.3.107.

발효 애엽(艾葉) 추출물이 인간 간암세포주 HepG2 활성에 미치는 영향
Effect of Fermented Artemisiae Argyi Folium on Human Hepatoma Cell Line HepG2 Activity 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.28 no.3, 2013년, pp.107 - 113

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : The purpose of this study was to investigate the effect of fermented Artemisiae Argyi Folium(AAF) on some activities of human hepatoma cell, HepG2. Method : To investigate the effect of fermented Artemisiae Argyi Folium(AAF) activity on the human hepatoma cells, AAF extracts was fermented by Lactobacillus pentosus K34(AFL) and Sacchromyces cerevisiae STV89(AFS). And the effects of AFL or AFS on the activities of HepG2 cell, such as cell viability, nitric oxide(NO) production and reactive oxygen species(ROS) production, were tested. Result : Human Hepatoma Cells were incubated each for 3 hours and 24 hours. Human Hepatoma Cells treated with the extract was measured with MTT assay. Then AFL was found to be non-toxic at concentrations of 10 ug/mL(3h), 100 ug/mL(24h) or more. AFS was the same result at concentrations of more than 10 ug/mL. The extract increased ROS generation in Human Hepatoma Cells. AFL increased at concentrations of 100 ug/mL more (3h, also 10 ug/mL more) and 50 ug/mL(24h) and AFS increased both 50 ug/mL. In point of NO generation, AFL inhibited at concentrations of 10 ug/mL(3h) and 100 ug/mL(24h) more (3h, also 10 ug/mL more) and AFS also inhibited 50 ug/mL or more. Conclusion : AFL and AFS, obtained from Artemisiae Argyi Folium extracts by fermentation, reduced the NO production and increased ROS production in HepG2 cell, without cytotoxicity on HepG2 cell. The results suggested that AFL and AFS increased the immunological effects of Artemisiae Argyi Folium extracts.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

外用藥으로서의 艾葉 전탕액의 항균 효과¹¹⁾ 및 艾葉 추출물의 항산화작용¹²⁾에 대해서는 이미 많은 연구가 진행되고 있으나, 발효 艾葉 추출물이 인간 간암세포주 HepG2의 면역관련 활성 증진에 효과가 있을 것으로 추정되어 본 연구에서는 吐血, 衄血, 喀血, 便血, 崩漏, 姙娠下血, 月經不調, 痛經, 胎動不安, 心腹冷痛, 泄瀉久痢, 癨亂轉筋, 帶下, 濕疹, 疥癬, 痔瘡 등¹³⁾의 증상을 치료하는데 상용되고 있는 艾葉(Artemisiae Argi Folium)을 발효하여 얻은 추출물(AFL과 AFS)이 인간 간암세포주 HepG2 활성에 미치는 영향을 알아보고 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

제안 방법

AFL과 AFS가 HepG2 cell의 hydrogen peroxide(H₂O₂) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. AFL을 10 µg/mL, 50µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 3시간동안 배양한 결과, 세포내 H₂O₂ 생성률은 각각 97.
AFL과 AFS가 HepG2 cell의 nitric oxide(NO) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. AFL을 10 µg/ml, 50 µg/mL, 100µg/mL, 200 µg/mL 농도로 3시간 처리하였을 때 NO의 생성량은 각각 66.
④ Lactobacillus pentosus K34와 Sacchromyces cerevisiae STV89를 艾葉에 4 %씩 접종하여 Lactobacillus pentosus K34는 37℃에서 Sacchromyces cerevisiae STV89는 30℃에서 4일간 배양하였다.
艾葉을 Lactobacillus pentosus K34(유산균)와 Sacchromyces cerevisiae STV89(효모)로 발효 추출한 후각 각의 추출물 AFL과 AFS로 인간 HepG2 cell의 생존율, 세포내 ROS 생성 그리고 NO 생성에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료 10, 50, 100, 200, 400 µg/mL를 각 well에 처리하고 3시간과 24시간 동안 배양하였다.
NO의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다. 그리스 시약(griess reagent : 0.5 %의 설파닐아미드, 2.5 %의 인산 및 0.5 %의 나프틸에틸렌아민)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성정도를 비교하였다. 다양한 농도의 시료(10, 50, 100, 200 µg/mL)와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 3시간과 24시간동안 37℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 100 µL을 채취하여 여기에 그리스 시약 100 µL을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
다양한 농도의 시료(10, 50, 100, 200 µg/mL)와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 3시간과 24시간동안 37℃, 5 % CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 100 µL을 채취하여 여기에 그리스 시약 100 µL을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
다양한 농도의 시료(10, 50, 100, 200, 400 µg/mL)와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 3시간과 24시간동안 37℃, 5 % CO2 incubator에서 배양한 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
발효미생물은 빠른 增殖性, 물질의 資化性, 다양한 화학활성과 반응의 特異性, 인공변이의 容易性, 높은 均一性, 고온 고압의 不必要 등의 특징을 갖고 있어²⁵⁾ 본 실험에서는 AFL은 Lactobacillus pentosus K34(유산균)를 균주로 이용하여 발효하였고, AFS는 Sacchromyces cerevisiae STV89(효모)를 균주로 이용하여 발효하였다. 이러한 Lactobacillus pentosus K34(유산균)와 Sacchromyces cerevisiae STV89(효모) 균주의 특성상 차이와 관련하여 발효균주에 따른 발효 효과의 차이를 알아보기 위하여 실험을 AFL와 AFS로 나누어 진행하였다.
세포내의 hydrogen peroxide(H₂O₂) 생성은 Roesler 등^17,18)의 방법을 응용, dihydrorhodamine 123(DHR) assay를 이용하여 측정하였다. DHR은 비형광이지만 세포 내에서 세포 내 H₂O₂에 의하여 산화되어 녹색의 형광을 발현하는 물질인 rhodamine 123(R123)로 바뀌게 된다.
세포로부터 생성되는 nitric oxide의 양은 Weissman 등^19,20)의 방법을 응용, 세포배양액 중에 존재하는 NO^2-를 그리스 시약(griess reagent)을 이용, 측정하였다. NO의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다.
본 실험에서는 AFL은 Lactobacillus pentosus K34(유산균)를 균주로 이용하여 발효하였고, AFS는 Sacchromyces cerevisiae STV89(효모)를 균주로 이용하여 발효하였다. 이러한 Lactobacillus pentosus K34(유산균)와 Sacchromyces cerevisiae STV89(효모) 균주의 특성상 차이와 관련하여 발효균주에 따른 발효 효과의 차이를 알아보기 위하여 실험을 AFL와 AFS로 나누어 진행하였다.
이에 著者는 발효한약의 유의성을 적용하여 艾葉을 발효 추출한 후 각 각의 추출물 AFL과 AFS로 인간 HepG2 cell을 이용한 세포 생존율, 세포내 ROS 생성 그리고 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였다.

대상 데이터

각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 CO₂ incubator (NUAIRE, USA), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), air compressor(Tamiya, Japan), homogenizer(Omni, USA), research microscope(Becton dickinson, USA), centrifuge(Hanil, Korea), fume hood(Hanil, Korea), clean bench(Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner(Branson, USA), microplate reader (Bio-Rad, USA), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), water bath(iNtRON biotech., Korea), ice-maker(Vision Scientific Co, Korea) 등이다.
본 실험을 위해서 α-Herbzyme(한국효소, Korea), ethyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), DMSO(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), 1×PBS(Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), isopropanol(Sigma, USA), Trypsin-EDTA(Sigma, USA) 등이 사용 되었다.
실험에 사용된 세포는 human hepatocytes(HepG2 cell line)로서 한국 세포주 은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다.
et Vant.의 잎과 어린 줄기로, 충남 당진군 석문면 초락도에서 생산된 것을 구입하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고, 모든 약재는 쓰기 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.

데이터처리

실험성적은 평균치 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었 으며, 대조군과 각 실험군의 평균의 차이는 Student's t-test 와 ANOVA test로 분석하여 P<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

AFL과 AFS가 HepG2 cell의 생존율에 미치는 영향을 MTT assay 방법으로 비교하였다. AFL을 3 시간 처리한 결과 10µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 316.
발효 艾葉의 제조는 이미 보고한 선행연구¹⁴⁾의 방법에 따라 다음과 같이 시행하였다.
준비된 시료가 HepG2 cells의 세포생존율(cell viability) 에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Mosmann 등^15,16)의 방법을 응용하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×10⁴ cells/well의 cell을 100 µL씩 넣고 37℃, 5 % CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어준다.

성능/효과

1. 발효 艾葉 추출물은 HepG2 cell과 3시간, 24시간 동안 함께 배양한 후 MTT assay를 수행한 결과 AFL은 각각 10 µg/mL, 100 µg/mL 이상의 모든 농도에서 유의하게 독성이 없는 것으로 나타났고, AFS는 모두 10 µg/mL 이상의 모든 농도에서 유의하게 독성이 없는 것으로 나타났다.
2. 발효 艾葉 추출물은 HepG2 cell의 세포내 ROS 생성증가를 3시간, 24시간에서 AFL은 각각 10 µg/mL와 100µg/mL 이상 농도 일 때, 50 µg/mL 농도 일 때 증가시켰고, AFS는 모두 50 µg/mL 이상 농도 일 때 유의하게 증가시켰다.
3. 발효 艾葉 추출물은 HepG2 cell과 3시간, 24시간의 배양에서 NO 생성을 AFL은 각각 10 µg/mL 이상 농도 일때, 10 µg/mL와 100 µg/mL 농도 일 때 억제시켰고, AFS는 3시간 배양에서 10 µg/mL 이상 농도 일 때 유의하게 억제시켰다.
AFL을 10 µg/mL, 50µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 3시간동안 배양한 결과, 세포내 H2O2 생성률은 각각 97.6±7.0%, 101.6±7.8%, 109.6±6.1%, 119.5±2.9%, 124.4±2.7% 로 10 µg/mL 와 100 µg/mL 이상 일 때, AFL을 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 24시간동안 배양한 결과, 세포내 H2O2생성감소를 각각 101.5±3.2%, 103.3±2.9%, 105.9±2.9%, 115.0±3.7%, 132.4±3.4% 로 50 µg/mL 이상 일 때 유의(P<0.05)하게 증가시켰다(Fig. 3).
AFL을 3 시간 처리한 결과 10µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 316.2±72.4%, 356.3±72.5%, 373.6±83.5%, 380.2±92.3%, 327.5±110.3% 로 10µg/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 독성은 나타나지 않았고, AFL을 24 시간 처리한 결과 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 98.5±4.7%, 102.7±4.1%, 109.3±9.3%, 124.9±7.1%, 147.6±7.4% 로 100 µg/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 독성은 나타나지 않았다(Fig. 1).
AFS를 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 3시간동안 배양한 결과, 세포내 H2O2 생성감소를 각각 99.3±5.2%, 102.9±5.7%, 109.6±5.0%, 118.2±5.6%, 132.6±7.9% 로, AFS를 10µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 24시간동안 배양한 결과, 세포내 H2Od 생성률을 각각 99.4±1.3%, 103.7±2.2%, 107.6±2.0%, 126.0±19.0%, 142.0±4.2% 로 모두 50 µg/mL 이상 일 때 유의(P<0.05)하게 증가시켰다(Fig. 4).
AFS를 10 µg/ml, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL 농도로 3시간 처리하였을 때 NO의 생성량은 각각 69.4±10.2%, 76.2±12.2%, 86.4±17.5%, 105.0±19.9%로 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL 일 때 유의한 감소 (P<0.05)를 나타내었으나, AFL을 24시간 처리하였을 때는 Normal 군에 비해 변화가 나타나지 않았다(Fig. 6).
AFS를 3 시간 처리한 결과 10µg/mL, 50 µg/mL, 100µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 446.2±131.0%, 486.2±150.6%, 542.3±149.8%, 583.5±147.0%, 604.4±220.4% 로, AFS를 24 시간 처리한 결과 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 116.5±8.8%, 117.7±10.0%, 138.0±14.9%, 143.1±11.6%, 158.7±5.7% 로 모두 10 µg/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 독성은 나타나지 않았다(Fig. 2).
이상의 결과, 발효 艾葉 추출물 AFL과 AFS는 HepG2 cell에 세포독성을 과도히 유발하지 않으면서 간조직세포의 ROS의 생성을 증가시키고 NO 생성을 감소시키는 등 자가면역질환, 염증질환의 악화를 완화할 수 있는 효과가 있음을 나타내는 것이다. 앞으로 발효 艾葉 추출물의 면역강화작용에 대한 보다 깊은 연구가 필요한 것으로 생각되는 바이다.

후속연구

본 연구에서는 한국 세포주 은행(KCLB, Korea)으로부터 분양받은 HepG2 cells에 발효 艾葉 추출물을 10, 50, 100, 200, 400 µg/mL의 농도로 처리한 뒤에 3시간과 24시간 동안 37℃에서 배양한 후, 세포의 증식을 MTT assay를 이용하여 확인한 결과 대조군에 비하여 발효 艾葉 추출물의 농도가 증가함에 따라 HepG2 cells에 세포생존율 증가를 나타내었으며, 특히 3시간 처리군에서 세포생존율이 유의적으로 증가해 가장 효과적임이 관찰되었으나, 시간별 처리군에 대한 세포생존율은 좀 더 경시적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
이상의 결과, 발효 艾葉 추출물 AFL과 AFS는 HepG2 cell에 세포독성을 과도히 유발하지 않으면서 간조직세포의 ROS의 생성을 증가시키고 NO 생성을 감소시키는 등 자가면역질환, 염증질환의 악화를 완화할 수 있는 효과가 있음을 나타내는 것이다. 앞으로 발효 艾葉 추출물의 면역강화작용에 대한 보다 깊은 연구가 필요한 것으로 생각되는 바이다.
이상의 결과, 발효 艾葉 추출물 AFL과 AFS는 HepG2 cell에 세포독성을 과도하게 유발하지 않으면서 HepG2 cell 의 ROS 생성을 증가시키고 NO 생성을 감소시키는 등 자가면역질환, 염증질환의 증상개선제로서의 응용가능성이 있음을 나타내는 것이며, 앞으로 발효 艾葉 추출물의 면역강화작용에 대한 보다 깊은 연구가 필요한 것으로 생각되는 바이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	艾葉이란 무엇인가?	艾葉은 국화과(菊花科 : Compositae)에 속한 多年生草本 인 황해쑥 Artemisia argyi Lev. et Vant., 쑥 Artemisia princeps Pamp. var. orientalis Hara 또는 산쑥 Artemisia montana Pampani의 잎 및 어린줄기로4), 여름에 꽃이 피기 전에 따서 曬乾한다5).
	최근 발효한약에 대한 관심이 높아진 이유는 무엇인가?	최근 발효한약이 상당한 관심을 모으고 있는데, 그 이유는 일부 또는 다수 한약의 유효성분은 대부분 당이 붙은 고분자로 구성되어있는 경우가 많아 그럴 경우에는 체내 흡수에 지장이 있으나, 발효를 하면 당이 떨어져 나가면서 저분자화 되어 체내흡수율이 증가되기 때문이다1). 따라서 발효한약은 한약재 약효성분의 체내흡수율과 생체 이용률을 모두 극대화시키는 경우가 있고2), 원래의 성질이 변하여 새로운 치료 작용을 나타내는 약물이 얻어지는 경우도 있다3).
	艾葉은 어떠한 효능이 있다고 알려져있는가?	”라고 처음 수재되었고, 東醫寶鑑7)에는 性質이 따뜻하고, 맛은 쓰며 독이 없으며, 온갖 오래된 병과 부인의 崩漏에 주로 쓴다. 胎를 튼튼하게 하고 腹痛·赤白痢와 五臟痔로 피를 쏟는 것을 멎게 하며, 陰部의 疳䘌瘡을 治療하고 새살이 돋게 하며, 風寒邪를 물리치고 姙娠을 할 수 있게 하는 것으로 알려져 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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