[논문]식품 중 사용금지 원료인 Aphanizomenon flos-aquae 검출법 개발 및 응용

박용춘; 신승정; 이호연; 김용상; 김미라; 이상재; 이화정

doi:10.13103/jfhs.2013.28.2.188

[국내논문] 식품 중 사용금지 원료인 Aphanizomenon flos-aquae 검출법 개발 및 응용
Development and Application of Detection Method for Aphanizomenon flos-aquae not Usable as a Food Materials in Korea 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.28 no.2, 2013년, pp.188 - 193

초록
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Aphanizomenon flos-aquae는 시아노박테리아 일종이며 anatoxin-a, saxitoxin, neosaxitoxin 등의 독소를 생산할 수 있어 국내에서는 식품원료로 사용이 금지되어있다. 전통적으로 시아노박테리아는 사상체 넓이, 세포 크기, 분열방법, 세포형태, 가스주머니의 존재유무 등의 형태학적 특징에 의한 분류가 가능하다. 그러나 가스주머니 혹은 무성포자와 같은 특징은 주변 환경 또는 생장조건에 따라 차이가 있으며 경우에 따라 소실되기도 한다. 따라서 PCR에 의한 Aph. flos-aquae를 함유하는 기능식품을 검출할 수 있는 분석법을 개발하였다. 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어있는 Aph. flos-aquae, 스피루리나의 16S rRNA 염기서열을 이용하였으며, 비교 및 분석에는 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다. 최종적으로 클로렐라, 스피루리나, 녹차, 시금치로부터 Aph. flos-aquae를 검출할 수 있는 AFA-F1/AFA-R1(363 bp) 프라이머를 최종 선정하였다. 그리고 상기 프라이머는 Aph. flos-aquae가 각각 1% 함유 되도록 제조된 클로렐라, 스피루리나 제품에서 모두 혼입여부의 확인이 가능함을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Anatoxin-a, saxitoxin and neosaxitoxin are produced by Aphanizomenon flos-aquae that is a sort of the cyanobacteria phylum. Therefore, it is not permitted for food materials in Korea. Traditionally, the classification of cyanobacteria has been based on morphological characters such as trichome width, cell size, division planes, shape, and the presence of character such as gas vacuole. But, some diagnostic features, such as gas vacuole or akinetes, can show variation with different environmental or growth conditions and even be lost during cultivation. Therefore, we developed detection method for functional foods containing Aph. flos-aquae by PCR. To design the primer, 16S rRNA region of Aph. flos-aquae, Spirulina laxissima, and Spirulina spp. registered in the GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) have been used and for comparative analysis, BioEdit ver. 7.0.9.0. was used. As a result, we was design AFA-F1/AFA-R1 (363 bp) primer for the differentiation Aph. flos-aquae from chlorella, spirulina, green tea, and spinach. Also, it could be distinguished chlorella and spirulina products those are made to contain 1% Aph. flos-aquae.

Keyword

AI 본문요약
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* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

제안 방법

따라서 시중에 유통 중인 건강기능식품 중 클로렐라 또는 스피루리나 제품에 Aph. flos-aquae가 혼합되어 있는지를 확인하기 위하여 형태학적 분석법은 적용에 어려움이 있어 종 특이 프라이머를 이용한 PCR 법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 방법은 소비자 및 선의의 식품제조 · 유통업체를 보호하는 등 식품안전관리에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
DNeasy Plant mini 키트를 사용하여 유전자를 추출하였다. 추출방법은 제조사에서 제공하는 추출법에 의거하여 추출하였으며, 단 최종 용출단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 DNeasy Mini spin column으로부터 용출하였다
DNeasy Plant mini 키트를 사용하여 유전자를 추출하였다. 추출방법은 제조사에서 제공하는 추출법에 의거하여 추출하였으며, 단 최종 용출단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 DNeasy Mini spin column으로부터 용출하였다
flos-aquae 판별을 위한 PCR 반응조건은 95℃에서 5분 예비가열 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 15초 재결합, 72℃ 30초 중합반응 등의 과정을 35회 반복하고 마지막에 72℃에서 3분간 처리하였다.
유전자분석법에는 염기서열 결정 등의 방법이 있으나 분석시간, 분석기술, 분석비용 등을 고려하여 신속 · 정확하고 분석방법이 간편한 종 특이 프라이머를 이용하였다.
최종산물의 확인은 반응액 2 µl를 취하여 2% 아가로즈젤로 100 V, 30분간 전기영동하고 EtBr로 염색(1 µg/ml) 한 후 UV투영기를 이용하여 확인하였다.
Aph. flos-aquae에 대한 특이 프라이머를 설계하기 위하여 정방향 3종(AFA-F1, AFA-F2 및 AFA-F3)과 역방향 5종(AFA-R1, AFA-R2, AFA-R3, AFA-R4 및 AFA-R5)을 설계하였다. 그리고 가공식품에 대하여 적용이 가능하도록 하기 위하여 PCR 산물의 크기는 가급적으로 300 bp 이내가 되도록 조합을 구성하여 총 5종류(AFA-F1/AFA-R1, AFA-F2/AFA-R2, AFA-F3/AFA-R3, AFA-F3/AFA-R4, AFA-F3/AFA-R5)의 조합이 이루어지도록 하였으며(Fig.
flos-aquae에 대한 특이 프라이머를 설계하기 위하여 정방향 3종(AFA-F1, AFA-F2 및 AFA-F3)과 역방향 5종(AFA-R1, AFA-R2, AFA-R3, AFA-R4 및 AFA-R5)을 설계하였다. 그리고 가공식품에 대하여 적용이 가능하도록 하기 위하여 PCR 산물의 크기는 가급적으로 300 bp 이내가 되도록 조합을 구성하여 총 5종류(AFA-F1/AFA-R1, AFA-F2/AFA-R2, AFA-F3/AFA-R3, AFA-F3/AFA-R4, AFA-F3/AFA-R5)의 조합이 이루어지도록 하였으며(Fig. 1), 설계된 프라이머에 대한 정보는 Table 2에 기술하였다.
유전자분석법에는 염기서열 결정 등의 방법이 있으나 분석시간, 분석기술, 분석비용 등을 고려하여 신속 · 정확하고 분석방법이 간편한 종 특이 프라이머를 이용하였다. 또한 대조군으로는 녹차 및 시금치를 추가하여 수행하였다. 설계된 총 5종류(AFA-F1/AFA-R1, AFA-F2/AFA-R2, AFA-F3/AFA-R3, AFA-F3/AFA-R4, AFA-F3/AFA-R5)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 AFA에서는 PCR 산물이 뚜렷이 생성되고 클로렐라, 스피루리나, 녹차 및 시금치에서는 특이적 밴드가 형성되지 않는 AFA-F1/AFA-R1 (363 bp)을 최종 선정하였다(Fig.
따라서 국내에 유통 중인 건강기능식품에 대하여 식용불가 원료인 Aph. flos-aquae 함유여부를 조사하였다. 대상 시료로는 클로렐라 및 스피루리나 제품 각 2건을 구입하였으며, 분양받은 Aph.

대상 데이터

유전자증폭(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 프라이머 및 Taq DNA polymerase는 바이오니아(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 합성 또는 구매하였다. PCR 장비는 C1000 Touch^TM Thermal Cycler (Bio-RAD Laboratories, Inc.
표준시료인 Aph. flos-aquae, 클로렐라, 스피루리나는 식품의약품안전처 (건강기능식품기준과)로부터 분양 받았으며, 대조군으로 사용된 녹차, 시금치, 클로렐라 제품 2종, 스피루리나 제품 2종은 일반 마트에서 직접 구입하였다. 그리고 표준시료를 이용하여 클로렐라 및 스피루리나에 Aph.
gov)에 등록되어있는 Aph. flos-aquae (Accession No. FJ424569 및 EU157995), 스피루리나(Accession No. DQ393278 및 HQ008228)의 16S rRNA부위에 대한 염기서열을 대상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다.
그리고 클로렐라의 경우 활용할 수 있는 16S rRNA 염기서열이 없어 이론적 비교 · 분석 어려워 가능한 여러 종류의 프라이머를 설계하여 실험을 통한 최적의 프라이머를 선정하였다.
DQ393278) 및 Spirulina spp. (Accession No. HQ008228)의 16S rRNA 염기서열을 이용하였다. Aph.
또한 대조군으로는 녹차 및 시금치를 추가하여 수행하였다. 설계된 총 5종류(AFA-F1/AFA-R1, AFA-F2/AFA-R2, AFA-F3/AFA-R3, AFA-F3/AFA-R4, AFA-F3/AFA-R5)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 AFA에서는 PCR 산물이 뚜렷이 생성되고 클로렐라, 스피루리나, 녹차 및 시금치에서는 특이적 밴드가 형성되지 않는 AFA-F1/AFA-R1 (363 bp)을 최종 선정하였다(Fig. 2)

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Aph. flos-aquae란?	Aph. flos-aquae는 남조류강(Cyanophyceae Class) 연쇄체목(Nostocales Order) 염주말과(Nostocaceae Family)에 속하는 남조류의 일종이며 담수에서 자생하며 녹조현상을 일으키는 주요 미세조류의 일종이다15,16). Yamamoto17)에 따르면 비교적 높은 위도지역에서 녹조 발생 시 최초로 발견된다는 보고가 증가하고 있다고 밝혔다.
	스피루리나는 주로 어떤 환경에서 배양되는가?	대부분의 미세조류 생산업체는 아시아태평양 지역에 밀집되어있고 매년 약 500톤의 생산능력을 보유하고 있으며 생산되는 미세조류는 Aphanizomenon flos-aquae, 클로렐라, 스피루리나, 두날리엘라 등이 주종을 이룬다4). 스피루리나의 경우 지난 30년간 사람 또는 동물의 식품공급원 및 식품 중 색깔을 내기 위하여 상업적으로 생산되고 있으며5,6), 아프리카, 캘리포니아, 하와이, 태국, 중국, 타이완, 인디아에서는 설비시설을 갖춘 야외 연못에서 배양하고 있다7). 그리고 1995년 기준 전 세계적으로 약 2,000톤이 생산되고 있다5).
	Aph. flos-aquae가 최초로 발견되는 환경은?	flos-aquae는 남조류강(Cyanophyceae Class) 연쇄체목(Nostocales Order) 염주말과(Nostocaceae Family)에 속하는 남조류의 일종이며 담수에서 자생하며 녹조현상을 일으키는 주요 미세조류의 일종이다15,16). Yamamoto17)에 따르면 비교적 높은 위도지역에서 녹조 발생 시 최초로 발견된다는 보고가 증가하고 있다고 밝혔다. 국내의 경우 낙동강에서 시아노박테리아에 의하여 여름과 초가을에 녹조현상이 발생하며18) 주요 원인균 중 Aph.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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