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문제 정의
- 26) 따라서, MDC mRNA발현에 대한 억제 활성을 보인 artemisinic aicd의 억제 활성 기전을 확인하기 위하여, HaCaT세포에서 IFN-γ와 TNF-α 자극으로 활성화 되는 것으로 알려진 신호전달 인자들인 STAT1, p38, NF-κB에 대한 효과를 확인해 보았다.
- LPS로 유도되는 다양한 염증성 cytokines 중 대표적인 cytokine인 IL-6에 대한 artemisinic acid의 억제효능도 확인해 보았다. RAW264.
- 그람 음성균의 세포벽 성분인 lipopolysaccharide (LPS)는 이와 같은 세포를 자극하여 NO, PGE2, 염증성 cytokine과 같은 다양한 염증성 인자들의 생성을 유도한다30,31). 따라서, artemisinic acid의 항염증 활성을 평가하고자, 대식세포인 RAW264.7 세포를 LPS로 자극한 후 생성되는 염증성 인자들에 대한 artemisinic acid의 억제 활성을 확인하였다. 먼저, RAW264.
- 18) 하지만, 아직까지 artemisinic acid의 항염증 활성에 대한 보고는 없는 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 다양한 염증성 인자들에 대한 artemisinic acid의 활성 및 그 작용기 전을 평가하고자 하였다.
- 본 연구에서는 개똥쑥으로부터 분리된 성분인 artemisinic acid이 각질형성세포주와 대식세포주에서 유도되는 다양한 전염증성 인자들(MDC, NO, PGE2, IL-6)에 대한 억제활성을 확인해 보았다. Artemisinic acid는 대식세포인 RAW264.
- 이와 같은 artemisinic acid의 억제활성이 HaCaT 세포에 대한 독성으로 인해 나타나는 영향이 아닌지 확인하기 위하여 세포 생존능에 대한 영향을 확인해 보았다. HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α로 자극하고, artemisinic acid를 12.
제안 방법
- 20) HaCaT 세포에서 RNA분리 및 RT-PCR 은 HaCaT 세포(5.0 × 105 cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2 항온기에서 18시간 전배양 하였다.
- PCR은 Peltier Thermal Cycler (PTC-100, MJ research, Reno, NV)을 사용하였으며, 각 인자에 대해서 denaturing at 94oC, 30 초, annealing at 55- 60oC, 30 초, extending at 72oC, 2 분 조건에서 32 cycle로 수행하였다. PCR 산물은 1.2% agarose gel (Promega)로 전기영동 후, ethidium bromide로 염색하고 UV light illumination으로 확인하였다.
- Primer sequence는 MDC (497 bp): 5'-GCATGGCTCGCCTACAGACT-3'와 5'- GCAGGGAGGGAGGCAGAGGA-3'; β-actin (588 bp): 5'- ATGGGTCAGAAGGATT-CCTATG-3'와 5'-CAGCTCGTAG CTC-TTCTCCA-3'이다. PCR은 Peltier Thermal Cycler (PTC-100, MJ research, Reno, NV)을 사용하였으며, 각 인자에 대해서 denaturing at 94oC, 30 초, annealing at 55- 60oC, 30 초, extending at 72oC, 2 분 조건에서 32 cycle로 수행하였다. PCR 산물은 1.
- RAW264.7 세포에 25, 50, 100, 200 µM의 artemisinic acid와 LPS를 처리한 다음 24시간 후 IL-6의 생성량을 ELISA를 이용하여 확인하였다.
- STAT1과 p38의 경우에는 인산화 되는 정도를 직접 확인하였고, NF-κB의 경우에는 NF-κB와 결합하여 활성을 억제시키는 인자인 inhibitor κB (IκB)의 발현 여부를 확인하였다.
- 간단히 기술하면 먼저 96 well plate 에 2 × 104 cells/well이 되도록 동일하게 분주하고 24시간동안 배양하였다. 기존의 배지를 제거하고, 다양한 농도의 시료가 포함된 새로운 배지로 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 배지에 WST solution (2-(4- Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2Htetrazolium)를 10 µL씩 넣고 2~3시간 동안 배양하였다.
- 이후 추출물은 진공 농축하였고, chloroform (400 mL)에 6% methanol을 사용하여 다시 추출하였다. 다시 한번 진공 농축한 후, MPLC (RediSep, silica 120 g, 3.5200 mm; detection, UV at 254 nm; flow rate, 85 ml/min)를 실시하여 얻어진 50개의 소분획을 얻고, 이중 10-18번 소분획에 대하여 preparative TLC (Si gel using a 6% ethylacetate in CHCl3 solvent system)을 실시하여 혼합물 940 mg을 얻었다. 이 혼합물에 대하여 reversed-phase preparative HPLC (Phenomenex Luna C18(2), 21.
- 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 표준화 하여 Bio-Rad assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.
- 마지막으로 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에서 artemisinic acid의 세포 생존능에 대한 영향을 확인하였다. 세포에 artemisinic acid를 농도별 50, 100, 200, 400 µM로 처리하여 24시간 동안 배양하였고, WST assay를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다.
- 먼저, RAW264.7 세포에 LPS (1 µg/ mL)와 artemisinic acid를 25, 50, 100, 200 µM로 처리하여 24시간 배양한 후, 세포 배양 상층액에서 NO 생성량의 변화를 griess 방법으로 확인하였다.
- TTBS washing 후, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-primary antibody host IgG 항체는 1:5000으로 희석하여 실온에서 1 시간 30분 동안 처리하였다. 면역반응이 완료된 membrane은 WEST-ZOL plus Western blot detection system (iNtRON Biotechnology, Korea)을 이용하여 발광시킨 후, X-ray 필름에 감광시켜 확인하였다.
- 세포 배양액 내 PGE2와 IL-6는 ParameterTM Prostaglandin E2 Assay kit와 DuoSet® mouse IL-6 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 각각 측정하였다.
- 세포에 artemisinic acid를 농도별 50, 100, 200, 400 µM로 처리하여 24시간 동안 배양하였고, WST assay를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다.
- 이후 배지를 제거하고 IFN-γ와 TNF-α와 시료가 포함된 배지를 처리하여 배양한 후, TRI-reagent (MRC)를 이용하여 total RNA를 분리하였다.
- 이후 배지를 제거하고 시료가 포함된 배지를 처리하여 2시간 동안 전처리 하였고, IFN-γ와 TNF-α로 15~30분간 자극하였다.
대상 데이터
- 1H-and13C-NMR은 Bruker Avance-500 (500 MHz)를 사용하였으며, GC-MS는 Hewlett Packard사의 HP6890 GC-HP5972 MS를 사용하였다(electron impact, ionization voltage 70 eV).
- Anti-p38, anti-IκB-α, and anti-phospho-STAT1 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하여 사용하였다.
- anti-STAT1 and anti-phospho-p38 항체는 Becton Dickinson (San Diego, CA)에서 구입하였고, β-actin 항체는 Sigma에서 구입하여 사용하였다.
- 7 세포는 ATCC (Rockville, MD)에서 분양 받았다. 각각의 세포주는 10% FBS와 1% 항생제가 첨가된 DMEM을 사용하여 습한 조건의 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포생존능은 Naramwongsatit가 기술한 방법을 참고하여 실시하였고,19) EZ-cytox enhanced cell viability assay kit (itBIO, Korea)을 사용하여 측정하였다.
- 분취용 HPLC는 검출기로서 Waters 2487 Dual λAbsorbance를 포함하는 Waters prep LC 2000 system을 사용하였으며, 사용된 컬럼은 Luna C18(2) column (21.2 × 250 mm, 5 µm, Phenomenex)을 사용하였다.
- 세포배양 및 세포생존능 평가 − 사람 각질형성세포주인 HaCaT 세포는 제주대학교 의학전문대학원 조문제 교수로 부터 분양 받았고, 생쥐 대식세포주인 RAW264.7 세포는 ATCC (Rockville, MD)에서 분양 받았다.
- 시약 및 기기 − Lipopolysaccharide (LPS, E. coli 011:B4) 는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 시료는 제주도에서 2010년 6월에서 9월에 걸쳐 채집된 시료를 제주 하이테크 산업진흥원의 종다양성 연구소로부터 분양 받아 사용하였다.
- 재조합 interferon-γ, tumor necrosis factor-α, fetal bovine serum (FBS)와 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)는 Invitrogen (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
데이터처리
- 통계처리 − 본 실험의 통계처리는 Student’s t-test 방법을 사용하였으며, 값은 평균과 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 기타 시약들은 특급 시약을 사용하였다. MPLC는 CombiFlash companion (Teledyne ISCO)을 사용하였다. MPLC에 사용된 분취용 컬럼은 RediSep column (silica 120 g, 3.
- NO Assay − 세포배양액 내의 NO는 NO의 분해산물인 nitrite (NO2−)를 측정함으로써 NO의 양을 간접적으로 측정하는 Griess reagent (Promega, Madison, WI) 방법으로 측정하였고, 이 등이 기술한 절차에 따라 실행하였다.
- Polymerase Chain Reaction (PCR)은 합성된 cDNA로 부터 MDC와 β-actin을 증폭시키기 위하여, 각 유전자에 대해 특이적인 primer와 i-TaqTM DNA polymerase (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 수행하였다.
- RNA분리 및 RT-PCR − MDC mRNA 발현에 대한 artemisinic acid의 활성은 Xizo등이 기술한 방법을 참고하여 실시하였다.
- (A) NO, (B) PGE2 and (C) IL-6 productions were determined from the culture supernatant of cells stimulated by LPS (1 µg/mL) with indicated concentrations of artemisinic acid for 24 hrs. The NO production was measured by Griess method and PGE2 and IL-6 levels were measured by ELISA. The error bars indicate standard deviation.
- 다음은 artemisinic acid의 PGE2 에 대한 억제효능을 확인하기 위하여 ELISA를 이용하여 확인하였다. RAW264.
- 각각의 세포주는 10% FBS와 1% 항생제가 첨가된 DMEM을 사용하여 습한 조건의 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포생존능은 Naramwongsatit가 기술한 방법을 참고하여 실시하였고,19) EZ-cytox enhanced cell viability assay kit (itBIO, Korea)을 사용하여 측정하였다. 간단히 기술하면 먼저 96 well plate 에 2 × 104 cells/well이 되도록 동일하게 분주하고 24시간동안 배양하였다.
성능/효과
- Artemisinic acid는 대식세포인 RAW264.7 세포에서 LPS 자극으로 유도되는 염증성 인자인 NO, PGE2, IL-6에 대해서는 억제활성이 약하거나 없었지만, 각질형성 세포인 HaCaT 세포에서 IFN-γ와 TNF-α 자극으로 유도되는 아토피 피부염 관련 인자인 MDC발현에 대해서 억제활성을 나타내었다.
- HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α로 자극하고, artemisinic acid를 12.5, 25, 50, 100 µM로 처리한 결과, 100 µM에서 세포 생존능을 약 80% 정도로 억제하였지만, 활성을 평가했던 농도인 50 µM이하에서는 세포 생존능에 영향을 주지 않았다(Fig. 1-C).
- HaCaT세포에 IFN-γ와 TNF-α를 자극했을 때, STAT1, p38 의 인산화 또는 IκB의 degradation이 시간의존적으로 나타났다(data not shown).
- LPS로 자극하지 않은 대조군에 비해 LPS로 자극한 실험군에서 NO의 생성량이 약 14배 이상 증가하였고, 이는 artemisinic acid를 100, 200 µM 농도로 처리했을 때, 유의적으로 억제되었다(Fig. 3-A).
- RAW264.7 세포에 25, 50, 100, 200 µM의 artemisinic acid를 LPS와 함께 처리한 다음 24시간 후 PGE2 생성량을 확인한 결과, LPS 를 처리한 후 PGE2의 생성량은 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비하여 증가되었다.
- 결과에서처럼, artemisinic acid 를 400 µM로 처리했을 때 세포 생존능이 약 80% 정도로 억제 됐지만, 200 µM이하의 농도에서는 RAW264.7 세포의 생존능에 영향을 주지 않았다(Fig. 3-D).
- 7 세포에 25, 50, 100, 200 µM의 artemisinic acid와 LPS를 처리한 다음 24시간 후 IL-6의 생성량을 ELISA를 이용하여 확인하였다. 그 결과, LPS를 처리한 후 IL-6의 생성이 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비하여 증가되었으나, artemisinic acid를 농도별로 처리한 군에서도 LPS로 자극한 실험군과 유사한 IL-6 생성량을 보였다(Fig. 3-C).
- 3-D). 요약하자면, artemisinic acid가 대식세포에서 LPS로 유도되는 NO에 대해서는 약한 억제 효과를 보였지만, 각질형성세포에서 MDC 에 대한 억제 활성을 나타낸 농도에 비해 고농도에서 억제 활성을 나타냈고, 또 다른 염증성 인자들인 PGE2와 IL-6에 대한 억제 활성이 없었다.
- 이러한 결과들은 artemisinic acid가 HaCaT 세포에서 IFN-γ와 TNF-α 자극으로 유도되는 염증성 chemokine인 MDC 발현에 대해 억제 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
- 이어서, artemisinic acid를 12.5, 25, 50 µM로 2시간 동안 전처리한 후, IFN-γ와 TNF-α를 자극으로 활성화되는 인자에 대한 영향을 확인한 결과, STAT1과 p38의 인산화가 억제되었고, 감소되었던 IκB의 수준도 농도의존적으로 회복되는 양상을 확인하였다(Fig. 2).
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