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문제 정의
- 본 연구팀은 제주도 연근해에서 채취 가능한 해조류의 80% 에탄올 추출물에 대하여 HaCaT 각질형성세포에서 염증성 chemokine인 MDC 생성 억제효과를 지속적으로 검색하고 있다. 그 결과, 단박 추출물의 효과가 우수하여 그 활성기전을 밝히고자 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 단박 추출물의 염증억제효과 및 그 활성기전을 밝히고자 각질형성세포인 HaCaT 세포에서 염증성 chemokine 생성억제 활성을 평가하였다.
- 본 연구팀은 제주도 연근해에서 채취 가능한 해조류의 80% 에탄올 추출물에 대하여 HaCaT 각질형성세포에서 염증성 chemokine인 MDC 생성 억제효과를 지속적으로 검색하고 있다. 그 결과, 단박 추출물의 효과가 우수하여 그 활성기전을 밝히고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 19,20) 염증성 chemokine인 MDC에 대한 단박 추출물의 억제효능을 확인하기 위하여 HaCaT 각질형성세포에 단박 추출물(3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/mL)과 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)을 처리하여 24시간 동안 배양하고, 배지에서 MDC의 농도를 ELISA로 측정하였다.
- 23,24) 이러한 STAT, NF-κB의 활성화가 MDC 등의 염증성 인자 생성에 대한 주 기전으로 알려져 있다.25) 단박 추출물에 의한 농도의존적인 MDC 생성 억제가 STAT1 신호전달기전과 관련이 있는 지 확인하기 위하여 STAT1 인산화를 western blot으로 확인하였다. HaCaT 각질형성세포에 IFN-γ와 TNF-α(10 ng/mL)를 처리했을 때, 인산화된 STAT1이 의존적으로 증가하였으며, IFN-γ와 TNF-α를 처리한지 15분에 인산화가 가장 증가한 것을 확인하였다(Fig.
- Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) − HaCaT 각질형성세포(2.0×105 cells/mL)를 96 well plate에 접종하고, 세포를 18시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 전배양하였다.
- 그 다음 세포를 세정하였고, 핵 염색과 유리 커버글라스에 mounting을 위하여 VECTASHIELD Mounting Media with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 처리하였고, 매니큐어를 사용하여 커버글라스를 sealing하였다. FV500 Confocal microscopy (OLYNPUSM Tokyo, Japan)로 형광 반응을 관찰하였다.
- HaCaT 각질형성세포에 단박 추출물을 6.25, 12.5, 25 µg/mL을 처리하여 2시간 동안 배양하고, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)를 15분 동안 처리한 후 단백질을 분리하여 STAT1의 인산화 정도를 확인하였다.
- Then cells were stimulated with IFN-γ (10 ng/mL) and TNF-α (10 ng/mL) in the presence of Ceramium boydenii for 30min. Immunofluorescence stain of STAT1 was stained with FITC-rabbit anti-mouse IgG-conjugated 2nd antibody and the fluorescence was identified using confocal microscopy (FV500, OLYMPUS) and the images were acquired at constant PMT, gain, offset, magnification (40x oil immersion objective with zoom factor of 2.5) and resolution.
- Western Blot Analysis − HaCaT 각질형성세포를 60 mm culture plate에 5×105 cells/mL로 접종하여 10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic이 있는 DMEM 배지를 이용하여 18시간 동안 전배양하였다.
- 그 다음 기존의 배지를 제거하고, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)와 serial dilution 한 3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/mL 농도의 단박 추출물을 no serum DMEM 배지에 세포에 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 1% Tween 20) 용액에 희석하여 처리한 다음 상온에서 30분 반응시킨 후 4℃, overnight (O/N) 하였다. 그 다음 상온에서 20분 반응시켰고 TTBS로 10분씩 3회 세정한 후, 2차 항체로는 horseradish peroxide (HRP)가 결합된 항-래빗 (anti-rabbit IgG)과 항-마우스(anti-mouse IgG) 항체를 1:5000으로 희석하여 처리한 후 실온에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 면역반응이 완료된 membrane은 TTBS로 5회 세정 후, WEST-ZOL plus western blot detection system (iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하여 발광시킨 다음 X-ray 필름에 감광시켜 확인하였다.
- 다음으로는 세포를 세정한 후에, DyLight488 conjugated donkey anti-rabbit secondary antibody를 1:300으로 희석하여 처리하여 30분 동안 어두운 곳에서 반응시켰다. 그 다음 세포를 세정하였고, 핵 염색과 유리 커버글라스에 mounting을 위하여 VECTASHIELD Mounting Media with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 처리하였고, 매니큐어를 사용하여 커버글라스를 sealing하였다. FV500 Confocal microscopy (OLYNPUSM Tokyo, Japan)로 형광 반응을 관찰하였다.
- 그 후 각 조건에 맞게 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)를 처리하여 15분 동안 자극하였다.
- 그 후 배지를 제거하고 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)와 단박 추출물(3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/mL)을 no serum DMEM 배지에 희석하여 동시 처리하였고, 24시간 동안 배양하였다.
- 그 후, 단박 추출물을 6.25, 12.5 µg/mL의 농도로 2시간 전처리 한 다음 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)로 세포를 30분 동안 자극하였다.
- 레이저초점 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy) 검사 − HaCaT 각질형성세포(1.0×105 cells/mL)를 6-well plate에 유리 커버글라스를 넣고 접종하여 18시간 동안 전배양하였다.
- 그 다음 상온에서 20분 반응시켰고 TTBS로 10분씩 3회 세정한 후, 2차 항체로는 horseradish peroxide (HRP)가 결합된 항-래빗 (anti-rabbit IgG)과 항-마우스(anti-mouse IgG) 항체를 1:5000으로 희석하여 처리한 후 실온에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 면역반응이 완료된 membrane은 TTBS로 5회 세정 후, WEST-ZOL plus western blot detection system (iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하여 발광시킨 다음 X-ray 필름에 감광시켜 확인하였다.
- 배양 후 배지를 제거하고 plate에 각각 단박 추출물 3.13, 6.25, 12.5 µg/mL의 농도로 처리된 배지를 처리하여 2시간 동안 전처리 하였다.
- 5, 25 µg/mL)을 no serum DMEM 배지에 희석하여 동시 처리하였고, 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양액 내 MDC 생성은 각 well의 상층액을 이용하여 human MDC/CCL22 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 표준곡선(standard curve)은 human MDC를 이용하여 1,000 pg/mL에서부터 1/2씩 순차적으로 희석하였다(serial dilution).
- 세포생존율 평가 − 단박 추출물에 의한 세포 독성 정도를 평가하기 위하여 HaCaT 각질형성세포(1.5×105 cells/mL)를 96 well plate에 동일하게 분주한 후 세포를 37℃, 5% CO2 항온기에서 18시간 동안 배양하였다.
- 세포에 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL) 와 함께 단박 추출물을 각각의 농도 별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay로 세포 생존능을 측정하였다.
- 3). 이러한 STAT1 인산화 감소가 STAT1 단백질의 핵 내 전이 감소로 결과하는지 확인하기 위하여 공초점 현미경을 이용한 간접 면역 형광법으로 영상을 분석하였다(Fig. 4). 외부 자극이 없는 경우, STAT1 단백질이 세포질에 발현되었고, IFN-γ와 TNF-α(10 ng/mL) 처리 후 핵 내부에 STAT1 단백질 형광이 나타나는 것을 확인하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)를 구입하여 사용하였다. Anti-STAT1 항체는 Becton Dickison (Sandiego, CA, USA)에서 구입하였고, Anti-phospho-STAT1 항체는 Cell signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 그리고 β-actin은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
- 또한, MDC 생성은 Human MDC ELISA duoset kit(R&D system, St. Louis, MO, USA)를 구입하여 사용하였다.
- 세포배양 – 사람 각질형성세포주인 HaCaT 세포는 제주대학교 의학전문대학원 조문제 교수로부터 분양 받았고, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco BRL)과 1%의 Antibiotic-Antimycotic (GIBCO, Grand Island, NY)를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, USA)을 세포배양액으로 사용하여 37℃, 5% CO2로 유지되는 배양기에서 배양하였다.
- 시약 및 기기 − Human interferon-γ (hIFN-γ, recombinant E. coli), tumor necrosis factor-α, fetal bovine serum (FBS)과 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)은 Invitrogen (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
- 실험재료 − 본 연구에 사용한 해조류 80% 에탄올 추출물 시료는 제주 생물종다양성연구소에서 분양받았으며, 단박 추출물(JBRI 20349)은 처음 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹이고 세포배양 배지로 농도에 맞게 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- 표준곡선(standard curve)은 human MDC를 이용하여 1,000 pg/mL에서부터 1/2씩 순차적으로 희석하였다(serial dilution). 결과값 측정 시 광학밀도는 450 nm 파장에서 VersaMax ELISA microplate reader로 분석하였다.
- 통계처리 − 본 연구의 통계처리는 Student’s t-test 분석을 이용하여 검정했으며, 값은 평균과 표준편차로 나타냈다.
이론/모형
- 16) 세포에 단박 추출물을 처리하여 활성 평가에 들어가기 앞서, 단박 추출물이 세포독성에 의하여 염증성 chemokine 생성이 억제될 가능성을 배제하기 위해 MTT assay 방법을 사용하였다. 세포에 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL) 와 함께 단박 추출물을 각각의 농도 별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay로 세포 생존능을 측정하였다.
- 5, 25 µg/mL) for 24 hr. Cell viability was determined by MTT assay. (B) Cells (2.
- 통계처리 − 본 연구의 통계처리는 Student’s t-test 분석을 이용하여 검정했으며, 값은 평균과 표준편차로 나타냈다. Western blot에서 측정한 density는 Image J을 사용하여 확인하였다.
- 5), 150 mM NaCl, 1% Nonident P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 µg/mL leupeptin)를 처리하고 얼음 위에서 30분 동안 lysis하였다. 그 후 cell lysates을 튜브에 담고, 원심분리(15000 RPM, 4℃, 15분)하여 cell down한 후 상등액만 분리하여 western blot analysis에 사용하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 사용하여 표준화하였고, 단백질정량은 bradford assay (Bio-rad, Herculers, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 그 후 cell lysates을 튜브에 담고, 원심분리(15000 RPM, 4℃, 15분)하여 cell down한 후 상등액만 분리하여 western blot analysis에 사용하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 사용하여 표준화하였고, 단백질정량은 bradford assay (Bio-rad, Herculers, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 동량의 lysate를 8% mini gel sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 loading하여 변성 분리한 후, PVDF membrane (Bio-Rad)에 100mA로 약 2시간 동안 이식(transfer)하였다.
성능/효과
- HaCaT 각질형성세포에 IFN-γ와 TNF-α(10 ng/mL)를 처리했을 때, 인산화된 STAT1이 의존적으로 증가하였으며, IFN-γ와 TNF-α를 처리한지 15분에 인산화가 가장 증가한 것을 확인하였다(Fig. 3-A).
- 결과 IFN-γ와 TNF-α 처리 후 증가된 STAT1의 인산화는 단박 추출물 처리에 의해 농도 의존적 감소를 나타내었다(Fig. 3-B).
- 세포에 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL) 와 함께 단박 추출물을 각각의 농도 별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay로 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과 단박 추출물을 처리한 각각의 농도에서 세포에서 독성이 나타나지 않음을 확인 할 수 있었다(Fig. 2-A). 따라서 이후의 활성 평가 실험은 25 µg/mL 이하의 농도에서 실시하였다.
- 그 결과, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)와 단박 추출물을 각 농도 별로(3.13, 6.25, 12.5, 25 µg/mL) 동시 처리하였을 때, IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)만 처리한 그룹에서 418.6 pg/mL의 MDC가 생성된 반면, 단박 추출물을 처리한 그룹에서는 MDC의 생성이 단박 추출물에 대하여 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
- 단박 추출물은 IFN-γ와 TNF-α 자극으로 유도되는 MDC 생성을 농도의존적으로 억제하였으며, 이와 연결되는 신호 전달 경로인 STAT1의 인산화 및 핵 내 전이를 일관성 있게 억제하였다.
- 앞선 결과에서 단박 추출물은 IFN-γ와 TNF-α의 자극으로 유도된 STAT1 인산화를 감소시켰다(Fig. 3).
- 2012년 김 등은 IFN-γ와 TNF-α로 자극된 HaCaT 각질형성세포에서 Inulae Flos(선국화)가 MDC 생성을 억제한다고 보고하였다. 이러한 결과들은 면역세포에서 염증관련 chemokine인 MDC 생성을 감소시키는 것이 알러지성 질환을 개선할 수 있음을 시사한다.
- 특히 12.5, 25 µg/mL의 단박 추출물을 처리한 그룹에서는 IFN-γ와 TNF-α (10 ng/mL)만 처리한 그룹과 비교하였을 때, 12.5 µg/mL에서 222.9 pg/mL, 25 µg/mL에서 176.3 pg/mL의 MDC 생성이 확인되어 단박 추출물로 인해 MDC 생성이 감소된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2-B).
- 특히, STAT1 인산화를 강하게 억제했던 농도인 6.25, 12.5 µg/mL에서(Fig 3) STAT1이 세포질에 강한 형광을 나타낸 것으로 보아 단박 추출물의 STAT1 인산화 억제는 핵 내 전이감소로 연결된다는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 단박 추출물은 IFN-γ와 TNF-α 자극으로 유도되는 MDC 생성을 농도의존적으로 억제하였으며, 이와 연결되는 신호 전달 경로인 STAT1의 인산화 및 핵 내 전이를 일관성 있게 억제하였다. 이러한 결과는 단박 추출물이 STAT1 경로 억제를 통해 염증 억제효과를 발휘하며, 단박 추출물이 염증성 피부질환의 예방 및 치료에 유용한 소재가 될 수 있음을 시사한다.
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