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제 2형 당뇨모델 OLETF 랫드에서 동충하초의 항당뇨 효과
Anti-diabetic Effects of Isaria tenuipes in OLETF Rats as an Animal Model of Diabetes Mellitus Type II 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.28 no.2, 2013년, pp.152 - 157  

서동석 (충북대학교 수의과대학 실험동물의학교실) ,  강종구 (충북대학교 수의과대학 실험동물의학교실) ,  정미혜 (농촌진흥청) ,  권민 (신성대학교) ,  박철범 (호서대학교)

초록
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본 연구는 동충하초(Isaria tenuipes)를 유전적 당뇨 질환 동물모델인 OLETF 랫드에서 4주간 경구 투여하여 항당뇨 효과에 대한 연구결과로써, OLETF 랫드 동충하초(Isaria tenuipes) 투여군은 당뇨대조군과 비교하여 투여 4주에는 사료 섭취량과 체중이 증가하였다. 이는 동충하초(Isaria tenuipes)를 섭취한 OLETF 랫드는 고지방식 사료만 섭취한 OLETF 랫드에 비해 당뇨 유발이 개선된 결과로 판단된다. 혈중 포도당 농도, 인슐린 농도 및 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR 수치가 용량 의존적으로 감소하였다. 또한 GLUT4 유전자 발현을 측정한 결과 대조군에 비해 동충하초(Isaria tenuipes) 투여군의 mRNA 및 단백질이 용량 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 따라서, 동충하초(Isaria tenuipes)의 섭취가 제2형 당뇨에서 인슐린의 감수성이나 저항성에 영향을 미치고, 혈당을 강화시키는 것으로 사료되므로 당뇨병환자의 혈당저하에 기여할 것이라 기대한다. 이에 본 연구는 천연물질을 이용한 당뇨병의 예방 및 치료에 동충하초(Isaria tenuipes)를 사용할 수 있는 이론적 토대를 제공할 것으로 생각된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

We evaluated the anti-diabetic effects of Isaria tenuipes in diabetes mellitus type 2. For the experiments, the diabetic animal model OLETF rats were divided to 4 groups: Isaria tenuipes was administered mixed with the high fat diet 45% at dose levels of 0.0%, 0.1%, 1.0%, and 5.0% for 4 weeks. All a...

주제어

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제안 방법

  • GLUT-4 단백질 발현 변화를 확인하기 위해서 랫드의 비복근으로부터 단백질을 추출하였다. 단백질의 추출은 protein inhibitor가 함유 된 RIPA buffer를 10 mg당 300 µl 넣어 homogenizer를 이용하여 추출하였다.
  • OLETF 랫드에서의 동충하초(Isaria tenuipes) 투여에 의한 포도당 내성효과를 확인하기 위해 동충하초(Isaria tenuipes) 혼이 투여 4주 후 경구 당부하 검사를 실시하였다. 모든 동물에서 포도당을 경구 투여한 후 60분에 가장 높은 혈당을 보였고 이후 서서히 감소하여 180분에 공복 혈당 수준으로 회복되었다.
  • 5 µl의 2x SYBR Premix Ex Taq (Takara BIO Inc, Japan), 1 µg cDNA를 사용하여 양을 25 µl를 맞추어 실시했다. Smart cycler (Cepheid, CA, U.S.A)를 이용하여 PCR하였고, nonspecific double-stranded DNA binding dye인 SYBR green I을 사용하여 방출되는 형광을 smart cycler software를 이용하여 분석 하였다. GLUT-4 mRNA의 primer는 Forward: 5'-CCG AAA GAC TCT AAA GCG CCT-3'; Reverse: 5'-CGT TTC TCA TCC TTC AGC TCA-3'을 이용하였으며, β-actin의 primer는 Forward: 5'-ACC AAC TGG GAC CAT ATG GAG AAG A-3'; Reverse: 5'-TAC GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA A-3'를 이용하였다.
  • glucose transport(GLUT-4) mRNA 발현량을 분석하기 위해 랫드의 비복근으로부터 Trizol® (Invitrogen Corp., CA, U.S.A)을 이용하여 mRNA를 분리하여 reverse transcriptases(RT, Promega Corp., WI, U.S.A)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
  • 0%에서 독성학적인 변화는 관찰되지 않았다. 그러므로, 본 연구에도 5.0%를 고용량 투여군으로 설정한 후 1.0% 중용량 투여군, 0.1% 저용량 투여군 및 아무런 처치도 하지 않은 대조군을 설정하였다. 실험물질의 투여는 21주령부터 매일 4주간 사료와 혼이 투여하였다.
  • 단백질의 추출은 protein inhibitor가 함유 된 RIPA buffer를 10 mg당 300 µl 넣어 homogenizer를 이용하여 추출하였다. 단백질의 정량은 Micro BCATM protein assay kit (Thermo fisher science Inc., MA, U.S.A)를 사용하였으며, 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)를 이용하여 전기영동하였다. Polyacrylamide의 단백질은 nitrocellulose membrane (Bio-Rad Lab.
  • Otsuka LongEvans Tokushima Fatty (OLETF) 랫드는 자발적으로 제2형 당뇨병이 발생하고 점차 당뇨병성 사구체경화증으로 진행하는 동물모델로 경도의 비만과 18주령 이후에 발생하는 고혈당 및 당뇨병의 만성합병증 등 사람의 제 2형 당뇨병과 비슷한 경과를 취하는 동물로 알려져 있다9-11). 본 연구에서는 제2형 당뇨 모델 쥐에 동충하초(Isaria tenuipes)의 효과를 알아보고자 OLETF 랫드를 사용하여 4주간 투여한 후 당뇨의 임상적 지표로 알려진 혈당, 체중, 식이섭취량의 변화와 인슐린 분비능, 포도당내성능 및 glucose transport(GLUT-4) mRNA 발현량을 분석하였다.
  • 실험동물은 랫드용 폴리카보네이트(500 × 300 ×200 mm)에 2마리씩 넣어 사육하였고, 음수와 사료는 자유로이 급여하였다. 시험동물은 체중을 기초로 해서 군별 체중편차가 최소화 되도록 군분리하였다. 본 연구의 앞서 진행된 90일 반복투여독성시험에서 한계투여용량인 5.
  • 시험물질 투여 종료 후 혈당 및 인슐린 농도의 변화를 분석하기 위해 부검 시에 복대동맥으로부터 혈액을 채취하여 4℃에서 3000 rpm으로 원심분리 후 혈청만을 취해 분석하였다. 혈당의 측정은 자동분석기(INTEGRA 400, Roche, Germany)를 이용하였고, 인슐린 농도는 ELISA법(Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA kit, Sweden)을 이용하여 측정하였다.
  • 시험물질 투여에 의한 실험동물의 주요장기에 미치는 영향을 보고자 간, 신장, 비장 및 심장에 대한 장기무게를 측정하였다.
  • 실험기간 동안 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상 임상증상을 관찰하였다. 실험동물의 체중 증가량은 주 1회씩 일정 시간에 전 실험기간 동안 측정하였으며, 실험개시 일의 체중을 4주 후의 최종 체중을 감하여 체중변화량을 산출하였다.
  • 실험동물의 체중 증가량은 주 1회씩 일정 시간에 전 실험기간 동안 측정하였으며, 실험개시 일의 체중을 4주 후의 최종 체중을 감하여 체중변화량을 산출하였다. 실험기간 동안 주 1회씩 사료섭취량을 측정하였으며, 하루 섭취량의 산출은 사육케이지별로 하루 동안 제공된 사료량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
  • 포도당 내성능을 평가하기 위하여 당부하 검사를 실시하였다. 실험동물을 검사 전 12시간 절식 후 glucose 2 g/ kg 용량을 경구 투여하였다. 혈액을 투여 전, 투여 후 30분, 60분, 90분, 120분, 180분 및 300분에 꼬리 정맥을 통하여 채혈한 다음 혈당측정기(ACCU-CHEK Performa, Roche)를 이용하여 측정하였다.
  • 실험기간 동안 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상 임상증상을 관찰하였다. 실험동물의 체중 증가량은 주 1회씩 일정 시간에 전 실험기간 동안 측정하였으며, 실험개시 일의 체중을 4주 후의 최종 체중을 감하여 체중변화량을 산출하였다. 실험기간 동안 주 1회씩 사료섭취량을 측정하였으며, 하루 섭취량의 산출은 사육케이지별로 하루 동안 제공된 사료량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
  • 인슐린 기능개선 효과를 확인하기 위해 랫드의 비복근으로부터 glucose transport(GLUT-4) mRNA와 단백질 발현량을 분석하였다13).
  • 임상증상 관찰, 체중 및 사료 섭취량에 미치는 영향 - OLETF 랫드에서 4주간 동충하초(Isaria tenuipes)를 투여하는 동안 매일 임상증상을 관찰하였고 동충하초(Isaria tenuipes) 투여 종료 시에 체중 및 사료섭취량에 대한 변화를 관찰하였다. 모든 실험동물에서 전체 시험기간 동안 사망동물 및 임상증상이 관찰된 동물은 없었다(Table 2).
  • 실험동물을 검사 전 12시간 절식 후 glucose 2 g/ kg 용량을 경구 투여하였다. 혈액을 투여 전, 투여 후 30분, 60분, 90분, 120분, 180분 및 300분에 꼬리 정맥을 통하여 채혈한 다음 혈당측정기(ACCU-CHEK Performa, Roche)를 이용하여 측정하였다.

대상 데이터

  • GLUT-4 mRNA의 primer는 Forward: 5'-CCG AAA GAC TCT AAA GCG CCT-3'; Reverse: 5'-CGT TTC TCA TCC TTC AGC TCA-3'을 이용하였으며, β-actin의 primer는 Forward: 5'-ACC AAC TGG GAC CAT ATG GAG AAG A-3'; Reverse: 5'-TAC GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA A-3'를 이용하였다.
  • A)으로 transfer하여 사용하였다. Primary antibody는 rabbit anti-rat GLUT-4 antibody (1:2,500 dilution) (Abcam, inc., MA, U.S.A)을 사용하였으며, secondary antibody는 HRP-conjugated goat anti-rabbit Ig G antibody (1:5,000 dilution) (Abcam, inc., MA, U.S.A) 을 이용하였다.
  • 본 시험에 사용된 시료는 누에고치(Gold silkworm)를 숙주로 이용하여 생산한 동충하초(Isaria tenuipes)를 농업과학기술원으로부터 공급받아 고지방식 사료(HFD45%)에 혼합하였다(Table 1). 사료의 제조는 전문 사료제조업체인 피드랩에서 제조하였다12).
  • 본 시험에 사용된 시료는 누에고치(Gold silkworm)를 숙주로 이용하여 생산한 동충하초(Isaria tenuipes)를 농업과학기술원으로부터 공급받아 고지방식 사료(HFD45%)에 혼합하였다(Table 1). 사료의 제조는 전문 사료제조업체인 피드랩에서 제조하였다12).
  • 실험동물은 랫드용 폴리카보네이트(500 × 300 ×200 mm)에 2마리씩 넣어 사육하였고, 음수와 사료는 자유로이 급여하였다.
  • 1% 저용량 투여군 및 아무런 처치도 하지 않은 대조군을 설정하였다. 실험물질의 투여는 21주령부터 매일 4주간 사료와 혼이 투여하였다.
  • 인슐린 비의존형 당뇨병 모델로 알려진 6주령의 OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty) 수컷 랫드 40마리를 입수하여 14주간 동물사육실 환경에 적응시켜 당뇨를 나타내는 20주령에 시험에 사용하였다. 동물사육실은 온도 20 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기횟수 10~15회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시), 조도 200~300 Lux로 유지하였다.

데이터처리

  • 모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
  • 통계 처리는 Student's t-test로 검정하였고 대조군과 비교하여 P < 0.05 이하인 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.

이론/모형

  • 시험물질 투여 종료 후 혈당 및 인슐린 농도의 변화를 분석하기 위해 부검 시에 복대동맥으로부터 혈액을 채취하여 4℃에서 3000 rpm으로 원심분리 후 혈청만을 취해 분석하였다. 혈당의 측정은 자동분석기(INTEGRA 400, Roche, Germany)를 이용하였고, 인슐린 농도는 ELISA법(Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA kit, Sweden)을 이용하여 측정하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
당뇨병의 유형에는 어떤 것들이 있는가? 당뇨병은 탄수화물 신진대사 장애로 고혈당 증상과 인슐린의 생산, 분비 혹은 이용의 이상으로 발생하게 된다. 당뇨병의 유형에는 크게 인슐린 의존성 또는 소아 당뇨병이라 고도 불리는 제1형 당뇨병과 전체 당뇨병의 90%이상을 차지하는 인슐린 비의존성 또는 성인 당뇨병라고도 불리는 제 2형 당뇨병으로 나뉜다. 제1형 당뇨는 자가면역질환으로 발생하는 당뇨병으로 주로 유전적 소인과 바이러스와 관련되어 췌장의 베타세포가 파괴되면서 인슐린 분비가 저하되어 발생하는 대사성질환이며 제2형 당뇨는 주로 비만 환자에게 나타나는 인슐린 저항성과 상대적 인슐린 결핍이 복합적으로 작용하여 포도당의 대사 장애를 초래하는 만성적인 당뇨병이다.
전 세계적으로 3번째로 위험한 질병은 무엇인가? 당뇨병은 전 세계적으로 3번째로 위험한 질병으로 분리 되며, 합병증을 포함하여 현재 우리나라 사망원인 5위를 차지하고 있는 근본적인 치유가 불가능한 만성퇴행성질환 중 의 하나이다1). 또한 2007년 보고된 국내 당뇨병 환자는 전체인구의 8.
동충하초 자실체 성분 중 코디셉핀의 효능은? 그 밖에 7%의 코디세핀(Cordycepin)을 함유하고 있는데, 이는 퀸산(quinic acid)의 이성체인 것으로 밝혀졌다. 자실체의 성분인 코디셉핀은 기주 곤충에서는 독소로 작용하며, 항세균, 항진균, 항바이러스 및 항암 작용을 하는 활성 물질로, 현대 중국 의학에서는 노환에서 오는 만성 기침, 천식을 치료하며, 신체의 정력 증강과 조절제로서 이용하고 있다6-8).
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참고문헌 (19)

  1. 통계청: 사망원인통계연보 2004. 대전, 통계청 (2005). 

  2. Beak, S.H.: Prevention of type 2 diabetes. Medical postgraduates 3, 128-131 (2007). 

  3. Holman, R.R., Bethel, M.A., Matthew, D.R. and Neil, H.A.: 10 year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Eng. J. Med. 359, 1557-1589 (2008). 

  4. Tapsell, L.C., Hemphill, I., Cobiac, L., Patch, C.S., Sullivan, D.R., Fenech, M., Roodenrys, S., Keogh, J.B., Clifton, P.M., Williams, P.G., Fazio, V.A. and Inge, K.E.: Health benefits of herbs and spices: the past, the present, the future. Med. J. Aust. 185, S4-24 (2006). 

  5. Shokuhin to Kaihatsu Henshubu: Market trend of health foods and health ingredients. Shokuhin to Kaihatsu 35, 18-34 (2000). 

  6. Ahn Y.J., Park S.J., Lee S.G., Shin S.C. and Choi D.H.: Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp. J Agric Food Chem. 48(7), 2744-2748 (2000). 

  7. Zhao-Long W., Xiao-Xia W. and Wei-Ying C.: Inhibitory effect of Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris on human glomerular mesangial cell proliferation induced by native LDL. Cell Biochem Funct. 18(2), 93-97 (2000). 

  8. Ikumoto T., Sasaki S., Namba H., Toyama R., Moritoki H. and Mouri T.: Physiologically active compounds in the extracts from tochukaso and cultured mycelia of Cordyceps and Isaria. Yakugaku Zasshi. 111(9), 504-509 (1991). 

  9. Uehara Y., Hirawa N., Numabe A., Kawabata Y., Nagoshi H., Negoro H., Fujiwara S., Gomi T., Ikeda T., Goto A. and Omata M.: Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition Delays Onset of Glucosuria With Regression of Renal Injuries in Genetic Rat Model of Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 3, 327-336 (1998). 

  10. Koga K., Yamagishi S., Takeuchi M., Inagaki Y., Amano S., Okamoto T., Saga T., Makita Z. and Yoshizuka M.: CS-886, a new angiotensin II type 1 receptor antagonist, ameliorates glomerular anionic site loss and prevents progression of diabetic nephropathy in Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats. Mol. Med. 8, 591-599 (2002). 

  11. Okada M., Takemura T., Yanagida H., Yoshioka K.: Response of mesangial cells to low-density lipoprotein and angiotensin II in diabetic (OLETF) rats. Kidney Int. 61, 113-124 (2002). 

  12. Hong I.P., Kang P.D., Kim K.Y., Lee M.Y., Choi Y.S., Kim N.S., Kim H.K., Nam S.H., and Lee K.G.: Synnemata Production by Isaria tenuipes using Colored Cocoon Silkworm, Golden Silk. Int. J. Indust. Entomol. 22(1), 1-4 (2011). 

  13. Caisheng L.U., Rengao Y.E., Qiongqiong Y., Xiao Y., Huiqun L.I. and Youji L.I.: Gene expression of glucose transorters and its regulation by gluicose in mesothelial cells. Chiness Med. J. 114, 447-480 (2001). 

  14. Mogensen, C.E. and Anderson M.J.F.: Increase kidney size and glomerulal filtration rate in early juenile diabetes. Diabetes 22, 706-712 (1973). 

  15. Gallaher, D.D., Casallany, A.S., Shoeman, D.W. and Olson, J.M.: Diabetes increases excretion of urinary malonaldehyde conjugates in rats. Lipids 28, 663-666 (1993). 

  16. Shon, K.H., Kim, S.H. and Choi, J.W.: Pretreatment with nicotinamide to prevent the pancreatic enzymes changes by streptozotocin in rats. J. Kor. Soc. Food Nutr. 21, 117-123 (1992). 

  17. Niall, M.G., Rosaleen, A.M., Daphne, O., Patrick, B.C., Alan, H.J. and Gerald, H.T.: Cholesterol metabolism in alloxaninduced diabetic rabbits. Diabetes 39, 626-636 (1990). 

  18. Wiederkehr, A. and Wollheim, C.B.: Minireview: implication of mitochondria in insulin secretion and action. Endocrinology 147, 2643-2649 (2006). 

  19. Holman, G.D. and Kasuga, M.: From receptor to transporter: insulin signaling to glucose transport. Diabetologia 40, 991-1003 (1997). 

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