[논문]이진탕의 생쥐 소장 카할세포 향도잡이 전압에 미치는 효능에 관한 연구

한동훈; 김정남; 김병주

doi:10.14374/hfs.2020.28.1.71

이진탕의 생쥐 소장 카할세포 향도잡이 전압에 미치는 효능에 관한 연구
Effects of Yijin-tang on Pacemaker Potentials in Interstitial Cells of Cajal of Murine Small Intestine 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.28 no.1, 2020년, pp.71 - 80

한동훈 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부) , 김정남 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부) , 김병주 (부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Obejectives : The purpose of this study was to investigate the effects of Yijin-tang on pacemaker potentials of small intestinal interstitial Cells of Cajal (ICC). Methods : To dissociate the ICC, we used enzymatic digestions from the small intestine in mice. The electrophysiological whole-cell patch-clamp configuration was used to record pacemaker potentials in the cultured ICC and the in vivo effects of Yijin-tang on GI motility were investigated by calculating percent intestinal transit rates (ITR). Results : 1. The ICC generated pacemaker potentials in the murine small intestine. Yijin-tang produced membrane depolarization with concentration-dependent manners in the current clamp mode. 2. Pretreatment with a Ca2+ free solution and thapsigargin, a Ca2+-ATPase inhibitor in the endoplasmic reticulum, stopped the pacemaker potentials. In the case of Ca2+-free solutions and thapsigargin, Yijin-tang did not induce membrane potential depolarizations. 3. U73122, a phospholipase C (PLC) inhibitors, blocked the Yijin-tang-induced membrane potential depolarizations. However, U73343, an inactive PLC inhibitors, did not block. 4. In the presence of protein kinase C (PKC) inhibitors, staurosporine or Rottlerin, Yijin-tang depolarized the pacemaker potentials. However, in the presence of Go6976, Yijin-tang did not depolarize the pacemaker potentials. 5. In mice, intestinal transit rate (ITR) values were significantly and dose-dependently increased by the intragastric administration of Yijin-tang. Conclusions : These results suggest that Yijin-tang can modulate the pacemaker activity of ICC through an internal/external Ca2+ and PLC/PKC-dependent pathway in ICC. In addition, Yijin-tang is a good candidate for the development of a prokinetic agent.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effects of Yijin-tang on pacemaker potentials in cultured murine small intestinal ICC.
그림 Fig. 2. Effects of an external Ca²⁺-free solution or thapsigargin, a Ca²⁺-ATPase inhibitor of endoplasmic reticulum on Yijin-tang-induced pacemaker potentials in cultured murine small intestinal ICC.
그림 Fig. 3. Effects of phospholipase C (PLC) inhibitors on Yijin-tang-induced pacemaker potentials in cultured murine small intestinal ICC.
그림 Fig. 4. Effects of protein kinase C (PKC) inhibitors on Yijin-tang-induced pacemaker potentials in cultured murine small intestinal ICC.
그림 Fig. 5. Effect of Yijin-tang on intestinal transit rate (ITR) in mice.

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

하지만 이진탕에 의한 카할세포에서 작용에 대한 연구는 부족한 현실이다. 본 연구에서는 이진탕의 카할세포에서의 효능 및작용기전을 확인하고 생체내(in vivo) 동물모델에서장운동 영향을 확인하는 기초적 연구를 수행하고자하였다.
생쥐 소장 카할세포의 향도잡이 전위에서 이진탕에 의한 조절능을 알아 보았다. 이진탕은 농도 의존적으로 향도잡이 전위를 탈분극(depolarization)을 일으키지만 진폭(amplitude)은 변함없음을 알 수 있다 (Fig.
이번 연구에서는 이진탕에 의한 소장 카할세포에서 향도잡이 전압에 미치는 효능과 작용 기전 및 위장관운동성에 미치는 효능을 알아보았다. 본 연구에서 보면 이진탕은 카할세포 향도잡이 전압의 탈분극을 일으키고 (Fig.

가설 설정

Effects of protein kinase C (PKC) inhibitors on Yijin-tang-induced pacemaker potentials in cultured murine small intestinal ICC. (A) Staurosporine did not block the Yijin-tang-induced membrane depolarizations. (B) Go6976 blocked the Yijin-tang-induced membrane depolarizations.
(B) The application of U73343, an inactive PLC inhibitor did not show any influence on thegeneration of pacemaker currents and U73343 did not block the Yijin-tang-inducedmembrane depolarizations. (C) Depolarization responses to Yijin-tang in PLC inhibitors aresummarized. Bars represent the mean values ± S.
(B) Thapsigargin (5 μM) stopped the generation of pacemaker potentials and thapsigargin blocked the Yijin-tang-induced membrane depolarizations. (C) Depolarization responses to Yijin-tang in the external Ca²⁺-free solution and in the presence of thapsigargin are summarized. Bars represent the mean values ± S.
(B) Go6976 blocked the Yijin-tang-induced membrane depolarizations. (C) Rottlerin did not block the Yijin-tang-induced membrane depolarizations. (D) Depolarization responses to Yijin-tang in PKC inhibitors are summarized.
(C) Rottlerin did not block the Yijin-tang-induced membrane depolarizations. (D) Depolarization responses to Yijin-tang in PKC inhibitors are summarized. Bars represent the mean values ± S.

제안 방법

정상 생쥐에 이진탕을 위내 투여(intragastric administration)후 30분이 지나 Evans blue를 구위관(orogastric tube)을 이용하여 위내 투여하였다. 다시 30분이 지난 후 생쥐 장에서 Evans blue가 유문(pylorus)에서장까지 이동한 거리를 측정하였다. 전체 장 거리에서Evans blue가 이동한 거리의 비율로 ITR을 결정하였다.
단백질인산화효소 C (protein kinase C, PKC) 기전의 관련성을 알아보기 위해서 다양한 PKC 억제제를 이용하였다. PKC 억제제로는 폭넓은 효능(broadspectrum)을 지닌 PKC 억제제인 staurosporine, 칼슘 의존적(calcium-dependent) PKC 억제제인 Go6976,칼슘 비의존적 (calcium-independent) PKC 억제제인 rottlerin 등이 있다.
생쥐 소장 카할세포의 향도잡이 전위에서 세포 내외 Ca²⁺ 농도 조절능을 알아 보았다. 세포밖 Ca²⁺을 제거하면 향도잡이 전위 발생이 억제되고 이 조건에서 이진탕에 의한 탈분극 반응이 나타나지 않았다(Fig.
3). 세포내 PKC 기전의 관련성을 알아보기 위해서 다양한 PKC 억제제를 이용하여 보니 칼슘의존적(calcium-dependent) PKC 억제제인 Go6976에 의해 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극은억제 되었고, 그 외 다른 PKC 억제제인 staurosporine이나 rottlerin 등에 의해서는 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극에 아무런 영향을 미치지 못했다(Fig. 4). 마지막으로 이진탕에 의한 장 이동능(ITR)을 조사해 보니 이진탕 농도가 증가할수록 ITR이 증가하는 현상을 확인하였다 (Fig.
이진탕에 의한 장 이동능력은 Evans blue solution (5%)에 의한 장 이동거리(distance)로 측정하였다. 정상 생쥐에 이진탕을 위내 투여(intragastric administration)후 30분이 지나 Evans blue를 구위관(orogastric tube)을 이용하여 위내 투여하였다.
다시 30분이 지난 후 생쥐 장에서 Evans blue가 유문(pylorus)에서장까지 이동한 거리를 측정하였다. 전체 장 거리에서Evans blue가 이동한 거리의 비율로 ITR을 결정하였다. 같은 날 정상 생쥐와 위장관 운동 질환 생쥐를모두 실험하였고, 다른 한약재와의 위장관 운동능 비교를 위해서 지실(Poncirus trifoliataRaf.
이진탕에 의한 장 이동능력은 Evans blue solution (5%)에 의한 장 이동거리(distance)로 측정하였다. 정상 생쥐에 이진탕을 위내 투여(intragastric administration)후 30분이 지나 Evans blue를 구위관(orogastric tube)을 이용하여 위내 투여하였다. 다시 30분이 지난 후 생쥐 장에서 Evans blue가 유문(pylorus)에서장까지 이동한 거리를 측정하였다.

대상 데이터

전체 장 거리에서Evans blue가 이동한 거리의 비율로 ITR을 결정하였다. 같은 날 정상 생쥐와 위장관 운동 질환 생쥐를모두 실험하였고, 다른 한약재와의 위장관 운동능 비교를 위해서 지실(Poncirus trifoliataRaf., PF)을 사용하였다.¹³⁾ PF는 대한민국에서 가장널리 이용되는 한약재로 강력한 위장관 운동 촉진제로 알려지고 있으며 다양한 위장관 운동 질환 치료에이용되고 있다.
실험에 사용한 이진탕은 한국신약 제약회사(HANKOOKSHINYAK Pharmaceutical CO. LTD., Nonsan, Korea; http:// www.hsp.co.kr/)에서 구입하여 사용하였다. 증류수 에 0.
포스포리페이즈(phospholipase) C (PLC)기전의 관련성을 알아보기 위해서 활성형 PLC 억제제인 U73122을 이용하였다. U73122을 주면 카할세포 의 향도잡이 전위 발생이 억제되고, 이때 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극은 억제 되었다 (Fig.

데이터처리

전압 또는 전류는 standardpatch clamp amplifiers를 통해 증폭시키며, 나오는 신호는 디지털 오실로스코프 및 생리적 기록기를 통해서 관찰된다. 세포막 전류는 -70 mV 의 유지전압에 고정하여 기록하며 얻어진 결과는 pClamp등의 프로그램을 통해 분석처리하게 된다. 막전압 또는 전류를 기록하는 동안 세포외 관류 용액의 조성은 다음과같다.
실험성적은 평균±표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student'st-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한차이가 있는 것으로 판정하였다.

성능/효과

PKC 억제제로는 폭넓은 효능(broadspectrum)을 지닌 PKC 억제제인 staurosporine, 칼슘 의존적(calcium-dependent) PKC 억제제인 Go6976,칼슘 비의존적 (calcium-independent) PKC 억제제인 rottlerin 등이 있다.¹⁶⁾ 일단 모든 PKC 억제제는카할세포의 향도잡이 전위 발생에는 아무런 영향이없었다 (Fig. 4A-4C). Staurosporine과 rottlerin을주면 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극이 나타났고 (Fig.
현재까지 카할세포의 손실이나 과발현과 관련된 질환으로는 achalasia, Chaga's disease, infantile hypertropicpyloric stenosis, diabetic gastroparesis, chronicidiopathic intestinal pseudoobstrction, Hirschsprung'sdisease, slow transit constipation, ulcerative colitis,induced inflammatory bowel disease, gastrointestinalstromal tumor (GIST) 등이 있다.²⁸⁾ GIST를 제외한대부분의 질환에서는 카할세포의 수가 감소함으로써 pacemaker 기능 손실로 인한 위장관 운동 장애로 추정하고 있다.
4A-4C). Staurosporine과 rottlerin을주면 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극이 나타났고 (Fig. 4A and 4C), Go6976을 주면 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극은 억제 되었다 (Fig.4B). 30 mg/ml 이진탕에서 탈분극이 일어나는 정도는 staurosporine가 있는 경우 23.
다른 한약재와 의 효능 비교를 위해 위장관 운동성 연구에 많이 사 용되는 PF (1 g/kg)를 투여해보니 평균 ITR은 54.3±1.5 % (P＜0.01)로 나타났다.
2). 또 세포내 PLC 기전의 관련성을 알아보기 위해서 PLC 억제제인 U73122을 이용하여 보니 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극은 억제 됨을 알수 있었다 (Fig. 3). 세포내 PKC 기전의 관련성을 알아보기 위해서 다양한 PKC 억제제를 이용하여 보니 칼슘의존적(calcium-dependent) PKC 억제제인 Go6976에 의해 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극은억제 되었고, 그 외 다른 PKC 억제제인 staurosporine이나 rottlerin 등에 의해서는 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극에 아무런 영향을 미치지 못했다(Fig.
2A). 또한 세포내 Ca²⁺ 농도 조절 기관인 근소포체의 Ca2+-ATPase 작용을 억제하는 thapsigargin에 의해서 향도잡이 전위 발생이 억제되고 이 조건에서 이진탕에 의한 탈분극 반응 역시 억제 되었다(Fig. 2B). 30 mg/ml 이진탕에서 탈분극이 일어나는정도는 세포밖 Ca²⁺제거한 경우는 0.
4). 마지막으로 이진탕에 의한 장 이동능(ITR)을 조사해 보니 이진탕 농도가 증가할수록 ITR이 증가하는 현상을 확인하였다 (Fig. 5). 따라서, 이진탕 이 소장 카할세포와 결합해서 다양한 세포내 작용을통하여 장이동능을 증가시킬수 있다고 생각되고, 이진탕에 의한 위장관 다른 부위인 위나 대장에서의 효능도 알아볼 필요가 있다고 생각된다.
이번 연구에서는 이진탕에 의한 소장 카할세포에서 향도잡이 전압에 미치는 효능과 작용 기전 및 위장관운동성에 미치는 효능을 알아보았다. 본 연구에서 보면 이진탕은 카할세포 향도잡이 전압의 탈분극을 일으키고 (Fig. 1) 이러한 탈분극은 세포밖 Ca²⁺ 및 세포내 Ca²⁺ 농도 조절 기관인 근소포체의 Ca²⁺-ATPase 작용에 의해 조절 되고 있음을 알 수 있었다 (Fig.2). 또 세포내 PLC 기전의 관련성을 알아보기 위해서 PLC 억제제인 U73122을 이용하여 보니 이진탕에 의한 카할세포 향도잡이 탈분극은 억제 됨을 알수 있었다 (Fig.
5). 이진탕 농도가 증가할 수록 ITR이 증가하는 현상을 보였다. 다른 한약재와 의 효능 비교를 위해 위장관 운동성 연구에 많이 사 용되는 PF (1 g/kg)를 투여해보니 평균 ITR은 54.

후속연구

물론 이진탕에 의한 장 이동능 증가가 카할세포작용이 아닌 위장관평활근이나 신경에서의 작용으로 반응이 나타날수도 있다고 생각된다. 따라서, 앞으로 이진탕에 의한 위장관 평활근이나 신경에서의 작용을 연구하여 각각이어떻게 상호작용을 통하여 위장관 운동성을 조절하는지도 필요한 연구라 생각된다.
따라서 현재 많은 사람들이 천연의학으로 위장관 관련질병을 치료하는 것에 관심이 많아지고 있다. 본 연구로 이진탕이 카할세포 조절을 통해서 위장관 운동성을 조절할 수 있는 가능성을 확인하였고 앞으로 좀더 많은 연구를 통하여 이진탕이 장운동 이상으로 고생하는 환자에게 좋은 치료약이 될 수 있을 것으로 사료된다.
³¹⁾ 본 연구에서는 여러 다양한 억제제들을 사용하여 이진탕의 반응에 관여하는 수용체 연구를 해 보았지만 아직 확실한 결론을 얻지는 못했다. 앞으로 좀 더 연구를 지속할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	이진탕은 무슨 치료를 위해 쓰이는가?	이진탕(二陳湯, Yijin-tang, 중국어로는 Erchen-tang, 일본어로는 Nichin-to)은 반하(半夏; Pinellia ternate), 진피(陳皮; Citrus unshiu), 적복령(赤茯苓; Poria cocos), 자감초(炙甘草; Glycyrrhiza uralensis), 생강(生薑; Zingiber officinale)으로 구성되어 있으며, 각종 질병의 예방과 치료를 위한 전통 처방으로서 구역질, 구토, 위염, 만성 위염 등 소화기 질환의 치료에 널리 사용되어 왔다1,2) . 이진탕은 에탄올에 의한 위 손상에 치료효과가 있으며3) , 항산화효능도 있는 것으로 알려지고 있다.
	서파 (slow wave)란?	오래전부터 위장관의 평활근에서 자율적으로 발생하는 규칙적 수축운동(rhythmic contraction)은 서파 (slow wave)라고 불리우면서 연동운동이나 분절운동과 같은 위장관의 운동의 기본이 된다8,9) . 따라서 위장관 운동은 평활근 자체의 특징에 의해 발생되는 것으로 알려져 왔으나, 카할세포(Interstitial Cells of Cajal, ICC)라는 특수한 세포가 연구되어 이 카할세포에 의해서 발생되는 향도잡이 전위(pacemaker potential)에 의한 것으로 알려지고 있다10,11) .
	카할세포를 활용한 다양한 한약제제에서의 연구의 예는?	카할세포를 이용한 다양한 한약제제에서의 연구는 많이 이루어지고 있다. 갈근탕은 소장 카할세포의 α2와 β1 adrenoceptor를 통해서 과분극을 일으키고, 29) 대건중탕은 주로 인삼 (Ginseng radix)과 건강 (Zingiberis rhizomes)에 의한 반응으로 소장 카할세포에서 5-HT4와 M3 수용체를 통해서 탈분극을 일으킨다. 30) 황련해독탕은 5-HT3와 5-HT4 수용체를 통해서 세포내외의 Ca2+조절로 탈분극을 일으킨다. 31) 본 연구에서는 여러 다양한 억제제들을 사용하여 이진탕의 반응에 관여하는 수용체 연구를 해 보았지만 아직 확실한 결론을 얻지는 못했다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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