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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 홍화씨의 식품학적 기초자료를 제공하고자 일반성분, 아미노산 조성, 지방산 조성, 유리당 조성, 무기질 조성 등을 분석하였다. 또한, 식중독 발병원인균에 대한 홍화씨 에탄올 추출물의 항균활성을 조사하였다.
- 본 연구는 홍화씨의 식품학적 성분 및 항균활성을 분석하였다. 홍화씨의 수분함량은 5.
제안 방법
- 2 μm membrane 필터로 여과하였다. AccQ․Fluor Reagent kit를 사용하여 유도체화시켜 홍화씨의 구성 아미노산을 분석하였다. 즉, 여과된 유리 아미노산 시료 10 μL를 시험관(Φ 6×50 mm) 밑바닥에 취하고 여기에 AccQ·Fluor Reagent kit의 1용액 70 μL를 넣어 혼합하였다.
- 여기에 묽은염산(1:1 HCl) 10 mL를 첨가한 다음 이를 50 mL 정용플라스크로 옮겨 탈이온수로 정용, 여과하여 유도결합 프라즈마 원자방출 분광법(ICP-AES, Inductively Coupled Plasma Atomic Emisson Spectrophotometer, Jobin YvonJY138 Ultrace, France)으로 분석하였다. 각 원소의 표준용액은 0, 1, 10 ppm의 3수준의 농도로 조제하여 표준검량곡선을 작성하였으며 이때, ICP-AES의 작동조건은 power:1.0 kW for aqueous, nebulizer pressure: 3.5 bar for meingard type c, aerosol flow rate: 0.3 L/min, shealth gas flow: 0.3L/min, cooling gas: 12 L/min 이었다. 각 무기질의 검출 파장은 Ca: 393.
- 계대배양된 균주는 Nutrient agar에 도말 처리한 이후 각 시료를 0, 10, 50, 100, 200μL씩 loading 한 8 mm disk를 처리하였다(각각 0, 0.2, 1.0,2.0, 4.0 mg/disk, dry base).
- 본 연구에 사용된 홍화씨는 국내산으로 2011년도에 수확한 것을 영농법인 제천한방마을(Jechon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 구입한 홍화씨는 이물질을 제거하고 분쇄기(IKA M20, IKA, Staufen, Germany)로 20～30 mesh로 조분쇄하였고 일반성분, 아미노산, 유리당, 지방산, 무기질, 비타민 등의 식품학적 성분분석 및 항균활성 측정에 사용하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 홍화씨의 식품학적 기초자료를 제공하고자 일반성분, 아미노산 조성, 지방산 조성, 유리당 조성, 무기질 조성 등을 분석하였다. 또한, 식중독 발병원인균에 대한 홍화씨 에탄올 추출물의 항균활성을 조사하였다.
- 분쇄된 홍화씨에 약 10배의 80% 에탄올을 첨가하고 80∼100℃ 수욕 상에서 3시간동안 환류냉각하면서 3회 반복 추출하였다.
- 즉, Folin-Dennis 시약은 sodium tungstate 10 g, phosphomolybdic 2 g, phosphoric acid 5 mL를 100 mL 용량 플라스크에 넣고 증류수로 정용한 후 삼각플라스크에 옮겨 2시간 동안 환류조작하여 사용하였다. 실험방법으로는 캡튜브에 증류수 7 mL씩 넣고 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹인 시료를 1 mL씩 넣은 후 Folin-Dennis 시약을 0.5 mL를 첨가한 다음, 정확히 3분 후에 sodium carbonate anhydrous 포화용액 1 mL, 증류수 0.5 mL를 넣은 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로는 gallic acid (Sigma co.
- 여기에 미리 55℃에서 반응시킨 2A 용액 20 μL를 넣어 재혼합하였고, 이를 실온에서 1분간 방치한 후 55℃에서 10분간 유도체화시킨 다음 HPLC로 유리 아미노산을 측정하였다.
- 홍화씨 추출물을 각각 일정량 취한 후 50% methanol용액 5 mL로 정용한 시료 용액 1 mL과 diethylene glycol 10 mL를 혼합하고 여기에 1 N NaOH용액 1 mL 가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 quercetin (Sigma Co, St Louis, USA)을 이용하였고 농도별로 표준곡선(y=3.3533x+0.0377)을 작성하여 홍화씨 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
- Louis, USA)를 사용하였다. 이때 표준곡선(y=8.8187x+0.0324)을 농도 별로 작성하여 총 페놀 함량을 측정하였다.
- 배양이후 각 미생물에 대한 활성화된 clear zone의 크기를 계수하여 표시하였다. 이러한 항균 활성은 3회 실험하였다.
- 분쇄된 홍화씨에 약 10배의 80% 에탄올을 첨가하고 80∼100℃ 수욕 상에서 3시간동안 환류냉각하면서 3회 반복 추출하였다. 조추출물은 4℃에서 방냉한 후, Whatman No.3 여과지로 여과하고 10,000g로 원심분리하여 50℃에서 감압농축 한 후 동결건조 하여 홍화씨 80% 에탄올 추출물을 제조하였다. 추출물의 수율은 원료 대비 고형분의 양으로 계산하였다.
- 3 여과지로 여과하고 10,000g로 원심분리하여 50℃에서 감압농축 한 후 동결건조 하여 홍화씨 80% 에탄올 추출물을 제조하였다. 추출물의 수율은 원료 대비 고형분의 양으로 계산하였다.
- 다시 5 mL 헥산을 환류냉각기 위로 넣어 1분간 반응시키고 냉각관에서 분리하여 반응플라스크에 포화식염수 15 mL을 넣고 마개를 막은 상태에서 5초간 가볍게 흔들어 준 후 포화 식염수를 추가로 넣어 헥산층이 플라스크 목까지 올라오도록 하였다. 헥산층을 뽑아 무수황산나트륨이 들어있는 파스퇴르 피펫을 통과시켜 탈수시키고 탈수된 시험액을 가스크로마토그래피에 주입하여 분석하였다. 사용한 칼럼은 HP-INNOWax (30 mx0.
- 홍화씨 분말시료 5 g에 80% ethanol 145 mL을 넣고 90℃ 항온수조에서 2시간 동안 환류 추출한 후 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 적당히 농축시켜, 0.25μm membrane 필터로 여과한 후 HPLC로 분석하였다(14).
- 홍화씨 추출물에 함유된 활성성분을 평가하기 위하여 홍화씨 추출물의 총 flavonoid 함량을 측정하였다(17). 홍화씨 추출물을 각각 일정량 취한 후 50% methanol용액 5 mL로 정용한 시료 용액 1 mL과 diethylene glycol 10 mL를 혼합하고 여기에 1 N NaOH용액 1 mL 가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 홍화씨 추출물에 함유된 활성성분을 평가하기 위하여 홍화씨 추출물의 총 flavonoid 함량을 측정하였다(17). 홍화씨 추출물을 각각 일정량 취한 후 50% methanol용액 5 mL로 정용한 시료 용액 1 mL과 diethylene glycol 10 mL를 혼합하고 여기에 1 N NaOH용액 1 mL 가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 quercetin (Sigma Co, St Louis, USA)을 이용하였고 농도별로 표준곡선(y=3.
- 홍화씨의 식품학적 성분 중 조지방의 지방산 조성을 분석하였다(Table 4). 홍화씨의 조지방 중에 가장 많이 함유되어 있는 지방산은 linoleic acid (C18:2)로 약 79.
- 홍화씨의 일반성분을 분석하기 위하여 수분, 조단백질, 조지방, 조회분 및 탄수화물의 함량을 조사하였다(Table 1). 홍화씨의 수분함량은 5.
대상 데이터
- 항균활성능은 8 mm disk 확산법(19)을 이용한 분석하였다. 10% DMSO을 이용하여 홍화씨 추출물을 20 mg/mL stock으로 만들어 실험에 이용하였다. 이때 사용된 균주 중 Staphylococcus aureus (ATCC112692), Salmonella typhimurium (ATCC14028), Escheria coli (ATCC11775), Candida albicans (00432 ATCC 1023 IFO 1594), Bacillus cereus (ATCC1178IFO)은 한국식품연구원에서 분양받아 사용하였으며, Listeria monocytogenes (ATCC 19114), Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802D-5), Clustridium perfringens (ATCC13124)는 한국균주은행에서 분양받아 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 홍화씨는 국내산으로 2011년도에 수확한 것을 영농법인 제천한방마을(Jechon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 구입한 홍화씨는 이물질을 제거하고 분쇄기(IKA M20, IKA, Staufen, Germany)로 20～30 mesh로 조분쇄하였고 일반성분, 아미노산, 유리당, 지방산, 무기질, 비타민 등의 식품학적 성분분석 및 항균활성 측정에 사용하였다.
- 여기에 미리 55℃에서 반응시킨 2A 용액 20 μL를 넣어 재혼합하였고, 이를 실온에서 1분간 방치한 후 55℃에서 10분간 유도체화시킨 다음 HPLC로 유리 아미노산을 측정하였다. 분석에 사용한 아미노산 표준물질은 amino acid standard H (Pierce, USA)이고, 칼럼은 AccQ Tag column (3.9x150 mm, Waters, USA), 검출기는 fluorescence(Ex=250 nm, Em=395 nm, Jasco, Japan)이고 분석온도는 37℃이었다.
- 이때 사용된 균주 중 Staphylococcus aureus (ATCC112692), Salmonella typhimurium (ATCC14028), Escheria coli (ATCC11775), Candida albicans (00432 ATCC 1023 IFO 1594), Bacillus cereus (ATCC1178IFO)은 한국식품연구원에서 분양받아 사용하였으며, Listeria monocytogenes (ATCC 19114), Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802D-5), Clustridium perfringens (ATCC13124)는 한국균주은행에서 분양받아 사용하였다. 분양받은 균주는 Nutrient broth에서 2회 계대배양하여 실험에 이용하였다. 계대배양된 균주는 Nutrient agar에 도말 처리한 이후 각 시료를 0, 10, 50, 100, 200μL씩 loading 한 8 mm disk를 처리하였다(각각 0, 0.
- 사용한 칼럼은 HP-INNOWax (30 mx0.25 mm x 0.25 μm film thickness, USA), 검출기는 불꽃이온화 검출기, 주입기 온도는 220℃, 검출기 온도는 275℃, 오븐의 온도는 50℃/3 min-10℃/min-250℃/5 min, 운반기체는 헬륨이었다.
- 유리당 표준시료는 fructose, sucrose, glucose 및 maltose(Sigma Co, St Louis, USA)를 사용하였고, 칼럼은carbohydrate analysis column (300x3.9 mm, Waters, USA), 검출기는 RI, 시료주입은 10 μL이었다.
- 이때 사용된 균주 중 Staphylococcus aureus (ATCC112692), Salmonella typhimurium (ATCC14028), Escheria coli (ATCC11775), Candida albicans (00432 ATCC 1023 IFO 1594), Bacillus cereus (ATCC1178IFO)은 한국식품연구원에서 분양받아 사용하였으며, Listeria monocytogenes (ATCC 19114), Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802D-5), Clustridium perfringens (ATCC13124)는 한국균주은행에서 분양받아 사용하였다.
- 홍화씨 추출물에 대한 항균효과를 비교한 결과는 Table 7과 같다. 항균활성의 평가를 위하여 Staphylococcus aureus(ATCC112692), Salmonella typhimurium (ATCC14028), Escheria coli (ATCC11775), Candida albicans (00432 ATCC1023 IFO 1594), Bacillus cereus (ATCC1178IFO), Listeria monocytogenes (ATCC 19114), Vibrio parahaemolyticus(ATCC 17802D-5), 및 Clustridium perfringens (ATCC13124)의 pathogen을 사용하였다.
이론/모형
- AOAC법(12)에 따라 수분은 105℃ 상압건조법, 조지방은 soxhlet 추출법, 조단백은 semi micro kjeldahl법, 조회분은 550℃ 회화법으로 정량하였다. 탄수화물은 100에서 조지방, 조단백, 조회분을 뺀 값으로 하였다.
- 여기에 탈이온수 10방울을 가하고 묽은 질산(1:1 HNO3) 4 mL를 넣은 다음 다시 전열기(120℃)에서 수분을 제거시키고 550℃ 전기 회화로에서 1시간 회화 ․ 방냉하였다. 여기에 묽은염산(1:1 HCl) 10 mL를 첨가한 다음 이를 50 mL 정용플라스크로 옮겨 탈이온수로 정용, 여과하여 유도결합 프라즈마 원자방출 분광법(ICP-AES, Inductively Coupled Plasma Atomic Emisson Spectrophotometer, Jobin YvonJY138 Ultrace, France)으로 분석하였다. 각 원소의 표준용액은 0, 1, 10 ppm의 3수준의 농도로 조제하여 표준검량곡선을 작성하였으며 이때, ICP-AES의 작동조건은 power:1.
- 홍화씨의 지방산 분석은 gas chromatography를 이용하여 측정하였다. 우선, 홍화씨의 지방질은 soxhlet 추출법(12)으로 추출하고 AOAC법(15)에 따라 50 mL의 둥근플라스크에 지방질 200 mg을 취하여 0.5 N NaOH/MeOH를 넣고 환류냉각기를 부착한 다음 지방구가 없어질 때까지 가열된 모래상자에서 5～10분간 가수분해 시켰다. 10% BF3/MeOH 5 mL을 환류냉각기 위로 천천히 넣어 2분간 모래상자에 방치하여 반응시켰다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Dennis법에 의하여 분석하였다(18). 즉, Folin-Dennis 시약은 sodium tungstate 10 g, phosphomolybdic 2 g, phosphoric acid 5 mL를 100 mL 용량 플라스크에 넣고 증류수로 정용한 후 삼각플라스크에 옮겨 2시간 동안 환류조작하여 사용하였다.
- 항균활성능은 8 mm disk 확산법(19)을 이용한 분석하였다. 10% DMSO을 이용하여 홍화씨 추출물을 20 mg/mL stock으로 만들어 실험에 이용하였다.
- 홍화씨의 무기질 분석은 유도결합 프라즈마 원자방출 분광법을 이용하여 측정하였다. 홍화씨에 함유된 무기질의 전처리 방법은 건식법(16)으로 하였다. 즉, 홍화씨 분말시료 약 2 g을 도가니에 넣고 전열기에서 예비 가열시킨 후 550℃ 전기 회화로에서 6시간 회화한 다음 방냉 하였다.
- 홍화씨의 무기질 분석은 유도결합 프라즈마 원자방출 분광법을 이용하여 측정하였다. 홍화씨에 함유된 무기질의 전처리 방법은 건식법(16)으로 하였다.
- 홍화씨의 아미노산 함량 분석은 AccQ·Tag 방법(13)을 이용하여 분석하였다(1993).
- 홍화씨의 지방산 분석은 gas chromatography를 이용하여 측정하였다. 우선, 홍화씨의 지방질은 soxhlet 추출법(12)으로 추출하고 AOAC법(15)에 따라 50 mL의 둥근플라스크에 지방질 200 mg을 취하여 0.
성능/효과
- 이상의 결과로 볼 때 Staphylococcus aureus, Salmonellatyphimurium, Escheria coli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus 및Clustridium perfringens에 대한 홍화씨 추출물의 항균효과는 추출물의 농도가 증가함에 따라 보다 강한 항균효과를 보여 홍화씨 추출물에 함유된 페놀성 물질들에 기인한 것으로 사료된다. 향후, 항균활성에 대한 작용기전 연구 및 식중독 균에 오염되기 쉬운 식품류에 응용연구가 요구된다.
- 본 연구의 결과와는 절대적인 수치는 다르지만, 홍화씨의 주요 무기질 성분 및 조성 등은 같은 경향을 보였다. 이상의 결과로 볼 때, 홍화씨는 K 및 Ca의 주요 공급원으로 골다공증과 같은 질병에 매우 중요한 이용가치를 가지고 있다고 사료되었다.
- 홍화씨에는 K 및 Ca의 함량이 1,528 및 1,005 mg%으로가장 많이 함유되어 있었다. 총 무기질 함량(3,478 mg%)을 기준으로 하여 K 및 Ca는 약 43.94 및 28.90%의 비율을 나타내었다. Mg은 607 mg%, Fe는 157 mg%, Na는 134mg%을 함유하는 것으로 나타났다.
- 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 55.52±0.9 mgGAE/g, 78.69±0.91 mg QE/g으로 나타났다.
- 7%로 본 연구의 분석결과와 비슷한 경향을 보였다. 하지만, 가용성무질소물의 함량은 건물량을 기준으로 홍화씨에서 58.9%, 발아홍화씨에서 64.0%로 나타나 본 연구의 결과(40.05%)와 다소 차이를 보이는 것으로 나타났다.
- 홍화씨 추출물의 경우, 4.0 mg의 농도에서 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escheria coli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus 및 Clustridium perfringens 모두에서 강한 항균효과를 보였다. 홍화씨 추출물의 농도와 항균효과간의 관계를 살펴보면 홍화씨 추출물의 농도가 증가함에 따라 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escheriacoli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,Vibrio parahaemolyticus 및 Clustridium perfringens에 대한 항균효과도 증가하는 경향을 보였다.
- 0 mg의 농도에서 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escheria coli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus 및 Clustridium perfringens 모두에서 강한 항균효과를 보였다. 홍화씨 추출물의 농도와 항균효과간의 관계를 살펴보면 홍화씨 추출물의 농도가 증가함에 따라 Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escheriacoli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,Vibrio parahaemolyticus 및 Clustridium perfringens에 대한 항균효과도 증가하는 경향을 보였다.
- 홍화씨를 80% 에탄올로 환류 냉각하여 추출한 후, 여과 및 감압농축 하고 동결건조 한 추출물의 추출수율은 약 37.0% 이었다. Table 6에서 보는바와 같이, 홍화씨 추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 각각 55.
- 42%를 함유하여 불포화지방산의 함유량도 매우 높게 나타났다. 홍화씨의 무기질 함량 측정 결과, K 및 Ca의 함량이 1,528 및 1,005 mg%으로 가장 많이 함유되어 있었다. 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 55.
- 홍화씨의 수분함량은 5.58±0.09% 이었고 조단백질 함량은 37.16±0.85%, 조지방 함량은 13.69±8.98%, 조회분 함량은 3.52±0.04%, 탄수화물 함량은 40.05%이었다.
- 홍화씨의 식품학적 성분 중 조지방의 지방산 조성을 분석하였다(Table 4). 홍화씨의 조지방 중에 가장 많이 함유되어 있는 지방산은 linoleic acid (C18:2)로 약 79.46%의 비율을 차지하였다. Oleic acid (C18:1)도 약 10.
- 24mg%)을 많이 함유하고 있었다. 홍화씨의 주요 유리당은 fructose가 3.29%이었고, linoleic acid (C18:2)는 약 79.46%의 비율을 차지하여 홍화씨의 조지방 중 가장 많은 것으로 나타났다. 또한, Oleic acid (C18:1)도 약 10.
- 91 mg QE/g으로 나타났다. 홍화씨의 항균 활성은 농도가 증가함에 따라 Staphylococcus aureus,Salmonella typhimurium, Escheria coli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus 및 Clustridium perfringens 균에 대한 항균 효과가 높아지는 것으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과로 볼 때 Staphylococcus aureus, Salmonellatyphimurium, Escheria coli, Candida albicans, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus 및Clustridium perfringens에 대한 홍화씨 추출물의 항균효과는 추출물의 농도가 증가함에 따라 보다 강한 항균효과를 보여 홍화씨 추출물에 함유된 페놀성 물질들에 기인한 것으로 사료된다. 향후, 항균활성에 대한 작용기전 연구 및 식중독 균에 오염되기 쉬운 식품류에 응용연구가 요구된다.
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