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문제 정의
- 이에 저자는 痰飮의 치료효과를 기본적으로 포함하고 있는 二陳湯, 香砂二陳湯 및 內消散의 효능을 비교연구 하고자 실험용 생쥐에 indomethacin을 이용하여 위점막 손상을 유발시킨 후 각 처방의 농축전탕액을 각각 투여하여 위점막의 형태학적 변화, 위점막 손상 변화[zonula occludin-1(ZO-1), heat shock protein(HSP) 70], 위점막 방어장벽의 변화[periodic acid-schiff reaction stain(PAS), peanut agglutinin(PNA), cyclooxygenase-1(COX-1), 5-bromo-2‘-deoxyuridine(BrdU)], 위점막내 항염증효과[nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated Bcells(NF-κB) p65, inducible nitric oxide synthase(iNOS) and cyclooxygenase-2(COX-2)]와 in vitro에서의 항염증효과(iNOS mRNA, COX-2 mRNA)등을 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- A : The mucosal damages (arrow) in MA, EA, HA and NA group noticeably decreased (H&E, x 200) B : The destruction of mucose secreting cell (arrow) in MA, EA, HA and NA group noticeably decreased (semi-thin, x 1000) C : The ZO-1 positive reaction (arrow) in MA, EA, HA and NA group noticeably increased than gastropathy elicitated mice (ZO-1 immunohistochemstry, x 400). D : The HSP70 positive reaction (arrow) in MA, EA, HA and NA group noticeably decreased than gastropathy elicitated mice (HSP70 immunohistochemstry, x 400). ZO : zonula occludin-1, HSP70 : heat shock protein 70, AP : apical surface of mucosa, MN : mucosal neck, Others Abbreviation same as Fig.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine(Sigma, USA)과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- 얻어진 연속절편은 4 ℃와 37 ℃의 2N HCl용액에서 각각 20분씩 반응시켜 DNA-denaturation을 일으켰다. 0.1 M borate 완충용액 처리로 안정시킨 후 비특이적 면역반응을 억제하기 위해 0.01%의 proteinase K(DAKO)가 포함된 normal goat serum에 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 1차 항체인 mouse anti-mouse BrdU(1:20, Amersham, UK)에 4 ℃ incubation chamber내에서 72시간 반응시켰고 이후 과정은 위에 기술한 면역조직화학적 염색법과 동일하였다.
- Intestinal permeability는 폐쇄띠의 손실과 연관되는데, 폐쇄이음 단백질의 하나인 zonula occludin (ZO)-1 분포 변화 관찰을 위한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 proteinase K(20 μg/ml, DAKO, DEN)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum(Vector Lab, USA)에 2시간 동안 반응시켰다.
- RT-PCR kit(Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 iNOS primer와 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 5). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- 배양 후 수거한 RNA를 trizol reagent(Sigma)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer (Introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit(Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 iNOS primer와 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 5). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다.
- mRNA 발현의 relative intensity, 출혈성 찰과의 분포, 조직화학 그리고 면역조직화학 결과의 수치화를 위해 Optimas 5.2를 이용한 영상분석을 실시하였다. 본 실험의 결과 통계처리는 SPSS 8.
- Uranyl acetate에 90분 동안 염색한 후 통상적인 방법으로 epon에 포맷하였다. ultramicrotome(LKB, Nova)으로 990 nm 두께로 절편을 만들어 toluidine blue로 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 二陳湯, 香砂二陳湯 그리고 內消散 각 2첩을 증류수 500 ml에 넣고 2시간 동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여과액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압농축하여 동물실험에 사용하였다.
- 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포맷한 후 5 μm 두께의 연속 절편을 제작하였다.
- 위산에 의한 자가분해(autolysis) 방벽작용을 하는 중성점액질(neutral mucin)을 분비하는 점액분비세포의 변화를 조사하기 위해서 periodic acid-schiff reaction(PAS) stain을 실시하였는데, 우선 periodic acid에서 5분간 반응시킨 후 Schiff reagent에서 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 sulfurous rinse에서 각 2분씩 3회 세척한 후 Hematoxylin에서 1분 동안 대조염색하여 관찰하였다.
- 또한 생성된 NO는 superoxide anion의 반응으로 peroxynitrite 나 hydroxyl radical이 형성되고, 이는 세포막지질을 peroxidation 시키며, thiol, SH기를 oxidation하여 세포독성을 유발한다27. 본 실험에서는 iNOS의 변화를 iNOS 항체를 이용한 면역조직화학적 방법으로 조사 하였는데 점막상피 손상지역에서 iNOS의 증가를 확인할 수 있었다. COX-2는 유도성 동종효소(inducible isoform)로 성장인자와 mitogen에 유도되어 prostagladin 분비 지속을 통한 다양한 만성염증질환, 즉 류마티스성 관절염, Crohn's disease, 궤양성 대장염, Helicobacter pylori 유도 위염 등을 유발하며, 혈관이완과 혈관신생성에도 관여한다28.
- 대한실험동물센터에서 분양 받은 태령 4주된 ICR계 수컷 생쥐를 무균 사육장치 내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 30 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 실험동물은 정상군(이하 NOR군), idomethacin 처리로 위점막 손상 유발군(이하 CON군), 위점막 손상유발 후 Misoprostol 투여군(이하 MA군), 위점막 손상유발 후 二陳湯 투여군(이하 EA군), 위점막 손상유발 후 香砂二陳湯 투여군(이하 HA군) 그리고 위점막 손상유발 후 內消散 투여군(이하 NA군)으로 나누었으며, 각 군당 10마리를 배정하였다.
- 실험용 생쥐를 정상군(NOR군), Indomethacin을 경구 투여하여 인위적으로 위점막 손상을 유발한 군(CON군), 위점막 손상 유발 후 Misoprostol 투여군(MA군), 위점막 손상 유발 후 二陳湯 투여군(EA군), 위점막 손상 유발 후 香砂二陳湯 투여군(HA군), 위점막 손상 유발 후 內消散 투여군(NA군)의 6군으로 나누어 각각 10마리씩 배정하였고, 위점막의 형태학적 변화, 위점막 손상 변화(ZO-1, HSP70), 위점막 방어장벽의 변화(PSA, PNA, COX-1, BrdU), 위점막내 항염증효과(NF-κB p65, iNOS, COX-2)와 In Vitro 에서의 항염증효과(iNOS mRNA, COX-2 mRNA) 등을 관찰하였다.
- 염증유발유전자의 전사인자 nuclear factor(NF)-κB, 염증효소 iNOS와 COX-2의 변화를 조사하기 위해 mouse anti-NF-κB p65(1:500, Santa Cruz Biotec), mouse anti-iNOS(1:100, Santa Cruz Biotec), rabbit anti-mouse COX-2(1:250, Chyman)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin(Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다.
- 우선 실험동물에서 위 적출하기 5시간 전, 3시간 전, 1시간 전에 생리식염수에 녹인 5-bromo-2‘- deoxyuridine(BrdU, Sigma) 50 mg/kg을 복강주사 하였다.
- 위점막 손상 유발 후 5일 경과되었을 때 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin, NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 위 몸통과 날문의 연결부위를 적출하여 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포맷한 후 5 μm 두께의 연속 절편을 제작하였다.
- 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포맷한 후 5 μm 두께의 연속 절편을 제작하였다. 위 점막의 일반적인 형태변화를 관찰하기 위해 연속절편을 hematoxylin과 eosin에 염색한 후 광학현미경(BX50. Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 한편 Semi-thin 절편 제작은 절취된 위장 절편을 1/2 Karnovsky 용액에 선고정한 후 1% OsO4 용액에 후고정하였다.
- 위산에 의한 자가분해(autolysis) 방벽작용을 하는 중성점액질(neutral mucin)을 분비하는 점액분비세포의 변화를 조사하기 위해서 periodic acid-schiff reaction(PAS) stain을 실시하였는데, 우선 periodic acid에서 5분간 반응시킨 후 Schiff reagent에서 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 sulfurous rinse에서 각 2분씩 3회 세척한 후 Hematoxylin에서 1분 동안 대조염색하여 관찰하였다.
- 위점막 손상 유발 후 5일 경과되었을 때 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 후 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin, NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 위 몸통과 날문의 연결부위를 적출하여 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였다.
- 위점막 손상 유발 후 일어난 출혈성 미란의 유발 정도를 측정하기 위해 Optimas 5.2(Optima, USA) 를 이용한 영상분석을 실시하였다. 적출된 위의 날문과 몸통부위를 젖힌 후 x4 배율로 촬영한 후 Binary Morphology에서 invert 기능을 선택하여, 출혈성 찰과 지역을 intensity 180-200으로 전환시킨 다음, 영상분석을 통해 pixel의 분포 수를 측정하였다.
- 위점막 손상에 대한 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散 의 치료효과를 비교연구하기 위하여 실험용 생쥐에 indometacin을 이용하여 위점막 손상을 유발시킨 후, 각 처방의 농축전탕액을 각각 투여하여 위점막의 형태학적 변화, 위점막 손상 변화(ZO-1, HSP70), 위점막 방어장벽의 변화(PSA, PNA, COX-1, BrdU), 위점막내 항염증효과(NF-κB p65, iNOS, COX-2) 와 In Vitro에서의 항염증효과(iNOS mRNA, COX-2 mRNA) 등을 관찰하였다.
- 위점막 손상유발 후 MA군에 Misoprostol(Cytotec, Searle Korea)을 생리식염수에 희석시킨 다음 40 μg/kg씩 5일 동안 경구투여 하였다.
- 위점막 손상을 유발하기 위해서 indomethacin(Sigma, USA)을 0.9% NaCl이 포함된 용액에 희석 시킨 후 10 mg/kg을 CON군, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에 5일 동안 경구투여 하였다.
- 2(Optima, USA) 를 이용한 영상분석을 실시하였다. 적출된 위의 날문과 몸통부위를 젖힌 후 x4 배율로 촬영한 후 Binary Morphology에서 invert 기능을 선택하여, 출혈성 찰과 지역을 intensity 180-200으로 전환시킨 다음, 영상분석을 통해 pixel의 분포 수를 측정하였다.
- 점막 손상 스트레스를 조사하기 위해 스트레스에 대한 완충적 물질인 열 충격 단백질(heat shock protein, HSP)의 하나인 HSP70의 분포 변화를 rabbit anti mouse HSP70(1:100, Santa Cruz Biotec)을 이용한 면역조직화학적 염색 후 관찰하였다.
- 점막상피세포의 보호기전에 관여하는 cyclooxygenase(COX)-1의 점막고유층내에서 분포 변화를 mouse anti-mouse COX-1(1:250, Chyman, USA)을 이용한 면역조직화학적 염색 후 관찰하였다.
- 점막상피의 손상세포 교체를 통한 점막회복에 관여하는 점막상피세포의 세포증식 변화를 조사하기 위해 BrdU를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 실험동물에서 위 적출하기 5시간 전, 3시간 전, 1시간 전에 생리식염수에 녹인 5-bromo-2‘- deoxyuridine(BrdU, Sigma) 50 mg/kg을 복강주사 하였다.
- 점액분비세포내 골지체에 대한 양성반응을 보이는 peanut agglutinin(PNA)의 분포 변화를 조사하기 위해 lectin을 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 조직을 실온에서 1% bovine serum albumin(BSA, Sigma)에 1시간 동안 blocking한 다음 1:100으로 희석한 biotinylated anti PNA(Sigma, USA)에 4 ℃ incubation chamber내에서 24시간 동안 반응시켰다.
- 0 mg/ml를 첨가량으로 결정하였다. 한편 EA군에는 二陳湯 추출액을, HA군에는 香砂二陳湯 추출액을, NA군에는 內消散 추출액을 각각 성인 60 kg기준 용량의 3배인 2.5 ml/kg 량으로 1일 1회, 5일 동안 경구투여 하였다.
- 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- 그 여과액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압농축하여 동물실험에 사용하였다. 한편 in vitro 실험에 사용된 추출물은 감압농축 후 동결 건조(二陳湯, 수득률 7.4%; 香砂二陳湯, 수득률 9%; 內消散, 수득률 10%)하여 사용하였고, MTT assay 결과 한약재 추출물 10 mg/ml까지는 세포생존률의 변화가 일어나지 않아 1.0과 2.0 mg/ml를 첨가량으로 결정하였다. 한편 EA군에는 二陳湯 추출액을, HA군에는 香砂二陳湯 추출액을, NA군에는 內消散 추출액을 각각 성인 60 kg기준 용량의 3배인 2.
대상 데이터
- 대한실험동물센터에서 분양 받은 태령 4주된 ICR계 수컷 생쥐를 무균 사육장치 내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 30 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 실험동물은 정상군(이하 NOR군), idomethacin 처리로 위점막 손상 유발군(이하 CON군), 위점막 손상유발 후 Misoprostol 투여군(이하 MA군), 위점막 손상유발 후 二陳湯 투여군(이하 EA군), 위점막 손상유발 후 香砂二陳湯 투여군(이하 HA군) 그리고 위점막 손상유발 후 內消散 투여군(이하 NA군)으로 나누었으며, 각 군당 10마리를 배정하였다.
- 본 실험에 사용한 한약재는 ≪方藥合編≫14에 수록된 二陳湯, 內消散과 ≪御纂醫宗金鑑≫11에 수록된 香砂二陳湯의 처방에 따른 구성약물로서, 시중에서 엄선된 약재만을 구입하여 실험에 사용하였으며 처방의 내용과 1첩의 분량은 다음과 같다(Table 1, 2, 3)
- 본 실험에서는 indomethacin에 의해 점막 보호장벽의 손상과 그에 따른 출혈성 찰과의 증가, 점액분비세포의 감소 등의 위점막 손상이 관찰되었다. 위점막 표면의 변화에 있어서 CON군에서는 몸통과 날문유문연접 부위에서 심각한 출혈성 찰과가 관찰되었는데, 이에 비해 MA군, EA군, HA 군 그리고 NA군에서 모두 출혈성 찰과가 감소되었다.
- 실험에 사용한 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 macrophages는 Korean Cell Line Bank(KCLB, Korea)에서 구입하였다. 세포는 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 10% fetal bovine serum(FBS, Sigma, USA)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Weljin, Korea)를 사용하여 배양하였다.
- 이에 저자는 二陳湯, 香砂二陳湯 및 內消散의 위점막 손상에 대한 치료효과를 비교연구하기 위하여 생쥐의 위점막 손상약물로 위점막 손상 유발시 안정적이고 편차를 줄일 수 있는 장점이 있어 최근 많이 활용되고 있는 indomethacin18을 사용하였고, 비교약물로는 prostaglandin 합성제제로 공격인자와 방어인자에 모두 관여하여 위점막 손상을 보호함으로써 소화성 궤양의 치료나 예방에 효과가 있어 최근에 aspirin과 같은 비스테로이드성 소염제 투여시 소화성 궤양의 예방목적으로 함께 활용하고 있는 Misoprostol19을 실험재료로 사용하였다. 실험용 생쥐를 정상군(NOR군), Indomethacin을 경구 투여하여 인위적으로 위점막 손상을 유발한 군(CON군), 위점막 손상 유발 후 Misoprostol 투여군(MA군), 위점막 손상 유발 후 二陳湯 투여군(EA군), 위점막 손상 유발 후 香砂二陳湯 투여군(HA군), 위점막 손상 유발 후 內消散 투여군(NA군)의 6군으로 나누어 각각 10마리씩 배정하였고, 위점막의 형태학적 변화, 위점막 손상 변화(ZO-1, HSP70), 위점막 방어장벽의 변화(PSA, PNA, COX-1, BrdU), 위점막내 항염증효과(NF-κB p65, iNOS, COX-2)와 In Vitro 에서의 항염증효과(iNOS mRNA, COX-2 mRNA) 등을 관찰하였다.
데이터처리
- 본 실험의 결과 통계처리는 SPSS 8.0을 통한 ANOVA test를 실시하였고 Duncan test로 사후 분석을 시행하였으며 p<0.05 일 경우에 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散이 염증효소인 induce nitric oxide synthase(iNOS) mRNA과 cyclooxygenase (COX)-2의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법(Reverse TranscriptasePolymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
- 1. 위점막 손상에 대한 효과는, 약물 투여군 모두에서 대조군에 비하여 출혈성 찰과, 점액분비세포의 배열유실, ZO-1 양성반응, HSP70 양성반응 등의 위점막 손상 소견이 감소된 것으로 나타났 으며, 內消散 투여군, 香砂二陳湯 투여군, 二陳湯투여군 순으로 위점막 손상에 대한 효과가 더 우수한 것으로 관찰되었다.
- 2. 위점막 방어장벽의 보호 효과는, 약물 투여군 모두에서 대조군에 비하여 중성점액세포, COX-1, BrdU 양성반응 등의 위점막 방어장벽의 보호 소견이 증가된 것으로 나타났으며, 內消散 투여군, 香砂二陳湯 투여군, 二陳湯 투여군 순으로 위점막 방어장벽의 보호효과가 더 우수한 것으로 관찰되었다.
- 3. 위점막내 항염증효과는, 약물 투여군 모두에서 대조군에 비하여 NF-κB p65, iNOS, COX-2 양성반응세포의 감소를 보였는데, 內消散 투여군, 香砂二陳湯 투여군, 二陳湯 투여군 순으로 항염증효과가 더 우수한 것으로 관찰되었다.
- CON군에 비해 MA, EA, HA 및 NA군에서 모두 유의성 있는 감소를 보였는데 MA군은 CON군에 비해 64% 감소한 8,766±37/100,000 pixel로, EA 군은 MA군에 비해 46% 감소한 4,735±32/100,000 pixel로, HA군은 EA군에 비해 50% 감소한 2,355±38/100,000 pixel로 그리고 NA군은 HA군에 비해 43% 감소한 1,347±42/100,000 pixel로 측정되었다(Fig. 1).
- 본 실험에서도 출혈성 찰과 유발 점막내에서 HSP70 양성반응이 증가하였다. CON군에서는 HSP70 양성반응이 NOR군에 비해 크게 증가하였는데, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 양성반응이 감소된 것으로 보아 점막손상의 정도가 유의성 있게 감소되었는데 HA군과 NA군이 EA군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
- 폐쇄띠의 손상에 따른 intestinal permeability의 증가는 장내 염증반응을 유도하여 궤양을 일으킨다20. CON군에서는 ZO-1 양성반응이 NOR군에 비해 크게 감소했으며, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 모두 양성반응이 증가된 것으로 관찰되어 위점막 손상이 적었음을 알 수있었다.
- CON군의 출혈성 침식 주변의 점막 상피에서는 PAS 양성반응을 보이는 표면점액세포와 목점액세포가 NOR군에 비해 75% 감소하였는데, 이에 반해 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 PAS 양성반응이 모두 유의성 있게 증가된 양상으로 관찰되었다. MA군은 CON군에 비해 28%, EA군은 MA군에 비해 48%, HA군은 EA군에 비해 18%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 50% 증가하였다.
- 이런 COX-2 양성반응세포는 점막 상층의 점막고유층에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. COX-2 양성반응의 영상분석 결과 CON군은 NOR군에 비해 1613% 증가하였지만, MA군은 CON군에 비해 43%, EA군은 MA군에 비해 23%, HA군은 EA군에 비해 63%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 48% 감소하였다(Fig. 5-C, Table 8). HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 감소경향을 보였다.
- 본 실험에서는 NOR군에서 점막고유층내 COX-1 양성반응이 세포질에서 강하게 나타났으나 CON군에서는 NOR군에 비해 크게 감소한 것으로 관찰되었으며, 이것은 COX-1의 결핍이 점막손상의 일차적 원인으로 설명될 수 있었다24. MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서 CON군에 비해 양성반응이 증가된 것으로 나타나 위장관 보호효과가 있음이 인정되었는데 HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있게 효과적이었다.
- CON군의 출혈성 침식 주변의 점막 상피에서는 PAS 양성반응을 보이는 표면점액세포와 목점액세포가 NOR군에 비해 75% 감소하였는데, 이에 반해 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 PAS 양성반응이 모두 유의성 있게 증가된 양상으로 관찰되었다. MA군은 CON군에 비해 28%, EA군은 MA군에 비해 48%, HA군은 EA군에 비해 18%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 50% 증가하였다. NA군에서는 중성점액을 분비하는 PAS 양성반응 표면점액세포의 분포가 점막 상층 표면(apical surface)에서 위오목(gastric pit)까지 확장된 것으로 관찰되었다(Fig.
- NF-κB p65 양성반응의 영상분석 결과 CON군은 NOR군에 비해 648% 증가하였지만, MA군은 CON군에 비해 12%, EA군은 MA군에 비해 10%, HA군은 EA군에 비해 49%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 31% 감소하였다(Fig. 5-A, Table 8)
- NOR군에서 관찰된 세포분열중인 세포의 BrdU 양성반응은 핵과 핵막주변 세포질에서 강한 양성을 보였으며, 주된 분포지역의 위 오목(gastric pit)의 점액목(mucosal neck) 주변이었다. 위 점막 손상 유발 후 BrdU 양성반응세포의 분포가 감소하였는데, NOR군에 비해 CON군에서 96% 감소하였다.
- NOR군의 점막고유층내 COX-1 양성반응은 세포질에서 강하게 나타났으며, 양성반응세포는 주로 점막 상단부에서 다수 관찰되었다. 이러한 COX-양성반응은 CON군에서 92% 감소하였다.
- RAW 264.7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현은 증가하였는데, 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 二陳湯 추출물 처리 후 COX-2 mRNA 발현량은 1.
- 이런 iNOS 양성반응세포는 점막 상층의 점막고유층에 분포하였고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. iNOS 양성반응의 영상분석 결과 CON군은 NOR군에 비해 99% 증가하였지만, MA군은 CON군에 비해 33%, EA군은 MA군에 비해 12%, HA군은 EA군에 비해 49%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 40% 감소하였다(Fig. 5-B, Table 8). HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 감소경향을 보였다.
- 7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 COX-2 mRNA 발현은 증가하였는데, 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 二陳湯 추출물 처리 후 COX-2 mRNA 발현량은 1.0 mg/ml에서 7%, 2.0 mg/ml에서 14%, 香砂二陳湯 추출물 처리 후 1.0 mg/ml에서 9 , 2.0 mg/ml에서 12%, 內消散 추출물 처리 후 1.0 mg/ml에서 1%, 2.0 mg/ml에서 50% 감소하였다(Fig. 4).
- 7 macrophages에서 LPS 자극에 의한 iNOS mRNA 발현은 증가하였는데, 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 二陳湯 추출물 처리 후 iNOS mRNA 발현량은 1.0 mg/ml에서 7%, 2.0 mg/ml에서 13%, 香砂二陳湯 추출물 처리 후 1.0 mg/ml에서 2%, 2.0 mg/ml에서 19%, 內消散 추출물 처리 후 1.0 mg/ml에서 1%, 2.0 mg/ml에서 25% 감소하였다 (Fig. 4).
- HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 감소경향을 보였다. 또한 CON군의 위점막에서는 심각한 출혈성 찰과로 인한 점액 분비세포의 배열유실이 관찰되었는데, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 모두 점막 손상이 적었으며 특히 NA군은 NOR군과 유사한 점액분비세포의 배열을 유지하였다.
- 또한 in vitro 실험을 통해서 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散 추출물이 iNOS mRNA와 COX-2 mRNA 의 발현 억제도 확인할 수 있었으며 특히 內消散추출물에서 높은 항염증효과를 나타내었다.
- 또한, 약물의 항염증효과 측정에서는 二陳湯 추출물, 香砂二陳湯 추출물, 內消散 추출물에서 모두에서 효과가 있는 것으로 나타났으며, 그 중 內消散이 가장 우수한 것으로 관찰되었다.
- 본 실험에서는 NF-κB, iNOS, COX-2의 변화를 조사하였는데, CON군에서는 NOR군에 비해 양성반응세포의 분포가 증가하였으며, MA군, EA군, HA 군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 모두 감소된 것으로 나타나 모두 위점막 내 항염증효과가 있음을 알 수 있었는데 HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있게 효과적이었다.
- 본 실험에서는 NF-κB의 변화를 NF-κB p65 항체를 이용한 면역 조직화학적 방법으로 조사하였는데, 점막상피 손상 지역에서 NF-κB p65의 증가를 확인할 수 있었다.
- 이와 같이 HSP70은 세포상해에 저항이 있는 지역에서 주로 발견되어, HSP70의 방어기전으로써의 역할을 하는 것으로 사료된다. 본 실험에서도 출혈성 찰과 유발 점막내에서 HSP70 양성반응이 증가하였다. CON군에서는 HSP70 양성반응이 NOR군에 비해 크게 증가하였는데, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 양성반응이 감소된 것으로 보아 점막손상의 정도가 유의성 있게 감소되었는데 HA군과 NA군이 EA군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
- 염증효소 COX-2 양성반응세포의 분포는 CON군에서는 증가하는 반면 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서 모두 유의성 있게 감소하였다. 이런 COX-2 양성반응세포는 점막 상층의 점막고유층에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- 염증효소 iNOS 양성반응세포의 분포는 CON군에서는 증가하는 반면 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서 모두 유의성 있게 감소하였다. 이런 iNOS 양성반응세포는 점막 상층의 점막고유층에 분포하였고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- 염증효소생성에 관여하는 전사인자 NF-κB p65의 양성반응세포의 분포는 CON군에서는 증가하는 반면 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서 모두 유의성 있게 감소하였다.
- NOR군에서 관찰된 세포분열중인 세포의 BrdU 양성반응은 핵과 핵막주변 세포질에서 강한 양성을 보였으며, 주된 분포지역의 위 오목(gastric pit)의 점액목(mucosal neck) 주변이었다. 위 점막 손상 유발 후 BrdU 양성반응세포의 분포가 감소하였는데, NOR군에 비해 CON군에서 96% 감소하였다. 이에 반해 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON 군에 비해 BrdU 양성반응이 모두 유의성 있게 증가된 양상으로 관찰되었는데, MA군은 CON군에 비해 1070%, EA군은 MA군에 비해 16%, HA군은 EA군에 비해 36%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 17% 증가하였다(Fig.
- 위점막 손상 유발 후 스트레스에 대한 완충적 물질인 HSP70 분포는 점막고유층에 증가하였으며 핵과 주변세포질에서 강한 양성반응을 보이는 것으로 관찰되었다. 이러한 분포 증가는 NOR군에 비해 CON군에서 488% 증가하였다.
- 본 실험에서는 indomethacin에 의해 점막 보호장벽의 손상과 그에 따른 출혈성 찰과의 증가, 점액분비세포의 감소 등의 위점막 손상이 관찰되었다. 위점막 표면의 변화에 있어서 CON군에서는 몸통과 날문유문연접 부위에서 심각한 출혈성 찰과가 관찰되었는데, 이에 비해 MA군, EA군, HA 군 그리고 NA군에서 모두 출혈성 찰과가 감소되었다. HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 감소경향을 보였다.
- 이상의 결과로 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散은 위점막 손상에 대한 방어효과와 위점막내 항염증효과가 있는 것으로 나타났으며, 二陳湯보다는 香砂二陳湯이, 香砂二陳湯보다는 內消散이 치료효과가더 있는 것으로 나타났다. 이로 미루어 보아 임상적으로 祛痰, 行氣, 消導, 消積하여 飮食傷에 활용될 수 있는 대부분의 治法이 포함된 內消散이 소화기 염증 및 궤양에 치료 효과가 뛰어 날 것으로 사료 되며, 향후 본 실험을 토대로 다양한 治法에 해당 되는 처방들 간의 비교연구가 지속적으로 이루어지길 기대하는 바이다.
- 이상의 결과에서 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散 모두 위점막 손상에 대해 치료효과가 있는 것으로 나타났으며, 二陳湯보다는 香砂二陳湯이, 香砂二陳湯보다는 內消散이 효과가 좋은 것으로 나타났다.
- 위 점막 손상 유발 후 BrdU 양성반응세포의 분포가 감소하였는데, NOR군에 비해 CON군에서 96% 감소하였다. 이에 반해 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON 군에 비해 BrdU 양성반응이 모두 유의성 있게 증가된 양상으로 관찰되었는데, MA군은 CON군에 비해 1070%, EA군은 MA군에 비해 16%, HA군은 EA군에 비해 36%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 17% 증가하였다(Fig. 3-D, Table 7). HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 증가경향을 보였다.
- 이러한 COX-양성반응은 CON군에서 92% 감소하였다. 이에 반해 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 COX-1 양성반응이 모두 유의성 있게 증가된 양상으로 관찰되었는데, MA군은 CON군에 비해 111%, EA군은 MA군에 비해 4%, HA군은 EA군에 비해 296%, 그리고 NA군에서는 HA군에 비해 13% 증가하였다(Fig. 3-C, Table 7). HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 증가경향을 보였다.
- 이러한 분포 증가는 NOR군에 비해 CON군에서 488% 증가하였다. 이에 반해 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군은 CON군에 비해 HSP70양성반응이 모두 유의성 있게 감소된 것으로 관찰되었는데, MA군은 CON군에 비해 20%, EA군은 MA군에 비해 41%, HA군은 EA군에 비해 9 , NA군은 HA군에 비해 1% 감소하였다(Fig. 2-D, Table 6). HA군과 NA군은 EA군에 비해 유의성 있는 감소경향을 보였다.
- NOR군에서 ZO-1 양성반응은 점액분비세포 이음복합체의 상층부인 폐쇄띠 부위 세포막에서 잘 관찰되었다. 점액분비세포 이음복합체가 심하게 손상 받은 CON군에서는 ZO-1 양성반성이 NOR군에 비해 84% 감소하였다. 한편 점액분비세포 이음복합체가 회복된 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군 모두에서 CON군에 비해 ZO-1 양성반응이 증가하였는데, MA군은 CON군에 비해 13%, EA군은 MA군에 비해 6%, HA군은 EA군에 비해 56%, NA군은 HA군에 비해 56% 증가하였다(Fig.
- 중성점액장벽에 대한 효과는 CON군의 출혈성 침식 주변의 점막상피에서 PAS 양성반응을 보이는 표면점액세포와 목점액세포가 NOR군에 비해 감소하였는데, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 양성반응이 증가된 것으로 나타나 중성점액질(neutral mucin)을 분비하는 점액분비세포가 증가함으로써 위산에 대한 방벽효과가 인정되었으며 HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있게 효과적이었다.
- 표면점액세포내 골지복합체와 세포첨단부(apical surface)에서 강한 양성을 보이는 PNA 분포는 CON 군에서 NOR군에 비해 크게 감소하였는데, MA군, EA군, HA군 그리고 NA군에서는 CON군에 비해 양성반응이 증가된 것으로 나타나 위점막 방어효과가 인정되었으며 HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있게 효과적이었다.
- 한편 CON군의 점막손상부위에서 연접복합체 소실과 세포소기관의 손상과 공포화된 점액분비세포가 다수 관찰되었다. MA군, EA군, HA군 그리고 NA군은 CON군에 비해 손상 점액분비세포의 분포가 적었다.
- 점액분비세포 이음복합체가 심하게 손상 받은 CON군에서는 ZO-1 양성반성이 NOR군에 비해 84% 감소하였다. 한편 점액분비세포 이음복합체가 회복된 MA군, EA군, HA군 그리고 NA군 모두에서 CON군에 비해 ZO-1 양성반응이 증가하였는데, MA군은 CON군에 비해 13%, EA군은 MA군에 비해 6%, HA군은 EA군에 비해 56%, NA군은 HA군에 비해 56% 증가하였다(Fig. 2-C, Table 6). HA군은 EA군에 비해, NA군은 HA군에 비해 유의성 있는 증가경향을 보였다.
후속연구
- 이상의 결과로 二陳湯, 香砂二陳湯, 內消散은 위점막 손상에 대한 방어효과와 위점막내 항염증효과가 있는 것으로 나타났으며, 二陳湯보다는 香砂二陳湯이, 香砂二陳湯보다는 內消散이 치료효과가더 있는 것으로 나타났다. 이로 미루어 보아 임상적으로 祛痰, 行氣, 消導, 消積하여 飮食傷에 활용될 수 있는 대부분의 治法이 포함된 內消散이 소화기 염증 및 궤양에 치료 효과가 뛰어 날 것으로 사료 되며, 향후 본 실험을 토대로 다양한 治法에 해당 되는 처방들 간의 비교연구가 지속적으로 이루어지길 기대하는 바이다.
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