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문제 정의
- 본 연구를 통해 현행 이소말토올리고당 분석법의 한계를 극복하고 원료 시럽뿐만 아니라 발효유 중의 미량의 이소말토올리고당 함량을 신속, 정확하게 분석하기 위한 새로운 분석법을 개발하였다. IDF method와 dSPE 기술을 적용하여 전처리 방법을 개선하였고, 당 전용 컬럼과 ELSD를 이용하여 기기분석조건을 최적화하였다.
- 본 연구에서는 prebiotics의 주 원료로 최근 각광받고 있는 이소말토올리고당의 기능성을 검증하기 위해, 국내 및 일본에서 주로 사용되는 이소말토올리고당의 현행 분석법의 한계점을 극복하고, 원료 시럽뿐만 아니라 발효유 제품 중에 존재하는 미량의 이소말토올리고당을 신속 정확하고, 효과적으로 추출, 정제 및 정량하기 위한 신규 분석법 개발을 시도하였다.
제안 방법
- 본 연구를 통해 현행 이소말토올리고당 분석법의 한계를 극복하고 원료 시럽뿐만 아니라 발효유 중의 미량의 이소말토올리고당 함량을 신속, 정확하게 분석하기 위한 새로운 분석법을 개발하였다. IDF method와 dSPE 기술을 적용하여 전처리 방법을 개선하였고, 당 전용 컬럼과 ELSD를 이용하여 기기분석조건을 최적화하였다. 새롭게 개발된 분석법은 유효성 검증 절차에 의해 선택성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 회수율, 정확성 및 정밀성이 유효함을 확인하였다.
- 검량선을 작성하기 위한 working standard solution의 조제를 위해 이소말토올리고당 9종 100µL씩을 각각 취한 후 증류수 1 mL로 mass up한 후 이소말토올리고당 9종 mixture 1,000 mg/L가 되도록 조제한 후 이를 증류수로 희석하여 62.5, 125, 250, 500 mg/L가 되도록 조제하여 최종 working standard solution으로 사용하였다.
- 검출한계와 정량한계를 평가하기 위해 이소말토올리고당 9종 각각의 표준용액을 적정 농도로 희석하여 크로마토그램 상에서 Signal to noise ratio(S/N ratio)가 3일 때의 농도를 검출한계로, 10일 때의 농도를 정량한계로 설정하였다.
- 5 g phosphortungstic acid monohydrate를 첨가 후 100 mL 증류수로 녹이고 최종 증류수로 mass up한 후 20 mL의 glacial acetic acid를 첨가한 용액)을 첨가한 후 vortex mixer로 1분간 가볍게 vortexing하였다. 다음으로 dSPE technic을 적용한 정제과정을 위해 Primary Secondary Amine(PSA)과 C18 각각 50 mg을 첨가한 후 증류수로 10 mL이 되도록 mass up하였다. 그 후 10분간 방치시킨 후 이 과정을 2회 더 반복하면서 시험용액을 추출 및 정제하였다.
- 을 각각 50 mg을 첨가하여 dSPE 정제를 수행하였으며, 시료 중의 지방산, 유기산 및 기타 비극성 방해물질을 제거함으로써 이소말토올리고당 분석을 위한 전처리 방법을 최적화하였다. 발효유 3종류를 전처리하여 최종 추출된 용액에 대해 식품공전 방법에 의해 조단백질(KFDA, 2012b) 및 조지방(KFDA, 2012c)의 함량분석을 실시하였다. 분석결과 조지방은 전 시료에서 검출되지 않았으며, 조단백질은 0.
- 최적의 기기분석조건을 설정하기 위해 HPLC 및 ELSD를 이용하여 분석을 실시하였다. 발효유 중의 이소말토올리고당을 효과적으로 검출하기 위해 감도가 낮고 이동상의 기울기 용리가 불가능한 RID 대신 ELSD를 이용하여 분석을 실시하였다. 분석은 당 분석전용 컬럼(Prevail carbohydrate ES 5 µm, Alltech, USA)을 사용하였고, 이소말토올리고당 9종을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 올리고당 총 18종에 대한 분리에 사용하였다.
- 본 연구에서 개발된 신규 분석법을 이용하여 대전시내에서 유통중인 이소말토올리고당 시럽제품 8종과 발효유 9종에 대한 이소말토올리고당 정량 분석을 실시하였다. 시럽 제품에 대한 정량 분석 결과는 Table 3에 나타내었다.
- 최적의 기울기 용리 조건을 설정하기 위해 조건 설정 실험을 진행하였다. 본 연구에서 사용된 최적의 기울기 용리 조건은 아세토니트릴 함량이 0분에서 60분까지 95%에서 65%로 감소되고, 60분에서 75분까지 65%에서 50%, 75분에서 75.1분까지 50%에서 95%, 80분까지 95%에 95%로 조건을 변화시켰다. 이동상의 유속은 0.
- 본 연구에서는 primary secondary amine(PSA)와 C18을 각각 50 mg을 첨가하여 dSPE 정제를 수행하였으며, 시료 중의 지방산, 유기산 및 기타 비극성 방해물질을 제거함으로써 이소말토올리고당 분석을 위한 전처리 방법을 최적화하였다. 발효유 3종류를 전처리하여 최종 추출된 용액에 대해 식품공전 방법에 의해 조단백질(KFDA, 2012b) 및 조지방(KFDA, 2012c)의 함량분석을 실시하였다.
- 이소말토올리고당 9종, 기타 단당류, 이당류 및 올리고당의 분리능을 최적화하기 위해 당 전용 컬럼인 Prevail carbohydrate ES 5 µm를 사용하였다. 본 연구에서는 당류 18종의 분리능을 최적화하기 이동상으로 아세토니트릴과 물을 이용하여 기울기 용리 조건을 적용하였다. 다양한 기울기 용리조건 테스트 결과 아세토니트릴 함량이 0분에서 60분까지 95%에서 65%로 감소되고, 60분에서 75분까지 65%에서 50%, 75분에서 75.
- , 2002) 그리고 AOAC guideline (AOAC Committee report, 1989)에 의해 수행하였다. 분석법의 유효성 검증을 위해 선택성, 직선성, 검출한계와 정량한계, 회수율 실험을 통한 정확성 및 정밀성을 평가하였다. 유효성 검증에 관련된 실험은 모두 3반복으로 수행하였다.
- 식품공전법의 역상분배계 컬럼(φ4.6 mm×250 mm TSK GEL NH2-60, Tosoh, Japan)과 시차굴절계 검출기를 이용하여 이소말토올리고당 9종, 단당류, 이당류 및 기타올리고당 총 18종의 500 mg/L 표준물질 mixture를 측정한 후 얻은 크로마토그램을 Fig. 2(a)에 나타내었다.
- 분석법의 유효성 검증을 위해 선택성, 직선성, 검출한계와 정량한계, 회수율 실험을 통한 정확성 및 정밀성을 평가하였다. 유효성 검증에 관련된 실험은 모두 3반복으로 수행하였다. 이소말토올리고당 9종 각각의 표준물질을 62.
- 분석은 당 분석전용 컬럼(Prevail carbohydrate ES 5 µm, Alltech, USA)을 사용하였고, 이소말토올리고당 9종을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 올리고당 총 18종에 대한 분리에 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 물을 사용하였으며, 분자량이 동일하거나 유사한 당들을 분리하기 위해 각각의 이동상을 기울기 용리 조건으로 분석하였다. 최적의 기울기 용리 조건을 설정하기 위해 조건 설정 실험을 진행하였다.
- 이소말토올리고당 9종 각각에 대해 발효유 제품 중에 존재할 수 있는 수준인 100 mg/kg의 농도를 인위적으로 첨가하여 첨가 전ㆍ후의 회수율을 비교함으로써 회수율을 평가하였다. 일내 정확성을 측정하기 위해 하루에 3반복 실험을 하였으며, 일간 정확성을 측정하기 위해 3일간 반복 실험하였다.
- 유효성 검증에 관련된 실험은 모두 3반복으로 수행하였다. 이소말토올리고당 9종 각각의 표준물질을 62.5, 125, 250, 500, 1000 mg/L의 5개의 표준물질을 이용하여 직선성을 평가하였으며, 각 농도별로 intensity를 측정하여 검량선을 작성하였다. 직선성의 결과는 상관계수(correlation coefficient, r2)로 표현하였다.
- 이소말토올리고당 9종, 기타 단당류, 이당류 및 올리고당의 분리능을 최적화하기 위해 당 전용 컬럼인 Prevail carbohydrate ES 5 µm를 사용하였다.
- 이소말토올리고당 표준물질들의 직선성을 확인하였다. ELSD의 특성상 검량선은 linear하지 않고 quadratic한 특성을 가지므로 각각의 회귀방정식은 2차 방정식으로 표현하였으며(Peng et al.
- 이소말토올리고당 9종 각각에 대해 발효유 제품 중에 존재할 수 있는 수준인 100 mg/kg의 농도를 인위적으로 첨가하여 첨가 전ㆍ후의 회수율을 비교함으로써 회수율을 평가하였다. 일내 정확성을 측정하기 위해 하루에 3반복 실험을 하였으며, 일간 정확성을 측정하기 위해 3일간 반복 실험하였다. 정확성과 동일하게 일내 정밀성과 일간 정밀성을 측정하였으며, 결과값은 이소말토올리고당 9종의 각각의 피크에 대한 면적의 표준편차를 면적의 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다.
- 최적의 기기분석조건을 설정하기 위해 HPLC 및 ELSD를 이용하여 분석을 실시하였다. 발효유 중의 이소말토올리고당을 효과적으로 검출하기 위해 감도가 낮고 이동상의 기울기 용리가 불가능한 RID 대신 ELSD를 이용하여 분석을 실시하였다.
- 이동상은 아세토니트릴과 물을 사용하였으며, 분자량이 동일하거나 유사한 당들을 분리하기 위해 각각의 이동상을 기울기 용리 조건으로 분석하였다. 최적의 기울기 용리 조건을 설정하기 위해 조건 설정 실험을 진행하였다. 본 연구에서 사용된 최적의 기울기 용리 조건은 아세토니트릴 함량이 0분에서 60분까지 95%에서 65%로 감소되고, 60분에서 75분까지 65%에서 50%, 75분에서 75.
- 크로마토그램을 얻기 위한 분리용 컬럼으로는 당 분석 전용 컬럼(Prevail carbohydrate ES 5 µm, Alltech, USA)이 사용되었으며, 분석을 위한 분석기기로는 HPLC(Agilent 1100, Agilent, USA)와 검출기는 증기화 광산란 검출기(Evaporative Light Scattering Dtector, ELSD)인 ELSD(Alltech ELSD 2000ES, Alltech, USA)가 사용되었다.
대상 데이터
- 개발된 분석법 적용을 위한 분석시료는 이소말토올리고당 시럽 8종과 이소말토올리고당이 첨가된 발효유 9종이 사용되었으며, 17종 시료 모두 대전의 마트에서 유통중인 것을 구입하였으며, 구입 후 균질기로 충분히 균질시킨 후 시럽은 상온에서 보관하였으며, 발효유는 4℃ 이하의 냉장보관 후 분석에 사용하였다.
- 모든 실험에 사용된 물은 HPLC grade로 Budick & Jackson사(Korea)로부터 구입하였으며, 실험에 사용된 시약으로 zinc acegtate dihydrate, phosphotungstic acid monohydrate는 Sigma (USA)로부터 구입하였으며, glacial acetic acid는 Junsei사(Japan)로부터 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 실험기구는 일반적인 정량분석을 위해 이용되는 실험기구들이 사용되었으며, 전처리된 시약을 여과하기 위해 filter paper(Whatman filterpaper No.1, Whatman, England)가 사용되었으며, dispersive solid phase extraction(dSPE) clean-up 기술을 적용한 정제를 위해 primary secondary amine(PSA, Agilent, USA)과 C18 (Agilent, USA)이 사용되었다.
- 분석은 당 분석전용 컬럼(Prevail carbohydrate ES 5 µm, Alltech, USA)을 사용하였고, 이소말토올리고당 9종을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 올리고당 총 18종에 대한 분리에 사용하였다.
- 6 mm×250 mm TSK GEL NH2-60, Tosoh, Japan)이 사용되었다. 분석을 위한 분석기기로는 HPLC(Agilent 1100, Agilent, USA)와 검출기(RID, Waters, USA)가 사용되었다.
- 정량분석을 위해 사용된 9종의 이소말토올리고당 표준물질 중 nigerose, kojibiose, isomaltose, panose, isomaltotriose는 Sigma사(USA)로부터 구입하였으며, isomaltotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose는 US Bio사(USA)로부터 구입하였다. 이소말토올리고당의 선택성 및 다른 단당류, 이당류, 올리고당류와의 분리능을 확인하기 위해 이소말토올리고당 이외의 9종의 표준물질이 사용되었으며, fructose, glucose, sucrose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose는 Supelco (USA)로부터 구입하였다. 모든 실험에 사용된 물은 HPLC grade로 Budick & Jackson사(Korea)로부터 구입하였으며, 실험에 사용된 시약으로 zinc acegtate dihydrate, phosphotungstic acid monohydrate는 Sigma (USA)로부터 구입하였으며, glacial acetic acid는 Junsei사(Japan)로부터 구입하였다.
- 정량분석을 위해 사용된 9종의 이소말토올리고당 표준물질 중 nigerose, kojibiose, isomaltose, panose, isomaltotriose는 Sigma사(USA)로부터 구입하였으며, isomaltotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose는 US Bio사(USA)로부터 구입하였다. 이소말토올리고당의 선택성 및 다른 단당류, 이당류, 올리고당류와의 분리능을 확인하기 위해 이소말토올리고당 이외의 9종의 표준물질이 사용되었으며, fructose, glucose, sucrose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose는 Supelco (USA)로부터 구입하였다.
- 최종적으로 추출된 용액을 필터하기 위해 나일론 필터(Nylon 0.2 µm, Sartorius, Korea)가 사용되었다.
데이터처리
- 실험의 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 일간 정확성의 일별 실험결과에 대한 유의적인 차이를 확인하기 위해 일원배치분산분석(One-way ANOVA)에 의해 신뢰수준 95%에서 검증하였다.
- 일내 정확성을 측정하기 위해 하루에 3반복 실험을 하였으며, 일간 정확성을 측정하기 위해 3일간 반복 실험하였다. 정확성과 동일하게 일내 정밀성과 일간 정밀성을 측정하였으며, 결과값은 이소말토올리고당 9종의 각각의 피크에 대한 면적의 표준편차를 면적의 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다.
- 5, 125, 250, 500, 1000 mg/L의 5개의 표준물질을 이용하여 직선성을 평가하였으며, 각 농도별로 intensity를 측정하여 검량선을 작성하였다. 직선성의 결과는 상관계수(correlation coefficient, r2)로 표현하였다.
이론/모형
- 국내 공인분석법인 식품공전법과의 비교를 위해 배제형 이온교환계를 위한 분석용 컬럼(φ8 mm×200 mm MCI GEL CKO 4S, Mitsubishi chemical, Japan)과 가드 컬럼(φ8 mm×50 mm MCI GEL CKO 8S, Mitsubishi chemical, Japan)이 사용되었으며, 역상분배계의 적용을 위해 분석용 컬럼(φ4.6 mm×250 mm TSK GEL NH2-60, Tosoh, Japan)이 사용되었다.
- 본 연구에서 새롭게 개발된 분석법의 유효성 검증(validation)은 식약청 의약품 등 시험방법 밸리데이션에 대한 가이드라인 적용을 위한 해설서(KFDA, 2008), ICH harmonized tripartite guideline (ICH Expert Working Group, 2005), IUPAC technical report (Thompson et al., 2002) 그리고 AOAC guideline (AOAC Committee report, 1989)에 의해 수행하였다. 분석법의 유효성 검증을 위해 선택성, 직선성, 검출한계와 정량한계, 회수율 실험을 통한 정확성 및 정밀성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 ISO22662 IDF198 전처리 method인 milk and milk products-determination of lactose content by HPLC(ISO and IDF, 2007)에 사용된 전처리 방법에 추가적으로 잔류 지방 및 간섭물질의 제거를 위해 dispersive solid phase extraction (dSPE) clean-up technic (AOAC international, 2007)을 적용한 simple한 전처리 방법을 적용하였다.
- 현행 분석법의 시료 전처리 방법을 개선하기 위해 본 연구에서는 발효유 중의 ISO22662 IDF198 전처리 method인 milk and milk products-determination of lactose content by HPLC (ISO and IDF, 2007)에 사용된 전처리 방법을 적용하였으며, 시료 중에 잔류 가능한 지방 및 단백질과 같은 간섭물질을 추가적으로 제거하기 위해 최근의 연구에서와 같이 잔류농약의 신속 분석에서 효과적인 시료 전처리를 위해 이용되어지는 QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) method 중의 SPE 정제과정에서 사용되는 충진제를 이용하여 신속한 정제를 위해 새롭게 개발된 dSPE 기술을 적용하였다(AOAC international, 2007).
성능/효과
- 7%로, 일내, 일간 정확성 및 정밀성 모두 양호한 결과값을 얻었다. 3일간의 일간 정확성의 유의적인 차이를 검증하기 위해 일원 배치분산분석(One way anova)에 의한 검증 결과 신뢰수준 95%에서 일간 실험결과 간에는 유의적인 차이가 없었다.
- 이소말토올리고당 표준물질들의 직선성을 확인하였다. ELSD의 특성상 검량선은 linear하지 않고 quadratic한 특성을 가지므로 각각의 회귀방정식은 2차 방정식으로 표현하였으며(Peng et al., 2006), 그 결과, nigerose, kojibiose, isomaltose, pannose, isomaltotriose, isomaltotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose 모두 상관계수(correlation coefficient, r2)가 0.9999로 우수한 직선성을 나타내었다. 이소말토올리고당 9종의 검량선과 상관계수를 Fig.
- 발효유 b-g의 경우는 시럽에서의 분석결과와 거의 유사하다. Nigerose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose는 검출되지 않았으며, panose가 가장 높게 검출되었으며, 그 다음으로 isomaltose가 높게 검출되었으며, 그 외의 kojibiose, isomaltotriose, isomaltoheptaose는 불검출 혹은 미량 수준으로 검출되었다. 발효유 a의 경우도 b-g 시료와 유사하게 panose가 가장 높은 수준으로 검출되었으나, 다른 발효유 시료에서는 나타나지 않은 nigerose 및 isomaltohexaose가 미량의 수준으로 검출되었다.
- F와 H 시료의 경우는 다른 6종의 시료와는 다르게 isomaltose가 panose에 비해 더 높게 검출되었다. Panose와 isomaltotriose가 유사한 수준으로 검출되었으며, 다른 시료에서 볼 수 없었던 nigerose와 isomaltotetraose가 유사한 수준으로 검출되었다. 시중에서 유통중인 이소말토올리고당 시럽 검사 결과 중 합도 2-3인 Panose와 isomaltose가 가장 많은 함량을 구성하고 있었으며, 그 외 미량 수준으로 nigerose, kojibiose, isomaltotriose, isomaltotetraose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
- 3과 같이 나타내었다. 각각의 피크는 독립적으로 분리되어 시료 중에서 이소말토올리고당만을 선택적으로 분리 가능하였으며, 본 연구에서 개발된 전처리 및 기기분석 조건이 충분히 선택적임을 확인할 수 있었다.
- 이소말토올리고당 9종에 대한 검출한계 및 정량한계를 Table 2에 나타내었다. 검출한계와 정량한계가 가장 낮은 것은 isomaltoheptaose 로 각각 7.9, 25.9 mg/kg으로 가장 감도가 높았으며, isomaltose의 검출한계와 정량한계가 각각 22.1, 72.8 mg/kg으로 가장 낮은 감도를 나타내었다.
- 발효유 h와 i의 경우는 a-g 시료와는 다르게 isomaltotriose가 가장 높은 수준으로 검출되었으며, 그 다음으로 isomaltose, panose 수준으로 검출되었다. 그 외 kojibiose와 isomaltoheptaose가 미량 수준으로 검출되었으며, 다른 발효유와 마찬가지로 nigerose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose 는 검출되지 않았다.
- 본 연구에서는 당류 18종의 분리능을 최적화하기 이동상으로 아세토니트릴과 물을 이용하여 기울기 용리 조건을 적용하였다. 다양한 기울기 용리조건 테스트 결과 아세토니트릴 함량이 0분에서 60분까지 95%에서 65%로 감소되고, 60분에서 75분까지 65%에서 50%, 75분에서 75.1분까지 50%에서 95%, 80분까지 95%에 95%로 변화되도록 하였으며, 이동상의 유속은 모두 0.8 mL/min으로 분석 조건을 최적화시켰다. 컬럼의 온도는 30℃, 시료 주입량은 10 µL로 분석조건을 설정하였다.
- 또한 시장에서 유통 중인 시럽 및 발효유 제품을 분석한 결과 이전에 발표된 연구결과와 일치하는 결론을 얻었으며(Goffin et al., 2011), 이소말토올리고당을 구성하는 성분 중 panose, isomaltose 및 isomaltotriose가 가장 많은 비율을 차지하는 것을 확인하였다.
- Nigerose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose는 검출되지 않았으며, panose가 가장 높게 검출되었으며, 그 다음으로 isomaltose가 높게 검출되었으며, 그 외의 kojibiose, isomaltotriose, isomaltoheptaose는 불검출 혹은 미량 수준으로 검출되었다. 발효유 a의 경우도 b-g 시료와 유사하게 panose가 가장 높은 수준으로 검출되었으나, 다른 발효유 시료에서는 나타나지 않은 nigerose 및 isomaltohexaose가 미량의 수준으로 검출되었다. 발효유 h와 i의 경우는 a-g 시료와는 다르게 isomaltotriose가 가장 높은 수준으로 검출되었으며, 그 다음으로 isomaltose, panose 수준으로 검출되었다.
- 발효유 a의 경우도 b-g 시료와 유사하게 panose가 가장 높은 수준으로 검출되었으나, 다른 발효유 시료에서는 나타나지 않은 nigerose 및 isomaltohexaose가 미량의 수준으로 검출되었다. 발효유 h와 i의 경우는 a-g 시료와는 다르게 isomaltotriose가 가장 높은 수준으로 검출되었으며, 그 다음으로 isomaltose, panose 수준으로 검출되었다. 그 외 kojibiose와 isomaltoheptaose가 미량 수준으로 검출되었으며, 다른 발효유와 마찬가지로 nigerose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose 는 검출되지 않았다.
- 발효유 제품중의 이소말토올리고당 분석결과 시럽에서의 분석결과와 거의 유사하게 나타났으며, 시럽에서와 마찬가지로 기존에 발표된(Goffin et al., 2011) 연구결과에서 언급한 것과 일치하는 결론을 얻었으며, 발효유 중의 이소말토올리고당 함량의 총합은 0.317±0.007-1.624±0.050 g/100 g 수준으로 검출되었다.
- 발효유 3종류를 전처리하여 최종 추출된 용액에 대해 식품공전 방법에 의해 조단백질(KFDA, 2012b) 및 조지방(KFDA, 2012c)의 함량분석을 실시하였다. 분석결과 조지방은 전 시료에서 검출되지 않았으며, 조단백질은 0.036-0.075% 수준으로 측정되었다. 이를 통해 새롭게 개발된 시료전처리 방법은 발효유 중의 간섭물질을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
- 시럽 제품에 대한 정량 분석 결과는 Table 3에 나타내었다. 시럽 A, C, D는 nigerose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose는 검출되지 않았으며, panose가 약 11%로 가장 높게 검출되었으며, isomaltose, isomaltotriose, isomaltoheptaose, kojibiose 함량 순으로 검출되었다. 시럽 B와 E의 경우는 nigerose, kojibiose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose는 검출되지 않았으며, panose가 가장 높게 검출되었으며, 그 다음은 isomaltose가 높게 검출되었으며, isomaltotriose, isomaltoheptaose는 비슷한 수준으로 검출되었다.
- 시럽 A, C, D는 nigerose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose는 검출되지 않았으며, panose가 약 11%로 가장 높게 검출되었으며, isomaltose, isomaltotriose, isomaltoheptaose, kojibiose 함량 순으로 검출되었다. 시럽 B와 E의 경우는 nigerose, kojibiose, isomlatotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose는 검출되지 않았으며, panose가 가장 높게 검출되었으며, 그 다음은 isomaltose가 높게 검출되었으며, isomaltotriose, isomaltoheptaose는 비슷한 수준으로 검출되었다. G 시럽의 경우는 nigerose, kojibiose, isomlatotetraose, isomaltopentaose는 검출되지 않았으며, 다른 시료와는 달리 isomaltotriose가 검출되지 않았고, isomaltohexaose가 미량 검출되었다.
- 시료 8종에 대한 이소말토올리고당 함량의 총합은 14.488±0.146-32.892±0.429 g/100 g 수준으로 검출되었다.
- Panose와 isomaltotriose가 유사한 수준으로 검출되었으며, 다른 시료에서 볼 수 없었던 nigerose와 isomaltotetraose가 유사한 수준으로 검출되었다. 시중에서 유통중인 이소말토올리고당 시럽 검사 결과 중 합도 2-3인 Panose와 isomaltose가 가장 많은 함량을 구성하고 있었으며, 그 외 미량 수준으로 nigerose, kojibiose, isomaltotriose, isomaltotetraose, isomaltohexaose, isomaltoheptaose가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 중합도가 4 이상인 이소말토올리고당은 아주 미량으로 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 중합도 5의 isomaltopentaose는 어느 시료 중에서도 검출되지 않았다.
- 075% 수준으로 측정되었다. 이를 통해 새롭게 개발된 시료전처리 방법은 발효유 중의 간섭물질을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
- 일내 및 일간 정확성 및 정밀성을 측정한 결과 일내 정확성은 84.3±4.5-104.9±6.5%, 일내 정밀성은 0.8-7.7%로 나타났으며, 일간 정확성 및 정밀성을 측정한 결과 일간 정확성은 89.9±0.9-102.9±4.8%, 일간 정밀성은 1.0-5.7%로, 일내, 일간 정확성 및 정밀성 모두 양호한 결과값을 얻었다.
- 2(a)에 나타내었다. 즉, 아세토니트릴 : 물 (63:37, v/v)의 이동상을 단일 농도구배로 해서 시차굴절계 검출기로 분석한 결과 분자량이 유사하거나 동일한 단당류와 이당류가 거의 동시에 나와 분리능이 매우 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 특히 22분 이후에 나오는 당류는 시차굴절계 검출기의 낮은 감도로 인해 500 mg/L 수준의 농도도 검출이 불가능하였다.
- 특히 중합도가 4 이상인 이소말토올리고당은 아주 미량으로 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 중합도 5의 isomaltopentaose는 어느 시료 중에서도 검출되지 않았다.
- 크로마토그램상의 분리된 당류 18종은 단당류 2종(fructose, glucose), 2당류 5종(sucrose, nigerose, maltose, kojibiose, isomaltose), 3당류 3종(maltotriose, pannose, isomaltotriose), 4당류(maltotetraose, isomaltotetraose), 5당류 2종(maltopentaose, isomaltopentaose), 6당류 2종(maltohexaose, isomaltohexaose), 7당류 2종(maltoheptaose, isomaltoheptaose)이다. 현행분석법에서는 단일 용리구배 조건을 사용함으로써 중합도별 당이 거의 분리가 이루어지지 않고 한꺼번에 용출되어 각각의 당 피크에 대한 매우 낮은 선택성을 나타냈으나, 최적화된 분석 조건을 적용한 결과 Fig. 2(b)에서 보는 바와 같이 중합도별 그리고 분자량이 유사하거나 동일한 당들도 뚜렷하게 분리가 되었음을 확인할 수 있었다.
- 회수율 측정 결과 이소말토올리고당 9종에 대해 84.3±6.8-104.9±6.5%로 양호한 결과값을 나타내었다.
후속연구
- 본 연구 결과는 지방 및 단백질이 많고 유화의 특성을 가진 발효유 중에서의 이소말토올리고당 함량을 신속, 정확하게 분석할 수 있는 기술이 될 것으로 기대된다. 이러한 분석 기술은 향후 식품산업현장에는 물론 발효유를 소비하는 소비자들에게 발효유의 기능성에 대한 정확한 평가를 가능하게 하고, 이소말토올리고당 뿐만 아니라 당 분석을 위한 기초 연구자료로 활용될 것으로 기대된다.
- 본 연구 결과는 지방 및 단백질이 많고 유화의 특성을 가진 발효유 중에서의 이소말토올리고당 함량을 신속, 정확하게 분석할 수 있는 기술이 될 것으로 기대된다. 이러한 분석 기술은 향후 식품산업현장에는 물론 발효유를 소비하는 소비자들에게 발효유의 기능성에 대한 정확한 평가를 가능하게 하고, 이소말토올리고당 뿐만 아니라 당 분석을 위한 기초 연구자료로 활용될 것으로 기대된다.
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