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문제 정의
- 본 연구는 천연 식물 자원으로부터 항염증, 항산화 및 항관절염에 활성을 갖는 유용한 물질을 검색하기 위해 53가지의 국내산 약용 생약재를 선정하여 NO 억제활성을 조사하였으며, 단독으로 사용하기보다 유효성분의 상승효과를 알아보기 위하여 NO 억제활성이 뛰어난 생약재들의 혼합 추출조건을 최적화하고, 이에 대한 HAse의 억제활성 여부를 비교해보았다.
- 본 연구에서는 천연식물자원으로부터 항염증, 항산화 및 항관절염에 활성을 갖는 유용한 물질을 검색하기 위해 문헌조사 및 기존의 연구결과를 통하여 선정된 53가지의 생약재로부터 NO와 HAse(hyaluronidase)의 억제활성 여부를 측정하였다. 측정 결과 억제효과가 우수하다고 확인된 황기
제안 방법
- (Astragalus membranaceus)와 오미자(Schisandra chinensis), 길경(P latycodon grandiflorum)을 최종 시료로 선정하였고, 이를 단독으로 사용하기보다는 유효성분의 항염증 및 항산화 효능에 대한 상승효과를 알아보기 위하여 혼합추출물의 최적조건을 확인하였다. 각 소재들을 1:2:1로 혼합한 혼합추출물에서 다양한 추출조건에 따라 단일 생약재 추출물에 비해 2배에서 4배까지의 수율 증가를 보였으며, NO 억제활성 효과도 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- Ac와 As는 각각 대조군과 실험군의 흡광도를 나타내며, 시료 대신 0.1 M acetate buffer(pH 3.5, 5% DMSO)를 첨가 하여 처리한 것을 대조군으로 하였다.
- HAse 저해 활성은 Elson-Morgan법(14)을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. HA가 HAse에 의해 분해되어 생성되는 N-acetylglucosamine의 양을 0.
- HAse 저해 활성은 Elson-Morgan법(14)을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. HA가 HAse에 의해 분해되어 생성되는 N-acetylglucosamine의 양을 0.1 M acetate buffer 시약으로 발색시킨 후 microplate reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하고, 대조군과 비교하여 저해율를 계산하였다. 우선 microplate에 0.
- 시료의 NO 생성 저해 활성은 nitrite assay(13)를 사용하여 측정하였다. NO 합성의 indicator로 사용되는 NO2 농도는 griess reagent(1% sulfonic acid, 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride, 2.5% phosphoric acid)를 이용하여 배양배지에서 측정하였다. 세포배양액 100 μL를 동량의 griess reagent와 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 546 nm에서 microplate reader로 측정하였다.
- 단일생약재: 각각의 단일 생약재에 대한 수율과 NO 억제 활성의 효과를 확인하기 위해 다음의 실험조건을 바탕으로 추출조건 최적화 실험을 실시하였다. 최초의 추출조건인 not grinded, 95% EtOH, 24시간, 실온의 조건을 기준으로 용매의 농도, 추출 온도, 추출 시간, 입자의 크기 4가지 각각의 조건에 대해서 수율과 NO 억제활성 효과를 확인하였다.
- 1:2:1로 혼합된 생약재는 용매의 농도, 추출 온도, 추출 시간, 입자의 크기 4가지 조건에 대해서는 각각의 조건별로 단일생약재의 추출조건과 동일하게 실시하였으며, 수율과 NO 억제활성 효과를 확인하였다. 또한 혼합 속도는 0, 50, 100, 150, 200 rpm의 5구간으로, 용매 분획별로는 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 순으로 분리하여 각각의 조건별로 수율과 NO 억제활성을 측정하여 비교하였다.
- 세포배양액 100 μL를 동량의 griess reagent와 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 546 nm에서 microplate reader로 측정하였다. 모든 실험에서 fresh culture medium을 blank로 사용하였다.
- 반응물에 3,2'-dimethyl-4-aminobiphenyl(DMAB, ρ-dimetylaminobenaldehyde 0.4 g, acetic acid 35 mL 및 10 N HCl용액 5 mL 혼합액) 180 μL를 가하여 37oC에서 20분간 배양한 다음 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, HAse 활성 저해율은 다음 식에 의해 산출하였다.
- 5% 이내의 차이를 보여서 이후의 실험에서는 추출용매를 발효주정으로 하였다(data not shown). 발효주정 추출물의 중량을 측정하기 위하여 동결건조 후 각 시료의 수율을 구하였다(Table 1). 강활, 초용담, 금은화 등은 각각 43.
- 발효주정은 인체 유해성이 낮고 수용성과 지용성 물질을 용해시킬 수 있어, 에탄올을 사용했던 기존(15,16)의 결과가 발효주정의 사용 시에도 유효한가를 알아보기 위하여 생약재에 대해서 에탄올과 발효주정을 사용한 추출물의 수율과 NO 억제 활성을 비교하였다. 그 결과 각각의 수율과 NO 억제 활성이 0.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, Dulbeco`s modified Eagle`s medium(DMEM)은 Gibco(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 사용 기기로는 마쇄한 생약재를 입자의 크기 별로 나누기 위하여 standard sieve(CHUNG GYE, Seoul) 를 사용하였고, 추출된 시료의 농축에는 rotary vacuum evaporator(EYELA Ltd., Kyoto, Japan)를 사용하였다. 흡광도 측정은 microplate reader(Model 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하였다.
- 단일생약재: 각각의 단일 생약재에 대한 수율과 NO 억제 활성의 효과를 확인하기 위해 다음의 실험조건을 바탕으로 추출조건 최적화 실험을 실시하였다. 최초의 추출조건인 not grinded, 95% EtOH, 24시간, 실온의 조건을 기준으로 용매의 농도, 추출 온도, 추출 시간, 입자의 크기 4가지 각각의 조건에 대해서 수율과 NO 억제활성 효과를 확인하였다. 추출용매인 주정의 농도는 5가지 조건(0, 12.
- 추출 시간은 6～36시간까지 6시간 간격으로 6구간으로 분리하고, 입자의 크기는 standard sieve를 사용하여 not grinded, 3.36 mm로 5구간으로 분리하여 수율과 NO 억제활성을 각각 측정하여 단일 생약재별 각각의 최적화된 추출조건을 확인하였다.
- 추출용매인 주정의 농도는 5가지 조건(0, 12.5, 25, 50, 95%) 으로, 추출 온도는 20～60oC까지 10oC 간격으로 5구간으로 각각 분리하여 수율과 NO 억제활성을 측정하였다.
- 혼합생약재: 단일 생약재의 혼합비율을(황기 : 오미자 : 길경) 각각 1:1:1, 1:2:1, 1:1:2, 2:1:1, 2:2:1 비율의 5구간으로 혼합하여 분석한 후, 최적의 혼합비율인 1:2:1로 혼합된 생약재를 실험재료로 사용하였다. 1:2:1로 혼합된 생약재는 용매의 농도, 추출 온도, 추출 시간, 입자의 크기 4가지 조건에 대해서는 각각의 조건별로 단일생약재의 추출조건과 동일하게 실시하였으며, 수율과 NO 억제활성 효과를 확인하였다.
대상 데이터
- 사용된 시약으로 fetal bovine serum(FBS)은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, Dulbeco`s modified Eagle`s medium(DMEM)은 Gibco(Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 사용 기기로는 마쇄한 생약재를 입자의 크기 별로 나누기 위하여 standard sieve(CHUNG GYE, Seoul) 를 사용하였고, 추출된 시료의 농축에는 rotary vacuum evaporator(EYELA Ltd.
- Macrophage RAW 264.7 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 10% FBS, penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다.
- 4%로 높은 활성을 나타내었다(Table 1). 본 실험결과와 Kim(7)의 연구결과에서도 NO 억제 활성이 명확하다고 알려진 길경(P.G.)을 실험 대상으로 1차 선정하였다. HAse 억제 활성을 검색한 결과 황기, 오미자, 황금 등이 각각 67.
- 본 실험에 사용한 53가지의 생약재는 서울경동시장 약재 도매 상가에서 원산지를 확인한 후 구입하였으며, 모든 원료는 건조 및 마쇄한 시료 3 g에 발효주정(95% EtOH, 진로주정, Ansan, Korea) 100 mL를 가하여 실온에서 24시간 동안 방치한 후 여과하고, 다시 잔사에 발효주정을 가하여 침지한 후 여과하는 과정을 3회 반복하여 실행하였다. 얻은 추출액은 45oC 수욕상에서 감압 농축한 후 건조하여 냉장 보관하며 본 실험에 사용하였다(Table 1).
- 본 실험에 사용한 53가지의 생약재는 서울경동시장 약재 도매 상가에서 원산지를 확인한 후 구입하였으며, 모든 원료는 건조 및 마쇄한 시료 3 g에 발효주정(95% EtOH, 진로주정, Ansan, Korea) 100 mL를 가하여 실온에서 24시간 동안 방치한 후 여과하고, 다시 잔사에 발효주정을 가하여 침지한 후 여과하는 과정을 3회 반복하여 실행하였다. 얻은 추출액은 45oC 수욕상에서 감압 농축한 후 건조하여 냉장 보관하며 본 실험에 사용하였다(Table 1). 사용된 시약으로 fetal bovine serum(FBS)은 Sigma-Aldrich Co.
- 7%로 높은 활성을 나타내었으며, 모과, 인삼, 백작약 등은 30% 이상의 활성을 보였고, 오가피, 우슬, 석창포, 당귀, 해동피, 갈근, 복분자 등도 10% 이상의 활성을 나타내었다(Table 1). 이들 중 수율과 HAse 저해 활성을 고려하여 황기(15)와 오미자를 실험 대상으로 2차 선정하였다. Kim 등(17)의 연구결과에 따르면, 황기의 MeOH 및 EtOAc의 분획에서 염증이나 산화적 스트레스와 관련되어진 COX-2에 대해서 억제효과가 있다고 알려져 있다.
데이터처리
- 모든 실험은 3반복으로 측정하여 측정치를 평균값 ± 표준편차로 나타내었으며, 실험결과의 통계적 유의성은 Minitab program(Minitab 16, Minitab Inc., State College, PA, USA) one-way 분산분석(ANOVA)의 Turky HSD test에 의해 시료간의 유의적 차이(p<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
- 시료의 NO 생성 저해 활성은 nitrite assay(13)를 사용하여 측정하였다. NO 합성의 indicator로 사용되는 NO2 농도는 griess reagent(1% sulfonic acid, 0.
성능/효과
- 1:2:1 비율로 혼합한 생약재를 각각의 조건을 실험한 결과, 주정 농도는 95%, 추출 시간은 12시간, 추출 온도는 30oC, 혼합속도는 50 rpm, 추출 용매는 ethyl acetate에서 가장 효과적인 결과를 보였다.
- 혼합생약재: 단일 생약재의 혼합비율을(황기 : 오미자 : 길경) 각각 1:1:1, 1:2:1, 1:1:2, 2:1:1, 2:2:1 비율의 5구간으로 혼합하여 분석한 후, 최적의 혼합비율인 1:2:1로 혼합된 생약재를 실험재료로 사용하였다. 1:2:1로 혼합된 생약재는 용매의 농도, 추출 온도, 추출 시간, 입자의 크기 4가지 조건에 대해서는 각각의 조건별로 단일생약재의 추출조건과 동일하게 실시하였으며, 수율과 NO 억제활성 효과를 확인하였다. 또한 혼합 속도는 0, 50, 100, 150, 200 rpm의 5구간으로, 용매 분획별로는 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 순으로 분리하여 각각의 조건별로 수율과 NO 억제활성을 측정하여 비교하였다.
- 53가지의 한약재 추출물에 대하여 NO 억제 활성을 검색한 결과 구절초, 독활, 길경, 차즈기잎 등이 각각 89.4%, 86.0%, 84.7%, 73.4%로 높은 활성을 나타내었다(Table 1). 본 실험결과와 Kim(7)의 연구결과에서도 NO 억제 활성이 명확하다고 알려진 길경(P.
- )을 실험 대상으로 1차 선정하였다. HAse 억제 활성을 검색한 결과 황기, 오미자, 황금 등이 각각 67.2%, 50.6%, 64.7%로 높은 활성을 나타내었으며, 모과, 인삼, 백작약 등은 30% 이상의 활성을 보였고, 오가피, 우슬, 석창포, 당귀, 해동피, 갈근, 복분자 등도 10% 이상의 활성을 나타내었다(Table 1). 이들 중 수율과 HAse 저해 활성을 고려하여 황기(15)와 오미자를 실험 대상으로 2차 선정하였다.
- NO 억제활성 효과에 대한 각각의 최적 조건을 보면, 황기는 <0.85～2 mm, 0%, 6～30시간, 30oC, 오미자는 <2 mm, 95%, 6시간, 20～30oC, 길경은 95%, 24～36시간에서 추출한 시료가 가장 효과적이었다.
- (Astragalus membranaceus)와 오미자(Schisandra chinensis), 길경(P latycodon grandiflorum)을 최종 시료로 선정하였고, 이를 단독으로 사용하기보다는 유효성분의 항염증 및 항산화 효능에 대한 상승효과를 알아보기 위하여 혼합추출물의 최적조건을 확인하였다. 각 소재들을 1:2:1로 혼합한 혼합추출물에서 다양한 추출조건에 따라 단일 생약재 추출물에 비해 2배에서 4배까지의 수율 증가를 보였으며, NO 억제활성 효과도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 수율과 NO 억제활성을 고려할 경우 혼합추출물의 최적 추출 조건은 황기, 오미자, 길경의 혼합비율 1:2:1, 추출시간 12시간, 추출온도 30℃, 혼합 속도 50 rpm, 추출용매로 ethyl acetate이었다.
- 각각의 생약재와 혼합한 생약재의 발효주정 추출물에 대하여 HAse 저해 활성을 실험한 결과 1 g의 생약재로부터 최초의 추출조건(not grinded, 95% EtOH, 24시간, 실온, 0 rpm)으로 얻어진 시료에서 황기는 719.1 unit, 오미자는 3,503.0 unit, 길경은 143.3 unit의 HAse 억제 활성을 보였고 최적 추출조건(1:2:1, 12시간, 30oC, 50 rpm, ethyl acetate)으로 얻어진 혼합 추출물의 경우 9,305.8 unit의 HAse 저해 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 발효주정 추출물의 중량을 측정하기 위하여 동결건조 후 각 시료의 수율을 구하였다(Table 1). 강활, 초용담, 금은화 등은 각각 43.0%, 44.0%, 58.4%로 가장 높았으며, 산수유, 산사, 향부자, 여정자, 황금, 희첨 등도 20% 이상의 높은 수율을 보였다.
- 혼합 생약제의 각각의 조건에 따른 수율과 NO 억제 활성을 실험한 결과는 Table 3과 같다. 수율과 NO 억제 활성의 효과를 보면, 황기, 오미자, 길경을 각각 1:2:1로 혼합하여 추출한 시료가 가장 효과적인 것으로 확인되었다. 1:2:1 비율로 혼합한 생약재를 각각의 조건을 실험한 결과, 주정 농도는 95%, 추출 시간은 12시간, 추출 온도는 30℃, 혼합속도는 50 rpm, 추출 용매는 ethyl acetate에서 가장 효과적인 결과를 보였다.
- 수율과 NO 억제활성을 고려할 경우 혼합추출물의 최적 추출 조건은 황기, 오미자, 길경의 혼합비율 1:2:1, 추출시간 12시간, 추출온도 30℃, 혼합 속도 50 rpm, 추출용매로 ethyl acetate이었다. 위의 최적 조건을 적용한 혼합추출물은 HAse 저해 활성 실험에서 최초 추출물(not grinded, 95% EtOH, 24시간, 실온, 0 rpm)보다 약 16% 정도의 저해 상승효과가 나타났다. 이는 길경과 황기, 오미자의 상승작용 때문으로 사료된다.
- 85～2mm, 오미자는 <2 mm에서 NO 억제활성이 가장 효과적이었으며, 길경은 입자크기의 영향을 받지 않았다. 주정 농도는 황기가 0%, 오미자와 길경은 95%에서 추출한 시료가 NO 억제활성이 가장 효과적이었다. 추출 시간은 황기는 6～30시간, 오미자는 6시간, 길경은 24～36시간에서 추출한 시료가 가장 효과적인 결과를 보였다.
- 최적조건을 보면 입자 크기에서는 황기는 <0.85～2mm, 오미자는 <2 mm에서 NO 억제활성이 가장 효과적이었으며, 길경은 입자크기의 영향을 받지 않았다.
- 주정 농도는 황기가 0%, 오미자와 길경은 95%에서 추출한 시료가 NO 억제활성이 가장 효과적이었다. 추출 시간은 황기는 6～30시간, 오미자는 6시간, 길경은 24～36시간에서 추출한 시료가 가장 효과적인 결과를 보였다. 추출온도는 황기는 30℃, 오미자는 20～30℃에서 추출한 시료가 가장 효과적이었으며, 길경은 추출온도의 영향을 받지 않았다.
- 추출온도는 황기는 30oC, 오미자는 20～30oC에서 추출한 시료가 가장 효과적이었으며, 길경은 추출온도의 영향을 받지 않았다.
후속연구
- 이는 길경과 황기, 오미자의 상승작용 때문으로 사료된다. 이를 통해 황기와 오미자, 길경의 혼합추출물이 항염증, 항산화 및 항관절염에 활성을 갖는 유용한 물질로 사용 가능할 것이라 사료된다.
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