선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 SCAR marker를 이용하여 4종의 오미자류를 동시에 종 수준에서 감별할 수 있는 다품종 동시 감별 multiplex-PCR 기법을 개발하여 한약재 오미자 (五味子)의 혼·오용을 막고 국내 자생 오미자류 유전자원 보호 및 새로운 품종으로의 육종 등에 이용 될 수 있는 기초 자료로 활용하고자 한다.
- 본 연구에서는 4종의 오미자류에 대한 RAPD 종 특이 증폭 산물을 바탕으로 종 감별을 위한 SCAR marker를 개발하였다. 또한 SCAR marker를 이용하여 4종의 오미자류를 동시에 종 수준에서 감별할 수 있는 다품종 동시 감별 multiplex-PCR 기법을 개발하여 한약재 오미자 (五味子)의 혼·오용을 막고 국내 자생 오미자류 유전자원 보호 및 새로운 품종으로의 육종 등에 이용 될 수 있는 기초 자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
- 4종의 오미자류 24개 시료의 genomic profile은 10-mer RAPD Kit (Operon, CA, USA)을 이용하여 RAPD 분석을 수행하였다. 약 5 ~ 20 ng의 total DNA를 주형으로 30 pmole의 RAPD primer 및 2 unit의 DNA polymerase를 최종 30 ㎕의 반응용액 (75 mM Tris-HCl (pH 8.
- 4종의 오미자류를 보다 명확하고 효과적으로 감별하기 위하여 multiplex-PCR을 수행하였다. 529 bp 크기의 오미자 (S.
- 4종의 오미자류를 보다 명확하고 효과적으로 감별하기 위하여 multiplex-PCR을 수행하였다. 529 bp 크기의 오미자 (S. chinensis) 종 특이 WC8-1 F1/OWC8-1 R2 primer 쌍, 106 bp 크기의 화중오미자 (S. sphenanthera) 종 특이 WC8-1 F1/ WWC8-1 R5 primer 쌍, 410 bp 남오미자 (K. japonica) 종 특이 NF3-1 F1/R1 primer 쌍, 205 bp 크기의 흑오미자 (S. repanda) 종 특이 BD16-1 F1/R2 primer 쌍을 모두 이용하는 multiplex-PCR 조합에 대한 PCR 증폭 조건을 탐색하였다. 오미자 (S.
- OPC8 Operon 10-mer primer로부터 935 bp 크기의 화중오미자 (S. sphenanthera) 종 특이 증폭산물을 WC8-1로 명명하고 염기서열을 분석하여 SCAR primer를 제작하였다. PCR 증폭을 통하여 오미자류 4종에 대한 다형성을 확인한 결과, WC8-1 F1, WC8-1 R1 primer 쌍에서 약 800 bp 크기의 오미자 (S.
- OPD16 Operon 10-mer primer에 의해 증폭된 265 bp 크기의 흑오미자 (S. repanda) 종 특이 증폭산물을 BD16-1로 명명하고 염기서열을 분석하였다. 이를 바탕으로 SCAR primer를 제작하여 PCR 증폭을 통한 흑오미자 (S.
- 3-A). OWC8-1, WWC8-1 두 염기서열에서 차이를 보이는 염기를 포함하도록 오미자 (S. chinensis)와 화중오미자 (S. sphenanthera)에 대한 각각의 특이 primer를 제작하였고 PCR 증폭을 통하여 종 특이적 증폭산물의 생산 유무를 확인하였다.
- 5% agarose gel에 전기영동하여 DNA 절편을 UV상에서 확인하였다. RAPD 분석 결과로부터 종 특이적 증폭산물이 확인된 primer를 선발, 종 특이적 DNA 절편의 다형성을 확인하고 이들 특이 DNA 절편을 회수하여 정제한 뒤, pGEM-Teasy vector (Promega, WI, USA)에 ligation 하여 삽입하였다. 삽입된 증폭산물은 XL1-Blue MRF’ competent cell (Stratagene, CA, USA)에 형질 전환하여 ampicillin과 X-gal/IPTG가 첨가된 LB agar 배지에 도말 후 약 20시간 배양하였다.
- primer의 농도, annelaing 온도 및 시간, 증폭 횟수 등의 다양한 PCR 조건에서 종 특이적 DNA 절편의 증폭 유·무와 크기, 수, 증폭 양 등을 확인하였고 최적의 multiplex-PCR 조건을 탐색하였다.
- 국내·외 각기 다른 재배지로부터 수집한 4종의 오미자류에 24개 시료와 (Table 1) 57개의 Operon 10-mer primer를 이용하여 RAPD 분석을 수행하였다 (Table 2).
- 국내·외 자생지 또는 재배지에서 수집하여 -70℃에 보관 중인 기원식물 생체시료 및 약재 시료를 액체질소로 급냉시켜 막자사발을 이용하여 분말상태로 마쇄한 후, DNasey Plant Mini Kit (QIAGEN, CA, USA)을 이용하여 추출·정제하였다.
- chinensis)와 유사하여 위품으로 혼·오용되어 사용될 우려가 있다. 남오미자 (K. japonica)를 판별하기 위하여 OPF3 Operon 10-mer primer로부터 730 bp 크기의 남오미자 (K. japonica) 종 특이 증폭 산물을 NF3-1이라 명명하고 염기서열을 분석하여 SCAR primer 제작과 PCR 증폭을 통하여 종 특이성을 검증하였다. 그 결과 NF3-1 F1과 NF3-1 R1 primer 쌍에서 410 bp 크기의 남오미자 (K.
- 반응이 끝난 증폭산물 중 10 ㎕와 6 × loading dye 2 ㎕ 를 1.5% agarose gel에 전기영동하여 DNA 절편을 UV상에서 확인하였다.
- 분석된 염기서열을 NCBI BLAST search의 수행으로 기존에 알려진 유전자 염기서열과의 유사성 정도를 확인하고 유사성이 없거나 낮은 부위를 이용하여 종 특이적 primer를 제작하여 각 primer 조합에 대한 종 특이적 DNA 절편의 증폭 여부를 확인하였다. 제작된 primer 조합을 이용하여 약 5 ~ 20 ng의 total DNA를 주형으로 10 pmole의 primer 및 2 unit의 DNA polymerase를 최종 20 ㎕의 반응용액 (75 mM Tris-HCl (pH 8.
- 삽입된 증폭산물은 XL1-Blue MRF’ competent cell (Stratagene, CA, USA)에 형질 전환하여 ampicillin과 X-gal/IPTG가 첨가된 LB agar 배지에 도말 후 약 20시간 배양하였다. 선별된 White colony를 액체배양하고 Plasmid mini preparation kit (Solgent, Daejeon, Korea)를 이용하여 plasmid DNA를 분리한 후, T7과 SP6 primer를 이용하여 ABI3730 automatic DNA sequencer (Applied Biosystems, CA, USA)에서 염기서열을 분석하였다.
- 약 20 ng의 total DNA를 주형으로 최종 30 ㎕의 반응용액 (75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 20μM dNTP, 200μM MgCl2)에 SCAR marker로 확인된 5 ~ 20 pmole의 primer와 2 unit의 DNA polymerase를 각각 첨가한 뒤, DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-rad, CA, USA)에서 95℃에서 5분간 predenaturation 한 후 95℃에서 30초 denaturation, 53 ~ 59℃에서 20 ~ 45초 annealing, 72℃에서 45초 extention 30 ~ 35회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 extention 하였다.
- 약 5 ~ 20 ng의 total DNA를 주형으로 30 pmole의 RAPD primer 및 2 unit의 DNA polymerase를 최종 30 ㎕의 반응용액 (75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 20 μM dNTP, 200 μM MgCl2)에 각각 첨가한 뒤, DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-rad, CA, USA)에서 95℃에서 5분간 predenaturation 한 후 95℃에서 30초 denaturation, 46℃에서 30초 annealing, 72℃에서 45초 extention을 35회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 extention 시켰다.
- sphenanthera)에서 공통적으로 나타나는 DNA 절편이 확인되었다 (data not shown). 위에서 확인된 공통의 DNA 절편을 오미자 (S. chinensis)와 화중오미자 (S. sphenanthera)로 분리하여 오미자 (S. chinensis)에서 얻은 DNA 절편을 OWC8-1, 화중오미자 (S. sphenanthera)에서 얻은 DNA 절편을 WWC8-1이라 명명하고 각각에 대한 염기서열을 분석하였다. 분석된 DNA 절편은 그 크기가 OWC8-1 783 bp, WWC8-1 795 bp로 전체적인 염기서열의 크기가 다를 뿐만 아니라 다수의 염기에서 차이를 보였다 (Fig.
- 이를 바탕으로 SCAR primer를 제작하여 PCR 증폭을 통한 흑오미자 (S. repanda) 종 특이 DNA 절편의 증폭 유·무를 확인하였다.
- 국내·외 자생지 또는 재배지에서 수집하여 -70℃에 보관 중인 기원식물 생체시료 및 약재 시료를 액체질소로 급냉시켜 막자사발을 이용하여 분말상태로 마쇄한 후, DNasey Plant Mini Kit (QIAGEN, CA, USA)을 이용하여 추출·정제하였다. 정제된 DNA는 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동 후, EtBr (Ethidium Bromide)로 염색하여 UV light 상에서 DNA 절편을 확인하였으며, UV spectrophotometer (Nanodrop ND-1000, Nanodrop, DE, USA)를 이용하여 260 ㎚와 280 ㎚에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
- 제작된 primer 조합을 이용하여 약 5 ~ 20 ng의 total DNA를 주형으로 10 pmole의 primer 및 2 unit의 DNA polymerase를 최종 20 ㎕의 반응용액 (75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20, 20 μM dNTP, 200 μM MgCl2)에 각각 첨가한 뒤, DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-rad, CA, USA)에서 95℃에서 5분간 predenaturation 한 후 95℃에서 30초 denaturation, 58℃에서 30초 annealing, 72℃에서 45초 extention을 30회 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 extention 시킨 후 종 특이적 DNA 절편의 증폭 유·무와 크기 및 수를 확인하였다.
대상 데이터
- sphenanthera)는 중국 하남성 산문협시 일대의 자생지에서 수집하였다. 국내 특산종인 흑오미자 (S. repanda)는 제주도 난대산림 연구소와 한라수목원, 그리고 제주도 지역의 3대 자생지 시료를 암그루와 숫그루를 구분하여 수집하였고, 남오미자 (K. japonica)는 전남 해남과 완도지역의 자생지와 제주도의 자생지로부터 2009년부터 2010년에 걸쳐 수집하였다. 수집한 시료는 본초학, 생약학, 식물분류학 등의 전문가로 구성된 분류·동정 자문회의 동정을 거쳐 그 종을 최종 확정지어 사용하였으며, 각 시료의 기원식물은 압착표본을 제작하여 한국한의학연구원 한약 표준 표본관에 표본번호를 부여하여 보관하였다 (Table 1).
- 수집한 시료는 본초학, 생약학, 식물분류학 등의 전문가로 구성된 분류·동정 자문회의 동정을 거쳐 그 종을 최종 확정지어 사용하였으며, 각 시료의 기원식물은 압착표본을 제작하여 한국한의학연구원 한약 표준 표본관에 표본번호를 부여하여 보관하였다 (Table 1).
- 오미자 (S. chinensis)는 국내에서 전북 장수 지역의 재배지와 강원도 평창군, 춘천시의 자생지에서 수집하였으며 국외의 경우 중국 요령성, 길림성의 재배지와 자생지에서 각각 수집하였다. 중국 자생종인 화중오미자 (S.
- chinensis)는 국내에서 전북 장수 지역의 재배지와 강원도 평창군, 춘천시의 자생지에서 수집하였으며 국외의 경우 중국 요령성, 길림성의 재배지와 자생지에서 각각 수집하였다. 중국 자생종인 화중오미자 (S. sphenanthera)는 중국 하남성 산문협시 일대의 자생지에서 수집하였다. 국내 특산종인 흑오미자 (S.
성능/효과
- sphenanthera) 종 특이 증폭산물을 WC8-1로 명명하고 염기서열을 분석하여 SCAR primer를 제작하였다. PCR 증폭을 통하여 오미자류 4종에 대한 다형성을 확인한 결과, WC8-1 F1, WC8-1 R1 primer 쌍에서 약 800 bp 크기의 오미자 (S. chinensis)와 화중오미자 (S. sphenanthera)에서 공통적으로 나타나는 DNA 절편이 확인되었다 (data not shown). 위에서 확인된 공통의 DNA 절편을 오미자 (S.
- WC8-1로부터 제작된 WC8-1 F1과 OWC8-1로부터 제작된 OWC8-1 R2 primer 쌍을 이용한 PCR 검증 결과, 529 bp 크기의 증폭산물이 오미자 (S. chinensis)에서만 확인되어 오미자 (S. chinensis) 종 판별을 위한 SCAR marker로의 이용이 가능할 것으로 판단된다 (Fig. 2). 오미자 (S.
- japonica) 종 특이 증폭 산물을 NF3-1이라 명명하고 염기서열을 분석하여 SCAR primer 제작과 PCR 증폭을 통하여 종 특이성을 검증하였다. 그 결과 NF3-1 F1과 NF3-1 R1 primer 쌍에서 410 bp 크기의 남오미자 (K. japonica) 종 특이적인 DNA 절편을 확인하였다 (Fig. 4). 이를 토대로 Kadsura속 남오미자 (K.
- repanda) 종 특이 DNA 절편의 증폭 유·무를 확인하였다. 그 결과, Fig. 5에서 보는 바와 같이 BD16-1 F2과 BD16-1 R2 primer 쌍에서 205 bp 크기의 흑오미자 (S. repanda) 종 특이 DNA 절편을 확인할 수 있었다. 흑오미자 (S.
- chinensis) 성분함량으로 품질을 관리하여 안정된 한약재의 품질확보가 이루어질 수 있을 것으로 기대된다. 또한 WC8-1 F1과 WWC8-1로부터 제작된 WWC8-1 R5 primer 쌍을 이용하여 화중오미자 (S. sphenanthera) 특이 증폭 산물을 확인한 결과 106 bp 크기 DNA 절편이 화중오미자 (S. sphenanthera)에서만 관찰되어 화중오미자 (S. sphenanthera)를 판별하기 위한 SCAR marker로 이용이 가능할 것으로 판단된다 (Fig. 3).
- repanda)는 고립된 섬이라는 지역적 격리로 인하여 유전적 변이가 적게 나타나 안정적인 유전특성을 보이는 것으로 판단된다. 또한 오미자 (S. chinensis)와 화중오미자(S. sphenanthera)의 RAPD 증폭 양상이 유사하게 나타났고 화중오미자 (S. sphenanthera)에서 종내 개체간 다형성이 빈번하게 확인되었다. 이는 Moon 등 (2010)이 ITS 부위 염기서열을 분석하여 오미자 (S.
- japonica)에서 종 특이적 다형성이 가장 빈번하게 확인되었다. 또한 우리나라 제주도에서 자생하는 특산식물인 흑오미자 (S. repanda)에서 종 특이적 다형성이 다수 관찰되었고 종내 개체간 차이는 가장 적게 확인되었다 (Fig. 1). 흑오미자 (S.
- sphenanthera)에서 얻은 DNA 절편을 WWC8-1이라 명명하고 각각에 대한 염기서열을 분석하였다. 분석된 DNA 절편은 그 크기가 OWC8-1 783 bp, WWC8-1 795 bp로 전체적인 염기서열의 크기가 다를 뿐만 아니라 다수의 염기에서 차이를 보였다 (Fig. 2-A, Fig. 3-A). OWC8-1, WWC8-1 두 염기서열에서 차이를 보이는 염기를 포함하도록 오미자 (S.
- 국내·외 각기 다른 재배지로부터 수집한 4종의 오미자류에 24개 시료와 (Table 1) 57개의 Operon 10-mer primer를 이용하여 RAPD 분석을 수행하였다 (Table 2). 오미자 (S. chinensis) 8개 시료, 화중오미자 (S. sphenanthera) 4개 시료, 남오미자 (K. japonica) 4개 시료, 흑오미자 (S. repanda) 8개 시료의 잎에서 추출한 gDNA를 주형으로 RAPD PCR 증폭하여 종 특이적 다형성을 분석한 결과, 57개의 primer중 50개의 primer로부터 종 특이적으로 증폭된 다수의 증폭산물을 얻을 수 있었다. 증폭된 RAPD 산물은 150 bp ~ 2.
- repanda) 종 특이 BD16-1 F1/R2 primer 쌍을 모두 이용하는 multiplex-PCR 조합에 대한 PCR 증폭 조건을 탐색하였다. 오미자 (S. chinensis)와 화중오미자 (S. sphenanthera)에서 공통으로 이용되는 primer WC8-1 F1을 포함하는 7개의 primer를 총 30 ㎕의 반응용액에 각각 5 pmole의 농도로 첨가하여 58℃의 annealing 온도에서 30초 동안 반응하고 총 30회 PCR 증폭 하였을 때 각각의 종에 대하여 명확하게 크기가 다른 종 특이적 DNA 절편을 확인할 수 있었다 (Fig. 6). 본 연구에서 개발한 multiplex-PCR 증폭 기법은 오미자류 4종에 대한 종 특이 SCAR marker primer 조합을 동시에 PCR 반응에 이용하여 우리나라 약전에 규정된 정품 오미자 (五味子)와 위품을 구별하기 위한 효과적인 방법으로 이용될 것으로 기대된다.
- 1). 오미자류 4종에 대하여 증폭되어진 RAPD 다형성의 양상을 비교하였을 때 4종의 오미자류 중 Schisandra속 3종과 속이 다른 Kadsura속 남오미자 (K. japonica)에서 종 특이적 다형성이 가장 빈번하게 확인되었다. 또한 우리나라 제주도에서 자생하는 특산식물인 흑오미자 (S.
- 4). 이를 토대로 Kadsura속 남오미자 (K. japonica)를 Schisandra속 오미자 (S. chinensis), 화중오미자 (S. sphenanthera), 흑오미자 (S. repanda)와 명확히 구별할 수 있게 되었다.
- 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 2속 4종의 오미자류 게놈 유전자 지문분석을 통해 종판별에 활용 가능한 SCAR 유전자 마커를 개발하였으며, 한번의 PCR 반응을 통해 4종의 오미자류를 종 단위로 판별할 수 있는 다품종 동시 감별용 multiplex-PCR 기법을 개발하였다. 이러한 결과는 오미자 (五味子)의 대용품 또는 위품으로 사용될 가능성이 있는 화중오미자 (S.
- repanda) 8개 시료의 잎에서 추출한 gDNA를 주형으로 RAPD PCR 증폭하여 종 특이적 다형성을 분석한 결과, 57개의 primer중 50개의 primer로부터 종 특이적으로 증폭된 다수의 증폭산물을 얻을 수 있었다. 증폭된 RAPD 산물은 150 bp ~ 2.0 kb 크기에서 다양하게 확인되었으며 primer 별로 5 ~ 20개의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 오미자류 4종에 대하여 증폭되어진 RAPD 다형성의 양상을 비교하였을 때 4종의 오미자류 중 Schisandra속 3종과 속이 다른 Kadsura속 남오미자 (K.
후속연구
- 6). 본 연구에서 개발한 multiplex-PCR 증폭 기법은 오미자류 4종에 대한 종 특이 SCAR marker primer 조합을 동시에 PCR 반응에 이용하여 우리나라 약전에 규정된 정품 오미자 (五味子)와 위품을 구별하기 위한 효과적인 방법으로 이용될 것으로 기대된다.
- , 1998). 본 연구에서 흑오미자 (S. repanda)를 판별할 수 있는 SCAR marker를 개발함으로서 오미자 (S. chinensis), 화중오미자 (S. sphenanthera), 남오미자 (K. japonica) 열매로부터 흑오미자 (S. repanda)를 구별하고, 흑오미자 (S. repanda) 유전자원을 기반으로 한 신품종 개발과 국내 자생 특산식물 관리 및 보호에도 유용하게 이용 될 것으로 기대된다.
- 이러한 객관적 유전자 감별 마커는 한약재 생산단계는 물론 유통현장에서 한약재 대용품이나 위품의 생산·유통을 방지할 수 있는 기술로 활용되어 한약의 효능 동등성 제공과 신뢰 회복에 이바지 할 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 유용 식물자원의 기원 확립과 순계 및 계통의 육성에 분자생물학적 방법을 도입함으로써 개체 수준의 동정이 가능하게 되어 육종에 요구되는 시간과 노동력을 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
- 오미자 (S. chinensis) 종 특이 SCAR marker의 이용으로 4종의 오미자류 중 우리나라 약전에서 정품 오미자 (五味子)로 규정하고 있는 오미자 (S. chinensis)와 나머지 3종의 오미자류를 구분하여 약재의 혼·오용을 막고 쉬잔드린, 고미신 등의 오미자 (S. chinensis) 성분함량으로 품질을 관리하여 안정된 한약재의 품질확보가 이루어질 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 객관적 유전자 감별 마커는 한약재 생산단계는 물론 유통현장에서 한약재 대용품이나 위품의 생산·유통을 방지할 수 있는 기술로 활용되어 한약의 효능 동등성 제공과 신뢰 회복에 이바지 할 것으로 기대된다.
- 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 2속 4종의 오미자류 게놈 유전자 지문분석을 통해 종판별에 활용 가능한 SCAR 유전자 마커를 개발하였으며, 한번의 PCR 반응을 통해 4종의 오미자류를 종 단위로 판별할 수 있는 다품종 동시 감별용 multiplex-PCR 기법을 개발하였다. 이러한 결과는 오미자 (五味子)의 대용품 또는 위품으로 사용될 가능성이 있는 화중오미자 (S. sphenanthera), 남오미자 (K. japonica), 흑오미자 (S. rependa) 열매를 분자생물학적 방법으로 구별함으로써 한약재 오미자 (五味子)의 기원확립은 물론 혼오용 방지를 위한 객관적인 감별 기술로 활용될 것으로 기대된다. 이러한 객관적 유전자 감별 마커는 한약재 생산단계는 물론 유통현장에서 한약재 대용품이나 위품의 생산·유통을 방지할 수 있는 기술로 활용되어 한약의 효능 동등성 제공과 신뢰 회복에 이바지 할 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.