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문제 정의
- 따라서 본 연구는 먹이생물 배양현장에서 초기 먹이생물로서 중요하게 이용되고 있고 아직도 해수산 chlorella로 불려지고 있는 해양미세조류인 Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae, 진안점조강, 眞眼點藻鋼)를 이용하여 염분농도에 따른 지방산의 변화를 관찰하고, 고도불포화지방산의 변화를 바탕으로 먹이생물로서의 지질영양학적 측면에서 평가하고자 한다.
제안 방법
- 추출된 지질 100 mg을 넣은 후, 1차적으로 극성용매인 chloroform 10 mL를 천천히 주사기로 주입한 후, 2차적으로 chloroform : methanol (49:1, v/v)로 혼합한 용매 10 mL 주입하여 극성 지질을 분리하였다. SEP-PAK silica cartridge에 남아있는 비극성 지질을 얻기 위해 다른 둥근 플라스크를 놓고 비극성 용매인 methanol을 20 mL를 천천히 주입하여 비극성지질을 분리하였다.
- 다음날 chloroform 층만을 분리하기 위하여 둥근 플라스크 위에 깔때기를 놓고, 여과지를 깔아 그 위에 Na2SO4를 넣어 서서히 chloroform층만 흘러내리게 하였다. 분리된 chloroform층은 진공회전농축기(Rotavapor R-114, BUCHI)를 사용하여 40℃이하에서 용매를 완전히 증발시킨 후, 추출된 총 지질의 무게를 측정하였다. 모든 작업은 질소 기류 하에서 행하였다.
- 실험배양 조건으로서 온도는 20±1℃, 광주기는 18L: 6D, 주간의 조도는 6,000-8,000 Lux로 유지하였고, Air는 0.20 μm sterilized air filter (Advantec mfs, Inc. Japan)를 통해 공급하였다.
- Japan)를 통해 공급하였다. 염분농도는 여과해수와 증류수를 이용하여 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 실시하였다. 실험에 사용한 배지는 Table 1에 나타낸 바와 같이 F/2배지 (Guillard and Ryther, 1962)를 사용하였으며, 121℃에서 20분간 고압멸균하였다.
- 0 kg/cm2)을 사용하였고, 이때 Split ratio은 1:50였다. 지방산의 분석은 동일조건에서 분석한 표준품의 ECL과 비교하여 동정하였고, 지방산 표준품은 14:0, 16:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 22:1, 24:0 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA)과 GC-MS로 동정된 menhaden oil을 사용하였다.
- 초기 접종밀도는 100×104 cells/mL로 10일간 3반복으로 배양하였고, 매일 동일한 시간에 Haemacytometer로 3회 반복 계수하여 평균 세포수를 측정하였으며, 배양이 완료된 배양액은 4℃의 고속원심분리기(UNION 32R, Hanil Science Industrial Co., Ltd. Korea)에서 3,000 rpm으로 25분간 원심분리한 후, 배양액은 버리고 세포만 회수하여 동결 건조하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 해양미세조류 Nannochloropsis oculata는 경상대학교 해양과학대학 해양생물사료 공학연구실에 보관 중인 원종을 사용하였다.
- 염분농도는 여과해수와 증류수를 이용하여 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 실시하였다. 실험에 사용한 배지는 Table 1에 나타낸 바와 같이 F/2배지 (Guillard and Ryther, 1962)를 사용하였으며, 121℃에서 20분간 고압멸균하였다. 초기 접종밀도는 100×104 cells/mL로 10일간 3반복으로 배양하였고, 매일 동일한 시간에 Haemacytometer로 3회 반복 계수하여 평균 세포수를 측정하였으며, 배양이 완료된 배양액은 4℃의 고속원심분리기(UNION 32R, Hanil Science Industrial Co.
데이터처리
- 모든 자료는 SPSS (12.0) 프로그램을 이용하여 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 평균간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.
이론/모형
- 총 지질 추출은 Bligh and Dyer (1959) 방법에 준하였다. 균체 중에 지질 추출 시료를 비커에 5 g 취하여 세포분쇄기(Homogenizer AM-12, Nihonseiki Kaisha Ltd.
- 총 지질의 극성 지질과 비극성 지질의 분획은 Juaneda and Rocquelin (1985)방법에 준하여, SEP-PAK silica cartridge(Waters Association, Milford, MA)를 사용하였다. 추출된 지질 100 mg을 넣은 후, 1차적으로 극성용매인 chloroform 10 mL를 천천히 주사기로 주입한 후, 2차적으로 chloroform : methanol (49:1, v/v)로 혼합한 용매 10 mL 주입하여 극성 지질을 분리하였다.
성능/효과
- 26. 18.63, 18.17, 17.79, 18.15 그리고 17.53%로 나타났으며 0 psu와 50 psu를 제외한 10, 20, 30 40 psu에서는 유의차가 없는 것으로 나타났다. 중성지질의 경우 30 psu구에서는 총지질의 15.
- 그러나 염분농도가 40 그리고 50 psu으로 높아질수록 극성지질의 함량은 각각 86.92%와 89.13%로 증가되는 경향을 보였으며(P<0.05), 또한 염분농도가 10 그리고 0 psu로 낮아질수록 각각 87.68% 그리고 91.65%로 증가되는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 극성지질의 경우에는 Table 5에 나타낸 바와 같이 SFA는 29.80-39.80%으로 큰 유의차를 나타냈으며, MOFA는 28.99-36.10%으로 변하였으며, PUFA는 27.44-41.20%으로 현저한 변화를 가져왔다. 이러한 변화는 PUFA의 대표적인 지방산인 EPA가 16.
- 극성지질의 함량은 자연해수의 염분농도와 가장 비슷한 30 psu구에서 총 지질의 84.45%로 가장 낮게 나타났으며 20 psu구에서 85.01%로 유의적인 차이는 보이지 않았다(P<0.05).
- 또한 EPA의 경우는 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 각각 34.35, 29.91, 29.68, 25.61, 23.13 그리고 19.18%로 염분농도가 낮아질수록 EPA함량은 증가하는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 또한 EPA의 경우는 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 33.74%로 가장 높았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 31.71, 31.60, 28.59, 28.34 그리고 28.21%로 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 또한 염분농도가 20, 10 그리고 0 psu로 낮아질수록 각각 14.99%, 12.32% 그리고 8.35%로 낮아지는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 18% 범위로서 변화가 없었는데 비해서 MOFA (monounsaturated fatty acid)와 PUFA (polyunsaturated fatty acid)는 현저한 변화를 가져왔다. 변화의 상태도 달라서 MOFA는 염분농도가 증가함에 따라 증가하였지만, PUFA는 오히려 감소하는 역상관 관계를 나타냈다. Table 3에 의하면 염분농도 20 psu의 총 지질의 지방산 조성에서 16:0, 16:1n-7와 20:5n-3 (EPA)가 전체지방산의 78% 이상으로 대부분을 차지하고 있다.
- 염분농도 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 배양한 결과 포화지방산의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 27.95%로 가장 낮았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 30.00, 30.82, 34.56, 34.28 그리고 36.29%로 증가하는 것으로 나타났으며(P<0.05), 불포화지방산의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 72.05%로 가장 높았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 70.01, 69.18, 65.43, 65.71 그리고 63.70%로 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 염분농도 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 배양한 결과 포화지방산의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 29.80%로 가장 낮았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 30.58, 30.78, 34.40, 36.45 그리고 39.80%로 높아졌으며(P<0.05), 불포화지방산의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 70.19%로 가장 높았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 69.43, 69.22, 65.60, 63.54 그리고 60.20%로 낮아지는 경향을 보였다(P<0.05).
- 염분농도는 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 배양한 결과는 포화지방산의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 33.91%로 가장 낮게 나타났으며, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 34.81, 34.20, 36.36, 37.71 그리고 38.18%로 높아지는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 염분농도에 따른 N. oculata의 배양 결과는 20 psu구에서 가장 높은 성장률을 보였으며 30, 40, 10, 0, 50 psu 순으로 나타났다(P<0.05).
- 염분농도에 따른 총지질의 지방산 조성은 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 포화지방산은 염분농도의 증감에 상관없이 33.91-38.18% 범위로서 변화가 없었는데 비해서 MOFA (monounsaturated fatty acid)와 PUFA (polyunsaturated fatty acid)는 현저한 변화를 가져왔다. 변화의 상태도 달라서 MOFA는 염분농도가 증가함에 따라 증가하였지만, PUFA는 오히려 감소하는 역상관 관계를 나타냈다.
- 염분농도의 증가가 오메가-3 고도불포화지방산의 대표 지방산인 EPA의 합성을 억제하는 것으로 나타났다. 미세조류의 지방산 조성에 영향을 미치는 환경인자로서 염분외에 온도가 있다.
- 오메가-3 계열의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu 실험구에서 35.29%로 가장 높았으며, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 30.78, 29.45, 24.43, 21.46 그리고 16.47%로 낮아지는 경향을 보였다(P<0.05).
- 오메가-3 계열의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 33.74%로 가장 높게 나타났으며, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 31.71, 31.60, 28.59, 28.34 그리고 28.21%로 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 오메가-3 계열의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 34.35%로 가장 높았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 29.91, 29.68, 25.61, 23.13 그리고 19.18%로 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 오메가-6 계열의 경우 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 8.66%로 나타났고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 9.62, 9.45, 8.50, 4.93 그리고 3.73%로 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 하지만 polyunsaturated fatty acid (PUFA)와 ecosapentanoic acid(EPA)의 경우는 염분농도가 증가함에 따라 지방산 비율이 감소하는 것으로 나타났다. 이로서 먹이생물의 영양학적으로 중요한 EPA함량은 염분농도가 높아질수록 감소하는 것으로 나타났다. 이로서 영양학적인 측면에서는 염분농도를 낮추어서 배양하는 것이 EPA함량을 증가시키는 방법으로 나타났다.
- 이상의 결과를 종합하면 N. oculata의 염분농도에 의한 지방산의 변화는 염분농도가 증가함에 따라 PUFA가 감소하였으며, 이러한 감소는 극성지질 중의 PUFA의 감소에 일어났으며, 극성지질의 지방산의 감소 원인은 EPA 지방산의 감소가 주된 원인으로 나타났다.
- 이상의 고찰을 종합하면 염분농도 증가에 따른 총 지질 중의 PUFA의 현저한 감소 현상이 일어났으며, 이러한 감소 원인은 비극성 지질이 아닌 극성지질의 지방산조성에 의해 감소 되는 것으로 나타났다. 이러한 극성지질의 감소 원인 지방산은 오메가-3 고도불포화지방산인 EPA이었다.
- 지질의 종류(lipid class)는 최적 성장 염분도인 20 psu에서 중성지질이 14.99%인데 비해서 극성지질이 85.01%로 N. oculata의 지질 성분은 극성지질이 대부분인 것으로 나타났다.
- 총 지질의 함량도 10-30 psu의 범위를 나타내어 최적 성장도를 나타내는 염분농도에서 생리적으로 최적 상태가 지질 생합성의 최적 상태를 반영한 것으로 생각된다. 총 지질 함량은 Table 2에서 나타낸 바와 같이 염분농도 10 psu 에서의 가장 높게 나타났지만 비극성 지질의 증가보다는 극성지질 증가가 큰 것으로 나타났다. 이러한 극성지질의 증가는 염분농도에 따른 극성지질 중에 인지질의 변화에 의한 것인지 아니면 당지질의 변화에 의한 것인지 에 대한 연구가 더욱 이루어져야 할 것으로 사료되며 염분농도에 따른 지질의 변화는 극성지질의 변화가 중요하게 작용한다고 생각된다.
- Nannochloropsis oculata의 성장을 위한 최적 염분농도는 20 psu였다. 총 지질의 함량도 10-30 psu의 범위를 나타내어 최적 성장도를 나타내는 염분농도에서 생리적으로 최적 상태가 지질 생합성의 최적 상태를 반영한 것으로 생각된다. 총 지질 함량은 Table 2에서 나타낸 바와 같이 염분농도 10 psu 에서의 가장 높게 나타났지만 비극성 지질의 증가보다는 극성지질 증가가 큰 것으로 나타났다.
- 특히, 16:1n-7의 경우는 0, 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu에서 각각 19.67, 21.73, 21.70, 23.45, 24.49 그리고 26.92%로 염분농도가 증가할수록 증가하는 것으로 나타났으며(P<0.05), 또한 EPA의 경우는 염분농도가 가장 낮은 0 psu구에서 35.29%로 가장 높았고, 염분농도가 10, 20, 30, 40 그리고 50 psu로 높아질수록 각각 30.78, 29.45, 24.43, 21.46 그리고 16.47%로 낮아지는 경향을 나타내었다(P<0.05).
- oculata는 rotifer의 영양강화제로 많이 사용되고 있다. 해수자치어의 필수지방산인 n-3 PUFA의 함량, 특히 EPA의 함량을 높인다는 측면에서는 염분농도를 낮추어서 20 psu에서 배양하는 것이 가장 적합한 것으로 나타났다.
후속연구
- 총 지질 함량은 Table 2에서 나타낸 바와 같이 염분농도 10 psu 에서의 가장 높게 나타났지만 비극성 지질의 증가보다는 극성지질 증가가 큰 것으로 나타났다. 이러한 극성지질의 증가는 염분농도에 따른 극성지질 중에 인지질의 변화에 의한 것인지 아니면 당지질의 변화에 의한 것인지 에 대한 연구가 더욱 이루어져야 할 것으로 사료되며 염분농도에 따른 지질의 변화는 극성지질의 변화가 중요하게 작용한다고 생각된다.
- , 1985), 본 연구결과에서는 수온이 지방산의 변화에 미치는 영향과는 다르게 나타났다. 이러한 차이점에 대해서는 미세조류의 극성지질은 인지질과 당지질로 구성되어 있고, 당지질의 함량이 더 높기 때문에 이들 지질class 중의 어느 쪽 지질이 더 크게 영향을 받았는지에 대해서는 향후의 연구가 필요하다.
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