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문제 정의
- 따라서 한약처방에 대한 성분 분석 검증에 대한 필요성이 제기되고 있다.3,4) 이에 따라 痰飮으로 인해 기침, 구토, 메스꺼움 및 가슴이 두근거리는 것을 치료하는 처방5)인 二陳湯의 성분에 대한 품질관리를 제시하고자 본 실험을 시행하였다.
- 본 연구에서는 二陳湯의 구성약재 중 반하의 homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde, 진피의 hesperidin, 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin 및 생강의 6-gingerol 등 6종 성분에 대하여 광다이오드 어레이 (photodiode array, PDA) 검출기가 결합된 고성능액체크로마토그래피 (high-performance liquid chromatography, HPLC) 를 이용하여 성분의 정량과 품질관리 방법을 확립하기 위해 동시분석을 실시하였다.
- 二陳湯의 구성 약재 중 陳皮의 주요성분인 hesperidin, 甘草의 liquiritin과 glycyrrhizin, 生薑의 6-gingerol 및 半夏의 homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde에 대한 동시분석법을 확립하고자 시간대 별로 용매 구성 비율을 달리 하여 6가지 지표성분의 동시 정량 분석법을 확립하였다. 이동상에 1.0% 초산을 첨가하여 꼬리 끌림 (tailing)현상을 줄이고 분리능을 높이고자 하였다. 그 결과 6종의 성분이 35분 이내에 모두 분리되었다.
제안 방법
- 6종 성분에 대해 UV 최대 흡광도 및 정량 한계농도 등을 고려하여 최적의 UV 파장은 254 nm 및 280nm에서 분석을 하였다.
- 0 mL/min으로 하였고 시료는 10 μL주입하였다. 6종 성분의 검출은 PDA 검출기를 이용하여 254 nm와 280 nm 의 파장에서 분석하였다. 이동상은 Table 1에서와 같이 기울기용매 조건으로 최적의 분리조건을 확립하였다.
- Liquiritin, glycyrrhizin, hesperidin, 6-gingerol, homogentisic acid 및 3,4-dihydroxybenzaldehyde의 무게를 정확히 칭량하여 methanol에 녹여 사용하였다. 6종 모두 1.
- 二陳湯 시료 200 mg을 정밀하게 달아 주요성분 liquiritin의 최종 농도 8, 19 및 38 μg/mL, glycyrrhizin의 최종농도 10, 25 및 50 μg/mL, hesperidin의 최종농도 20, 50 및 100 μg/mL 및 6-gingerol의 최종농도 1, 2 및 4 μg/mL가 되도록 첨가하여 검액과 동일하게 전처리하였다.
- 二陳湯의 구성 약재 중 陳皮의 주요성분인 hesperidin, 甘草의 liquiritin과 glycyrrhizin, 生薑의 6-gingerol 및 半夏의 homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde에 대한 동시분석법을 확립하고자 시간대 별로 용매 구성 비율을 달리 하여 6가지 지표성분의 동시 정량 분석법을 확립하였다. 이동상에 1.
- 二陳湯의 구성약재인 甘草 (1.88 g), 半夏 (7.50 g), 生薑 (3.75 g), 茯苓 (3.75 g) 그리고 陳皮 (3.75 g)를 배합하여 추출기 (Cosmos 660, Inchon, Korea)에 추출하였다. 물의 양은 약재 양의 10배로 첨가하여 100℃에서 2시간 전탕하였다.
- 二陳湯의 주요 성분인 liquiritin, glycyrrhizin, hesperidin, 6-gingerol, homogentisic acid 및 3,4-dihydroxybenzaldehyde (Fig. 1)를 분석하기 위하여 Shimadzu사의 LC-20A 시스템을 사용하여 분석하였고 6종 성분의 분리를 위해 Gemini C18 (5 um, 4.6 × 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였으며 칼럼 온도는 40℃로 유지하였다.
- 각 성분의 최적의 PDA 검출파장으로 254 nm와 280 nm를 선정하여 검출하였다. 각 성분의 peak의 retention time과 UV spectra를 비교하여 6종의 지표성분을 확인하였다. 확립된 분석법에 의해 homogentisic acid는 5.
- 분석된 결과를 토대로 y축은 피크면적, x축은 표준물질의 농도로 검량선을 작성하였다. 검량선 (y=ax+b)은 면적을 이용하여 계산하였고, 상관계수 (R2) 값을 통해서 직선성을 확인하였다. 검출한계와 정량한계는 분석 물질의 검출 및 정량이 가능한 농도를 확인하기 위해 신호 대 잡음비로 3과 10을 기준으로 계산하였다.
- 동일 시료에 실험 환경 및 기타 외부요인으로 인한 변화 정도를 확인하기 위하여 균일한 검체를 여러 번 반복 측정하여 측정값의 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 구하여 정밀성을 판단했다. 정밀성 평가는 일내와 일간시험을 통하여 실시하였다.
- 6종 성분에 대해 UV 최대 흡광도 및 정량 한계농도 등을 고려하여 최적의 UV 파장은 254 nm 및 280nm에서 분석을 하였다. 또한, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성 및 정밀성 등의 실험을 통하여 분석법에 대한 검증을 실시하였다. 이러한 동시분석법 확립을 통해 한약처방의 품질관리에 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구는 濕痰으로 인한 증상을 치료하는 대표적인 처방인 二陳湯의 homogentisic acid, 3,4- dihydroxybenzaldehyde, liquiritin, hesperidin, glycyrrhizin 및 6-gingerol 등 6종 성분에 대해 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석법을 확립하였다. 6종 성분에 대해 UV 최대 흡광도 및 정량 한계농도 등을 고려하여 최적의 UV 파장은 254 nm 및 280nm에서 분석을 하였다.
- 동일 시료에 실험 환경 및 기타 외부요인으로 인한 변화 정도를 확인하기 위하여 균일한 검체를 여러 번 반복 측정하여 측정값의 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 구하여 정밀성을 판단했다. 정밀성 평가는 일내와 일간시험을 통하여 실시하였다.
- 정확성 평가는 회수율 시험을 통해 검증하였으며, 회수율 시험은 二陳湯 시료에 liquiritin, glycyrrhizin, hesperidin 및 6-gingerol을 3가지 농도로 첨가하여 분석을 통해 평가하였다. 二陳湯 시료 200 mg을 정밀하게 달아 주요성분 liquiritin의 최종 농도 8, 19 및 38 μg/mL, glycyrrhizin의 최종농도 10, 25 및 50 μg/mL, hesperidin의 최종농도 20, 50 및 100 μg/mL 및 6-gingerol의 최종농도 1, 2 및 4 μg/mL가 되도록 첨가하여 검액과 동일하게 전처리하였다.
- 직선성의 평가를 위해서 표준물질 homogentisic acid는 0.39−50.00 μg/mL, 3,4-dihydroxybenzaldehyde는 0.16−20.00 μg/mL, liquiritin은 0.78−100.00 μg/mL, hesperidin은 2.34−300.00 μg/mL, glycyrrhizin은 1.56−200.00μg/mL 및 6-gingerol은 0.16−20.00 μg/mL의 범위에서 3회 반복 실험하였다.
- 표준용액을 이용하여 시료 변화에 따른 기계의 변화를 보기 위하여 재현성은 5회 반복 주입을 통해 peak의 면적과 머무름 시간의 재현성을 확인하였다.
- 확립된 동시분석법에 대하여 직선성, 범위, 검출한계, 정량한계, 재현성, 회수율 및 정밀성 등을 통해서 동시분석법의 검증을 실시하였다.
- 확립된 분석법을 이용해 二陳湯의 6가지 지표 성분에 대하여 동시분석을 수행하여 함량을 확인하였다. 동결 건조된 시료에 대하여 homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde는 검출이 되지 않았으며, liquiritin은 4.
대상 데이터
- (Osaka, Japan)에서 각각 구입하였다. Glycyrrhizin과 hesperidin은 Biopurify Phytochemicals Ltd. (Chengdu, China)에서 구입하였으며, homogentisic acid와 3,4- dihydroxybenzaldehyde은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 이들 표준품의 순도는 모두 98.
- HPLC 분석을 위한 water와 acetonitrile은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며 acetic acid는 Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 二陳湯의 구성 한약재인 甘草(Glycyrrhiza uralensis)와 半夏 (Pinellia ternate)는 ㈜HMAX (Jecheon, Korea)에서 구입하였다. 生薑 (Zingiber officinale), 茯苓 (Poria cocos) 및 陳皮 (Citrus unshiu)는 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서 구입하였다. 본 실험에 사용된 二陳湯 구성생약은 전문가의 확인을 받은 후 사용하였으며, 시료는 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
- 그 결과 6종의 성분이 35분 이내에 모두 분리되었다. 각 성분의 최적의 PDA 검출파장으로 254 nm와 280 nm를 선정하여 검출하였다. 각 성분의 peak의 retention time과 UV spectra를 비교하여 6종의 지표성분을 확인하였다.
- 生薑 (Zingiber officinale), 茯苓 (Poria cocos) 및 陳皮 (Citrus unshiu)는 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서 구입하였다. 본 실험에 사용된 二陳湯 구성생약은 전문가의 확인을 받은 후 사용하였으며, 시료는 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
- 본 실험에 사용된 二陳湯의 구성 한약재인 甘草(Glycyrrhiza uralensis)와 半夏 (Pinellia ternate)는 ㈜HMAX (Jecheon, Korea)에서 구입하였다. 生薑 (Zingiber officinale), 茯苓 (Poria cocos) 및 陳皮 (Citrus unshiu)는 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 표준품 liquiritin과 6-gingerol은 ㈜천연물화학 (Daejeon, Korea)과 Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan)에서 각각 구입하였다. Glycyrrhizin과 hesperidin은 Biopurify Phytochemicals Ltd.
- Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며 acetic acid는 Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 분석을 위해 사용한 HPLC는 펌프 (LC20AT), on-line degasser (DGU-20A3), 컬럼 오븐 (CTO-20A), autosampler (SIL-20AC) 및 PDA검출기 (SPDM20A)로 구성된 HPLC LC-20A 시스템 (Shimadzu Co, Kyoto, Japan)을 사용하였다. 분석 data처리에는 LCsolution software (Version 1.
- 물의 양은 약재 양의 10배로 첨가하여 100℃에서 2시간 전탕하였다. 전탕 후 동결 건조하여 3.81 g의 시료를 제조하였다(수율 18.5%). 동시분석을 위해 동결 건조된 二陳湯 추출물 200 mg을 정확히 칭량하여 물을 넣어 20 mL로 맞춘 후 0.
데이터처리
- 검량선 (y=ax+b)은 면적을 이용하여 계산하였고, 상관계수 (R2) 값을 통해서 직선성을 확인하였다. 검출한계와 정량한계는 분석 물질의 검출 및 정량이 가능한 농도를 확인하기 위해 신호 대 잡음비로 3과 10을 기준으로 계산하였다.
성능/효과
- 二陳湯의 homogentisic acid, 3,4-dihydroxybenzaldehyde, liquiritin, hesperidin, glycyrrhizin 및 6-gingerol의 retention time과 peak area 값을 측정한 결과 6종 성분 대한 RSD (%) 값이 0.3% 및 1.05% 이내로 양호한 재현성을 나타냈다 (Table 3).
- 동결 건조된 시료에 대하여 homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde는 검출이 되지 않았으며, liquiritin은 4.22−4.38 mg/g, glycyrrhizin은 6.67−6.70 mg/g, hesperidin은 10.77−10.92 mg/g 및 6-gingerol은 0.10−0.14 mg/g으로 검출되었다 (Table 6).
- 동일한 시료의 변이성과 반복성을 측정하기 위해 직선성의 농도구간 중 시료의 농도 3개를 5회 반복하여 일내와 일간의 정밀성을 평가한 결과, 일내의 RSD (%)는 0.03−0.84%, 일간의 RSD (%)값은 0.05−1.00%로 나타났다.
- 분석법의 정확성을 측정하기 위해 확인된 표준 물질 (liquiritin, hesperidin, glycyrrhizin 및 6-gingerol)을 3가지의 농도로 성분이 확인된 二陳湯시료에 첨가하여 회수율시험을 시험한 결과, liquiritin은 97.34−99.58%, hesperidin은 96.17 −96.43%, glycyrrhizin은 98.57−101.90% 및 6-gingerol은 96.94−99.76% 범위로 나타났다.
- 00%로 나타났다. 일내와 일간의 RSD (%) 값이 모두 1.6% 이하로 양호한 정밀성을 확인하였다 (Table 5).
- 각 성분의 peak의 retention time과 UV spectra를 비교하여 6종의 지표성분을 확인하였다. 확립된 분석법에 의해 homogentisic acid는 5.38분, 3,4-dihydroxybenzaldehyde는 9.17분, liquiritin은 14.45분, hesperidin은 16.75분, glycyrrhizin은 30.39분, 6-gingerol은 31.54분에서 각각 검출되었다 (Fig. 2).
- 확립된 분석법을 토대로 peak area값과 농도를 이용해 검량선을 작성한 결과, 상관계수 (R2)는 0.9997 이상으로 매우 양호한 직선성을 보였다. 검출한계와 정량한계는 0.
후속연구
- 또한, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성 및 정밀성 등의 실험을 통하여 분석법에 대한 검증을 실시하였다. 이러한 동시분석법 확립을 통해 한약처방의 품질관리에 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
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