[논문]LPS로 유도한 마우스의 급성신경염증에 대한 톱니모자반(Sargassum serratifolium) 추출물의 효과

최민우; 김형락; 이형곤; 김재일

doi:10.5657/kfas.2019.0081

LPS로 유도한 마우스의 급성신경염증에 대한 톱니모자반(Sargassum serratifolium) 추출물의 효과
Effect of a Sargassum serratifolium Extract on Neuroinflammation Induced by Lipopolysaccharides in Mice 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.52 no.1, 2019년, pp.81 - 86

최민우 (부경대학교 식품영양학과) , 김형락 (부경대학교 식품영양학과) , 이형곤 (산안토니오텍사스주립대학교 생물학과) , 김재일 (부경대학교 식품영양학과)

Abstract ▼ AI-Helper

The common hallmark of several neurodegenerative disorders, including Alzheimer's disease (AD), is the presence of chronic neuroinflammation, which contributes to the loss of neuronal structure and function. This study investigated the effects of an ethanolic extract of Sargassum serratifolium (SSE) in a lipopolysaccharides (LPS)-induced murine neuroinflammation model. Mice were administered SSE (100 mg/kg body weight) or vehicle for 5 days by oral gavage, and then treated with LPS or saline by intraperitoneal injection. Thereafter, the brain tissues were collected, and the expression of pro-inflammatory cytokines was analyzed by quantitative real-time RT-PCR. There was a marked increase in the spleen weight index in the LPS-treated groups, which indicated the induction of acute systemic inflammation. Based on significant increases in the levels of IL-1 and IL-6 expression, the induction of neuroinflammation was also evident in the cortex and hippocampus of the LPS-treated groups. The overall expression of IL-1 and IL-6 was decreased slightly by SSE administration, compared with the LPS group, and a marked change in IL-1 was observed in the cortex of the SSE-treated (SSE/LPS) group. These results suggest that SSE has potential as an anti-neuroinflammatory nutraceutical.

주제어

표/그림 (3)

표 Table 1. Primers used for quantitative real-time RT-PCR analysis
표 Table 2. Body weight change and spleen weight index in C57BL/6J mice treated with or without ethanolic extract of Sargassum serratifolium (SSE) followed by lipopolysaccharides (LPS)
표 Table 3. Gene expression profle of pro-infammatory cytokines in the brains of C57BL/6J mice treated with or without ethanolic extract of Sargassum serratifolium (SSE) followed by lipopolysaccharides (LPS)

AI 본문요약
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문제 정의

, 2017), 신경염증과 관련된 활성은 불분명하다. 따라서, 본 연구에서는 마우스에 lipopolysaccharides(LPS)를 주입하여 급성신경염증을 유발하고, 이들 동물에 톱니모자반 주정추출물(ethanolic extract of S. serratifolium, SSE)을 투여하여 그 억제효과를 구명하고자 하였다.

제안 방법

이 기간 동안 Control 및 LPS군은 동일한 양의 vehicle을 경구투여하였다. LPS에 의한 급성신경염증은 Jo et al. (2017)의 방법에 따라 5일째 최종 투여한 이후 2시간 뒤에 LPS(5 mg/kg body weight)를 LPS와 SSE/LPS군에 복강투여하여 유도하였다. Control의 경우 동일한 양의 PBS를 투여하였다.
SSE는 DMSO에 녹인 후 vehicle(25% DMSO/75% PEG-400)에 최종농도를 맞추어서 경구투여 시료를 제조하였고(Gerenu et al., 2015), SSE/LPS군을 대상으로 체중 kg당 100 mg의 농도로 5일간 경구투여(oral gavage)하였다. 이 기간 동안 Control 및 LPS군은 동일한 양의 vehicle을 경구투여하였다.
TRIzol 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 대뇌피질 및 해마 조직으로부터 total RNA를 추출하였다. Total RNA(400 ng)을 사용하여 high capacity cDNA reverse transcription kits(Applied Biosystems, Beverly, MA, USA)로 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다.
TRIzol 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 대뇌피질 및 해마 조직으로부터 total RNA를 추출하였다. Total RNA(400 ng)을 사용하여 high capacity cDNA reverse transcription kits(Applied Biosystems, Beverly, MA, USA)로 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA(10ng)를 PowerUp™ SYBR™ green master mix(Applied Biosystems, Beverly, MA, USA), 표적유전자 특이적인 primers를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다.
4시간 이후 avertin 용액(250-500 mg/kg body weight)으로 안락사 시키고 뇌조직을 적출하여 대뇌피질(cerebral cortex)과 해마(hippocampus) 부위를 분리해서 –80℃에 보관하였다. 또한 이들 마우스의 비장(spleen)을 적출하여 무게를 측정하고, 체중대비 비장의 무게(spleen weight index)를 계산하였다. 이상의 동물실험은 샌안토니오 텍사스주립대학교(University of Texas at San Antonio)의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 규정에 따라 수행하였다.
먼저 SSE를 5일 동안 경구투여하였고 마지막 날 LPS를 투여하여 신경염증을 유도하였다. 각 실험군의 체중변화 및 비장의 무게를 Table 2에 나타내었다.
, 2017). 본 실험에서는 퇴행성신경변화에 취약한 뇌조직인 대뇌피질(cortex)과 해마(hippocampuse) 영역에서 염증촉진성 cytokines의 발현수준을 real-time qunatitative RT-PCR 방법으로 비교분석하였고 그 결과는 Table 3에 나타내었다. 두 뇌조직 모두에서 LPS 투여에 의해 IL-1β 및 IL-6의 발현이 현저하게 증가하였고(P<0.
, 2017)에서, LPS 투여 이후의 시간에 따른 염증성 cytokines의 발현수준의 변화를 분석하였을 때, IL-1β 및 IL-6 두 가지 모두 2시간째에 가장 높게 발현되고, 이후 6시간째에는 점차 감소하여 12시간 이후부터는 검출되지 않는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 LPS 투여 이후 4시간째에 뇌조직을 분리하여 분석하였다. 이 시간대는 뇌조직의 급격한 cyokines 발현증가가 계속 높게 유지되는 시간이라고 볼 수 있고, 따라서 SSE의 극적인 효과를 확인하기는 어려운 조건일 수도 있었을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 신경염증에 대한 톱니모자반 주정추출물(SSE)의 효과를 알아보기 위해서 마우스에 LPS를 투여하여 급성신경염증을 유발한 모델을 이용하였다. 이러한 LPS 투여에 의한 신경염증모델은 약물 및 천연물, nutraceutical을 포함하여 다양한 화합물들의 생리활성 및 신호전달기전 구명을 위한 모델로서 널리 이용되고 있다(Catorce and Gevorkian, 2016).
, 2015), SSE/LPS군을 대상으로 체중 kg당 100 mg의 농도로 5일간 경구투여(oral gavage)하였다. 이 기간 동안 Control 및 LPS군은 동일한 양의 vehicle을 경구투여하였다. LPS에 의한 급성신경염증은 Jo et al.
실험동물은 12주령의 암컷 C57BL/6J 마우스(9마리)를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. 일주일의 적응기간 뒤 3마리씩 무작위로 세 그룹으로 나누고, 각각 Control, LPS군, SSE/LPS군으로 할당하였다.
합성된 cDNA(10ng)를 PowerUp™ SYBR™ green master mix(Applied Biosystems, Beverly, MA, USA), 표적유전자 특이적인 primers를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다.

대상 데이터

, 2017)의 방법에 따라 처리하였다. 2016년 5월에 부산기장에서 채취하였고, 종의 확인은 부경대학교 생태공학과 최창근 교수가 수행하였다. 톱니모자반은 자연건조한 후 분쇄하였고, 분말 50 g에 10배 양의 주정(95% 에탄올)을 넣고 70℃에서 4시간 2회 반복하여 환류냉각 추출하였다.
Poly (ethylene glycol)-400 (PEG-400), phosphate-buffered saline (PBS), 2,2,2-tribromoethanol (avertin), LPS는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구매하였고, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Life Sciences(Tewksbury, MA, USA)에서 구매하였다. RNA 추출을 위한 TRIzol 시약은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서, tert-amyl alcohol(2-methyl-2-butanol)은 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA, USA)에서 각각 구매하였다, High Capacity cDNA Reverse Transcription Kitsand RNase Inhibitor와 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix는 Applied Biosystems(Beverly, MA, USA)에서 구매하였다.
RNA 추출을 위한 TRIzol 시약은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서, tert-amyl alcohol(2-methyl-2-butanol)은 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA, USA)에서 각각 구매하였다, High Capacity cDNA Reverse Transcription Kitsand RNase Inhibitor와 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix는 Applied Biosystems(Beverly, MA, USA)에서 구매하였다.
실험동물은 12주령의 암컷 C57BL/6J 마우스(9마리)를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. 일주일의 적응기간 뒤 3마리씩 무작위로 세 그룹으로 나누고, 각각 Control, LPS군, SSE/LPS군으로 할당하였다.

데이터처리

분석결과는 평균값 및 표준편차(mean±SD)를 계산하여 나타내었고, 실험군 간의 유의성 검증은 Student’s t-test로 검증하였다.

이론/모형

유전자 발현양의 비교는 상대적인 비교를 위해 ΔΔCt 방법을 이용하였으며(Choi etal., 2017), real-time PCR에 이용된 각 primers의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
톱니모자반(S. serratifolium)은 이전의 보고(Gwon et al., 2015; Joung et al., 2015; Choi et al., 2017)의 방법에 따라 처리하였다. 2016년 5월에 부산기장에서 채취하였고, 종의 확인은 부경대학교 생태공학과 최창근 교수가 수행하였다.

성능/효과

두 뇌조직 모두에서 LPS 투여에 의해 IL-1β 및 IL-6의 발현이 현저하게 증가하였고(P<0.05-P<0.01), 그 증가폭은 IL-6에서 더 큰 것으로 나타났다.
각 실험군의 체중변화 및 비장의 무게를 Table 2에 나타내었다. 세 군 모두 투여 첫날과 비교하여 5일 째 1 g 내외의 체중증가는 있었으나 유의적인 변화는 없었고, 또한 vehicle만을 투여한 대조군 및 LPS군과 비교하여 SSE 투여군(SSE/LPS)의 체중도 뚜렷한 차이가 없었다. LPS를 투여했을 때 급성전신염증의 유도는 비장중량지수(spleen weight index)를 비교함으로써 분석할 수 있다(Li et al.
이들의 cytokines의 발현수준은 SSE 투여(SSE/LPS군)에 의해 감소하는 경향을 보였고, 대뇌피질의 경우 IL-1β 발현양이 유의적으로 감소를 확인할 수 있었다(P<0.05).

후속연구

이들 단백질응집들은 뇌조직에서 신경염증을 유발하는 원인물질로 작용할 수 있고, 지속적으로 축적되어 만성적인 염증을 유발함으로써 신경세포 소실에 영향을 미칠 수 있다(Soto, 2003; Schain and Kreisl, 2017). 따라서 본 연구에서 확인된 SSE의 항신경염증효과는 주요 퇴행성신경질환의 예방 혹은 치료를 위한 천연해조류성분의 이용가능성을 제시하는 기초자료로 이용될 수 있을 것이다.
이 시간대는 뇌조직의 급격한 cyokines 발현증가가 계속 높게 유지되는 시간이라고 볼 수 있고, 따라서 SSE의 극적인 효과를 확인하기는 어려운 조건일 수도 있었을 것으로 판단된다. 향후 연구에서는 보다 다양한 시간대별 발현의 차이를 비교분석하는 연구를 수행하는 것이 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	주요 퇴행성 신경질환의 공통적인 병리학적 특성은?	알츠하이머병(Alzheimer’s disease, AD), 프리온질환(priondiseases), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 근위축성측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis)과 같은 주요 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disorders)의 공통적인 병리학적 특성은 신경세포의 소실(neuronal loss) 및 활성화된 미세아교세포(acti-vated microglia)가 존재한다는 것이다(Soto, 2003). 중추신경계에 상주하는 대식세포(macrophages)인 미세아교세포의 활성화는 신경염증(neuroinfammation)의 주요 특성이고, 그 분포가 퇴행성신경질환의 병리학적 병변부위에서 관찰됨으로써 이들 질환의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다(McGeeret al.
	톱니모자반(Sargas-sum serratifolium)의 특징은?	, 2012). 톱니모자반(Sargas-sum serratifolium)은 한국과 일본의 연안에 광범위하게 서식하고 있고, 형태학적으로 줄기 가장자리에 끝이 가시형태를 가지고 있다는 것이 특징이다(Oak and Lee, 2006). 최근 톱니모자반의 추출물 및 함유 화합물들을 이용한 in vivo 및 in vitro 연구에서 다양한 생리활성들이 보고되었는데, 항암(anti-cancer)(Kang et al.
	주요 퇴행성신경질환 별 뇌조직에서 관찰되는 단백질 응집물은 각각 무엇인가?	주요 퇴행성신경질환의 공통적인 특성은 뇌조직에 단백질 응집물이 존재한다는 것이다(Soto C, 2003; Schain and Kreis l, 2017). 알츠하이머병의 경우 β-amyloid, 프리온질환의 경우 비정상적인 prion protein, 파킨슨병의 경우 α-synuclein과 같은 단백질로 이루어진 비정상적인 응집물이 관찰되고, 이러한 특성에서 각 질환들의 발병의 주요 원인물질로 알려져 있다. 이들 단백질응집들은 뇌조직에서 신경염증을 유발하는 원인물질로 작용할 수 있고, 지속적으로 축적되어 만성적인 염증을 유발함으로써 신경세포 소실에 영향을 미칠 수 있다(Soto, 2003;Schain and Kreisl, 2017).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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