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문제 정의
- 본 연구에서는 실험용 쥐의 혈소판에서 측정한 라만 스펙트럼으로 AD를 검출하기 위해 선형 대수를 기반으로 하는 특이값 분해(SVD: singular value decomposition) 를 이용하는 방법을 제안한다. 먼저 측정된 라만 스펙트럼은 가산 잡음(additive noise), 배경 잡음(background)의 제거와 정규화로 구성된 전처리 과정을 수행한다.
- 본 논문에서는 AD가 유도된 형질전환 실험용 쥐에서 채취한 혈소판 라만 스펙트럼을 분석하기 위해 SVD를 의한 기저 스펙트럼의 합성을 이용하는 방법을 제안하였다. 혈소판 라만 스펙트럼의 전처리에는 Savitzky-Golay 필터를 이용한 가산 잡음 제거, 평활화된 도함수 방법으로 배경 잡음을 제거하고 벡터 정규화 방법을 적용하였다.
제안 방법
- 중국 무한대학과 본 연구팀의 공동연구에서 AD가 유도된 형질 변환 실험용 쥐로부터 채취한 혈소판에서 측정한 라만 스펙트럼을 AD 진단에 이용한 이전의 연구 결과가 있다[6-8]. 이 연구들은 몇 가지 전처리를 수행한 라만 스펙트럼에서 특정한 단백질 영역의 피크 비 또는 크기를 특징으로 선택하여 MAP(maximum a posteriori) 또는 MLP(multi-layer perceptron networks) 분류를 이용하여 AD를 검출하였다.
- 본 연구에서는 실험용 쥐의 혈소판에서 측정한 라만 스펙트럼으로 AD를 검출하기 위해 선형 대수를 기반으로 하는 특이값 분해(SVD: singular value decomposition) 를 이용하는 방법을 제안한다. 먼저 측정된 라만 스펙트럼은 가산 잡음(additive noise), 배경 잡음(background)의 제거와 정규화로 구성된 전처리 과정을 수행한다. 전처리된 스펙트럼에서 SVD를 통해 각 클래스의 기저 스펙트럼(basis spectrum)을 얻은 다음 기저를 합성(synthesis)한 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차(root mean square error)를 최소로 하는 클래스로 분류한다.
- 먼저 측정된 라만 스펙트럼은 가산 잡음(additive noise), 배경 잡음(background)의 제거와 정규화로 구성된 전처리 과정을 수행한다. 전처리된 스펙트럼에서 SVD를 통해 각 클래스의 기저 스펙트럼(basis spectrum)을 얻은 다음 기저를 합성(synthesis)한 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차(root mean square error)를 최소로 하는 클래스로 분류한다. 제안한 방법의 유효성을 검증하기 위해 주성분 분석으로 추출한 특징을 MAP, MLP, SVM(support vector machine), 로지스틱 회귀 방법으로 분류한 결과와 비교 분석한다.
- 위에서 설명한 실험용 쥐로부터 신선한 정맥 혈액 시료를 채취하였다. AD와 NR 모델의 혈액 시료가 응고 되는 것을 방지하기 위해 1.4㎽ EDTA가 포함된 각각의 원심 튜브에 배치하였다. 실험용 쥐로부터 채취한 지 30분이내의 혈액 시료 60g을 15분간 원심 분리하여 혈소판 농축 혈장(platelet-rich plasma)을 얻고 혈장은 blood pellet에 놓기 위해 60g을 15분 동안 한 번 더 원심 분리하였다.
- 4㎽ EDTA가 포함된 각각의 원심 튜브에 배치하였다. 실험용 쥐로부터 채취한 지 30분이내의 혈액 시료 60g을 15분간 원심 분리하여 혈소판 농축 혈장(platelet-rich plasma)을 얻고 혈장은 blood pellet에 놓기 위해 60g을 15분 동안 한 번 더 원심 분리하였다. 혈소판은 15분 동안 원심 분리에 의해 모두 1500g이 수집되었다.
- 스펙트럼은 50× long-working-distance objective [numerical aperture (NA) 0.50, Olympus, Japan]로 시료로부터 측정하였고 신호는 혈소판 시료에서 3× 30초 동안 통합(integrate)하였고 wavenumber에 해당하는 측정 범위는 601-1700㎝-1이다.
- 각 스펙트럼들 사이의 상대 강도(relative intensity) 차이에 의한 편차를 최대한 줄이기 위해 스펙트럼의 정규 화(normalization)를 고려할 수 있다. 본 연구에서는 스펙트럼을 하나의 열벡터(column vector)로 간주하고 그 크기가 1이 되도록 놈(norm)으로 벡터를 나누어 단위 벡터 (unit vector)로 변환하는 벡터 정규화 방법을 사용하였다. 를 정규화한 단위 벡터라고 하면 정규화 방법은 다음과 같다.
- 라만 스펙트럼의 측정 또는 전처리 과정에서 발생하는 라만 이동(shift)에 유연하고 강인한 분류를 위해 스펙트럼의 지연(lag)을 도입하여 평균제곱근오차를 계산하였다. 본 실험에서는 스펙트럼 최대 지연을 25㎝-1으로 설정하고[-25 25]㎝-1의 범위로 지연시키며 분류하였다.
- 본 실험에서는 AD 질병이 유도된 형질 변환 실험용 쥐와 NR 실험용 쥐의 혈소판에서 측정한 278개의 라만 스펙트럼에 전처리 과정을 수행한 데이터를 훈련 그룹과 테스트 그룹으로 나누었다. 전체 데이터를 k개의 그룹으로 나눈 다음 한 그룹을 테스트 그룹, 남은 k-1개의 그룹은 훈련 데이터로 사용된다.
- 혈소판 라만 스펙트럼의 전처리에는 Savitzky-Golay 필터를 이용한 가산 잡음 제거, 평활화된 도함수 방법으로 배경 잡음을 제거하고 벡터 정규화 방법을 적용하였다. 전처리한 라만 스펙트럼은 SVD 알고리즘을 이용하여 AD와 NR의 기저 스펙트럼을 결정한 다음 선형 합성 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차를 최소로 하는 클래스로 분류하였다. 실험 결과에 따르면 제안한 방법의 평균 분류율은 약 97.
대상 데이터
- 4개월령(초기 단계)과 12개월령(진행 단계)의 AD 모델을 위한 각 5마리씩 총 10마리의 human amyloid precursor protein 695: (HuAPP695; K670N/M671L)의 Swedish mutation으로 유전자가 변형된 실험용 쥐 tg2579는 미국의 잭슨 연구소(Jackson Lab)에서 구입하였다. NR 모델을 위한 실험용 쥐 8마리는 transgene-negative인 한배 새끼(littermate)를 사용하였다.
- 4개월령(초기 단계)과 12개월령(진행 단계)의 AD 모델을 위한 각 5마리씩 총 10마리의 human amyloid precursor protein 695: (HuAPP695; K670N/M671L)의 Swedish mutation으로 유전자가 변형된 실험용 쥐 tg2579는 미국의 잭슨 연구소(Jackson Lab)에서 구입하였다. NR 모델을 위한 실험용 쥐 8마리는 transgene-negative인 한배 새끼(littermate)를 사용하였다. 모든 실험용 쥐는 오전 7시부터 오후 7시까지 12시간만을 빛에 노출되는 주기로 우리(cage)에서 길러졌다[7].
- 위에서 설명한 실험용 쥐로부터 신선한 정맥 혈액 시료를 채취하였다. AD와 NR 모델의 혈액 시료가 응고 되는 것을 방지하기 위해 1.
- 라만 스펙트럼 측정에는 최대 정보 처리량, 검출 감도, 형광 억제에 대해 최적화된 Horiba Jobin Yvon Raman microspectrometer (system HR800, Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d’Ascq, France)를 사용하였다. 라만 여기에는 간 조직 시료에 파장이 632.8㎚에서 13.6㎽의 출력과 혈소판 시료에 파장이 633㎚에서 17㎽의 출력을 제공하는 He-Ne 레이저를 사용하였다. 프리즘과 필터를 통과하여 감쇠(attenuation)된 시료에 노출되는 레이저의 강도는 조직의 열화로 이어지기에 거의 불가능한 약 1㎽이다.
- 그림의 확대한 영역의 평균 이동 필터보다 Savitzky-Golay 필터가 피크를 잘 보존하고 있는 것을 확인할 수 있다. 본 연구에서 사용한 필터의 길이(span)은 9이다.
- 이 방법은 고주파 성분을 나타내는 분석물의 피크를 포함하는 스펙트럼의 부분을 확인할 수 있다면 성공적으로 피크를 제거하고 보간(interpolation)하여 배경 잡음을 추정할 수 있다[10]. 본 연구에서는 스펙트럼의 도함수의 평활화를 위한 이동 평균 필터의 길이로 45를 설정하여 사용하였다. 분광기로 측정된 AD의 라만 스펙트럼과 배경 잡음을 제거한 스펙트럼의 한 예를 Fig.
- 이러한 방법으로 모든 그룹이 테스트 그룹으로 사용될 때까지 k번 반복하는 k-fold 교차 확인(cross validation) 방법으로 실험하였다. 실험에서 사용한 k는 5이며 이에 따른 훈련 그룹과 테스트 그룹의 데이터 수의 평균은 AD가 각각 114개와 29개이고 NR은 108개와 27개이다.
데이터처리
- 측두 대뇌 회백질(temporal cortex grey matter)로부터 측정한 라만 스펙트럼에서 1670㎝-1 영역의 피크로 AD와 정상(NR: normal) 구별할 수 있고, 특히 1450과 1670㎝-1의 비(ratio)는 조직 내의 지질과 단백질의 비와 관계가 있으며 AD와 관계된 조직 변화를 추적할 수 있다는 스펙트럼 분석 결과가 있다[4]. 또한 이 연구에서는 주성분 분석(principal components analysis)을 통한 2개의 주성분으로 로지스틱 회귀(logistic regression) 방법을 이용하여 AD를 진단하였다.
- 전처리된 스펙트럼에서 SVD를 통해 각 클래스의 기저 스펙트럼(basis spectrum)을 얻은 다음 기저를 합성(synthesis)한 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차(root mean square error)를 최소로 하는 클래스로 분류한다. 제안한 방법의 유효성을 검증하기 위해 주성분 분석으로 추출한 특징을 MAP, MLP, SVM(support vector machine), 로지스틱 회귀 방법으로 분류한 결과와 비교 분석한다.
- 분류 실험에서는 SVD에 의해 AD와 NR 훈련 그룹의 기저 스펙트럼을 얻고 합성 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차를 최소로 하는 클래스를 선택한다. 라만 스펙트럼의 측정 또는 전처리 과정에서 발생하는 라만 이동(shift)에 유연하고 강인한 분류를 위해 스펙트럼의 지연(lag)을 도입하여 평균제곱근오차를 계산하였다. 본 실험에서는 스펙트럼 최대 지연을 25㎝-1으로 설정하고[-25 25]㎝-1의 범위로 지연시키며 분류하였다.
- 본 연구에서 제안한 SVD를 이용한 기저 스펙트럼으로 AD를 검출 성능을 검증하기 위해 주성분 분석으로 추출한 특징에 MAP, MLP, SVM, 로지스틱 회귀 방법을 이용한 분류 결과와 비교하여 Table 1에 요약하였다. 비교 실험에 사용한 주성분의 수는 SVD에 의한 기저 스펙트럼의 수와 같은 12개이다.
이론/모형
- 라만 스펙트럼 측정에는 최대 정보 처리량, 검출 감도, 형광 억제에 대해 최적화된 Horiba Jobin Yvon Raman microspectrometer (system HR800, Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d’Ascq, France)를 사용하였다.
- 이 방법은 사용하기에 단순하지만 스펙트럼 피크의 크기를 변경한다는 단점을 지닌다. 본 연구에서는 고주파 잡음의 제거에 Savitzky-Golay 필터를 사용하였다. 이 필터는 분광 데이터의 라인의 폭에서 가장 높은 지점인 피크를 보존하는데 효과적이다[9].
- 라만 스펙트럼의 기준선(baseline) 또는 배경 잡음은 특정한 분자 구조에 연원하지 않은 광범위한 스펙트럼의 특징을 보이며 그 변화가 완만한 저주파 성분이다. 본 연구에서는 배경 잡음을 제거하기 위해 평활화된 도함수(smoothed derivative) 방법을 사용하였다. 이 방법은 고주파 성분을 나타내는 분석물의 피크를 포함하는 스펙트럼의 부분을 확인할 수 있다면 성공적으로 피크를 제거하고 보간(interpolation)하여 배경 잡음을 추정할 수 있다[10].
- 한 번의 분류 실험이 종료되면 그 데이터는 훈련 그룹에서 테스트 그룹으로 이동되고 기존의 테스트 그룹은 훈련 그룹으로 이동된다. 이러한 방법으로 모든 그룹이 테스트 그룹으로 사용될 때까지 k번 반복하는 k-fold 교차 확인(cross validation) 방법으로 실험하였다. 실험에서 사용한 k는 5이며 이에 따른 훈련 그룹과 테스트 그룹의 데이터 수의 평균은 AD가 각각 114개와 29개이고 NR은 108개와 27개이다.
- 본 논문에서는 AD가 유도된 형질전환 실험용 쥐에서 채취한 혈소판 라만 스펙트럼을 분석하기 위해 SVD를 의한 기저 스펙트럼의 합성을 이용하는 방법을 제안하였다. 혈소판 라만 스펙트럼의 전처리에는 Savitzky-Golay 필터를 이용한 가산 잡음 제거, 평활화된 도함수 방법으로 배경 잡음을 제거하고 벡터 정규화 방법을 적용하였다. 전처리한 라만 스펙트럼은 SVD 알고리즘을 이용하여 AD와 NR의 기저 스펙트럼을 결정한 다음 선형 합성 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차를 최소로 하는 클래스로 분류하였다.
성능/효과
- 비교 실험에 사용한 주성분의 수는 SVD에 의한 기저 스펙트럼의 수와 같은 12개이다. SVD, MAP, MLP, SVM, 로지스틱 회귀 분류 실험에서 분류 오류 데이터의 수는 각 6.7, 27.6, 23.5, 27.2, 24.0개이며 평균 분류율은 각 97.6%, 90.1%, 91.5%, 90.2%, 91.4%이다. 실험 결과에서 제안한 방법은 다른 방법들보다 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)에서 더 나은 결과를 보인다.
- 실험 결과에서 제안한 방법은 다른 방법들보다 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)에서 더 나은 결과를 보인다. 부정 오류율(false negative rate)에서 제안한 방법은 2.8%이고 로지스틱 회귀가 8.9%로 약 6.1%의 성능의 차이를 보였다. 또한 긍정 오류율(false positive rate)에서 SVM보다 약 1.
- 1%의 성능의 차이를 보였다. 또한 긍정 오류율(false positive rate)에서 SVM보다 약 1.8%가 감소한 결과를 나타냈다. 제안한 방법의 평균 분류율은 다른 방법들 중 가장 좋은 성능을 보인 MLP의 평균 분류율보다 약 6.
- 8%가 감소한 결과를 나타냈다. 제안한 방법의 평균 분류율은 다른 방법들 중 가장 좋은 성능을 보인 MLP의 평균 분류율보다 약 6.1%의 성능이 향상된 것으로 나타났다. 이 결과로부터 제안한 방법은 혈소판 라만 스펙트럼으로 AD를 검출하는 시스템에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다.
- 1%의 성능이 향상된 것으로 나타났다. 이 결과로부터 제안한 방법은 혈소판 라만 스펙트럼으로 AD를 검출하는 시스템에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다.
- 전처리한 라만 스펙트럼은 SVD 알고리즘을 이용하여 AD와 NR의 기저 스펙트럼을 결정한 다음 선형 합성 스펙트럼과 분류 스펙트럼의 평균제곱근오차를 최소로 하는 클래스로 분류하였다. 실험 결과에 따르면 제안한 방법의 평균 분류율은 약 97.6%로 주성분 분석으로 추출한 특징에 MAP, MLP, SVM 또는 로지스틱 회귀 방법을 이용한 경우 중 가장 좋은 성능을 보인 MLP 방법의 평균 분류율 약 91.5%보다 약 6.1% 정도의 우수한 성능을 보였다. 제안한 방법은 선형 대수학을 기반으로 하므로 다른 알고리즘을 사용하는 경우보다 연산 속도가 빠르고 실험 결과에서 보인 분류 정확도를 감안하면 AD의 빠르고 정확한 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 1% 정도의 우수한 성능을 보였다. 제안한 방법은 선형 대수학을 기반으로 하므로 다른 알고리즘을 사용하는 경우보다 연산 속도가 빠르고 실험 결과에서 보인 분류 정확도를 감안하면 AD의 빠르고 정확한 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 라만 스펙트럼의 전체 영역을 사용한 이 연구 결과를 토대로 AD의 검출에 변별력이 있는 지역을 결정하고 이 지역에 대해 차별성이 있는 전처리와 스펙트럼 분석을 통해 분류 성능을 향상시키는 연구를 진행 중이다.
- 제안한 방법은 선형 대수학을 기반으로 하므로 다른 알고리즘을 사용하는 경우보다 연산 속도가 빠르고 실험 결과에서 보인 분류 정확도를 감안하면 AD의 빠르고 정확한 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 라만 스펙트럼의 전체 영역을 사용한 이 연구 결과를 토대로 AD의 검출에 변별력이 있는 지역을 결정하고 이 지역에 대해 차별성이 있는 전처리와 스펙트럼 분석을 통해 분류 성능을 향상시키는 연구를 진행 중이다.
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