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문제 정의
- 또한 Aβ40 및 Aβ42의 분비와 BACE의 단백질 발현을 감소시켰기에 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1 × 106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 24시간 후에 DMSO 또는 PSM 1, 10 ㎍/㎖을 처리하였다.
- 1 × 106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 serum-free DMEM으로 교환하고 16 시간이 경과한 후 DMSO에 용해시킨 PSM 1, 10 ㎍/㎖ 또는 양성대조군인 β -secretase inhibitor III19) 1.5 ㎍/㎖를 처리하였다.
- 5% Tris-tricine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, β-CTF(COOH terminal fragment), sAPPα, BACE1, PS1, NCT 등의 단백질 양상을 분석하였다. 3회 반복 실험에 의해 얻어진 단백질 밴드를 Image J 1.37 software (NIH 제공)에 의해 정량하였으며 actin 밴드를 기준으로 보정하였다.
- 5 × 103 세포를 96-well plate에서 배양하여 DMSO에 용해시킨 PSM을 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 24시간 처리하였다.
- APPswe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA18)를 실시하였다.
- BACE1 및 그에 의한 APP의 대사체인 β-CTF와 α-secretase에 의한 대사체인 sAPPα의 단백질 양상을 분석함으로써 β-secretase의 효소활성을 간접적으로 측정하였다.
- 5 × 103 세포를 96-well plate에서 배양하여 DMSO에 용해시킨 PSM을 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 24시간 처리하였다. CCK-8 용액(Water-soluble tetrazolium salt) 10 ㎕를 첨가하여 2시간 배양한 후, 450 nm에서 Model 680 Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- Aβ (35-40) 특이적 monoclonal antibody 또는 Aβ (38-42) 특이적 polyclonal antibody가 각각 coating된 plate에 100㎕의 시료를 넣고 4℃에서 16시간 동안 반응시키고 7회 세척한 후, HRP conjugation된 Aβ (11-28) 특이적 monoclonal antibody 를 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 9회 세척한 후 tetramethyl benzidine (TMB) 기질액을 넣고 실온에서 30분간 반응시킨 후 정지액 100 ㎕를 첨가하여 450 nm에서 Model 680 Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 단백질 50 ㎍ 을 7%, 14% Tris-glycine SDS-PAGE 및 16.5% Tris-tricine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, β-CTF(COOH terminal fragment), sAPPα, BACE1, PS1, NCT 등의 단백질 양상을 분석하였다.
- 본 연구에서는 전통약물로부터 Aβ의 분비를 감소시키는 약물을 선발하기 위해 국내 자생식물의 추출물을 스크리닝한 결과, 化香樹 수피의 MeOH 추출물이 APP의 변이 유전자인 APPswe 를 발현하는 신경세포주에서 α-secretase의 대사산물인 sAPPα의 세포외 분비를 증가시켰으며 β-secretase의 대사산물인 β-CTF의 단백질 양을 감소시켰다.
- 즉, 음성 대조군(CON)인 DMSO를 처리한 시료의 Aβ의 분비량을 100%로 하여 PSM 처리시 분비량을 백분율로 표시하였다.
대상 데이터
- APP swedish 유전자가 과잉 발현되는 생쥐유래 신경세포주인 Neuro2a (APPswe)를 동경대학의 Iwatsubo 교수로부터 제공받아 5% FBS (Gibco, Grand Island, NY), L-glutamic acid, penicillin/streptomycin, hygromycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagel's Medium (Gibco, Grand Island, NY)과 OPTI MEM (Gibco, Grand Island, NY)의 혼합 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
- 化香樹 (Platycarya strobilacea Sieb. et. Zucc.) 수피의 MeOH 추출물(이하 PSM으로 略함)은 한국 식물추출물은행으로부터 구입하여 일정량의 DMSO에 용해하여 사용하였다. β-secretase inhibitor III (Calbiochem, Darmstadt, Germany), protease inhibitor (Sigma, St.
데이터처리
- 각 실험군(n=3) 간의 유의성 검정은 Student's t-test로 하였으며, P값이 0.05 및 0.01 이하를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- APPswe 세포주에 PSM을 처리한 후 배양액으로 분비된 Aβ의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하여 비교 정량하였다.
- PSM의 APPswe 세포주에 대한 독성을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) assay를 실시하였다. 5 × 103 세포를 96-well plate에서 배양하여 DMSO에 용해시킨 PSM을 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 24시간 처리하였다.
- 단백질 분석은 Western blotting 방법에 의해 수행하였다20). 1 × 106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 24시간 후에 DMSO 또는 PSM 1, 10 ㎍/㎖을 처리하였다.
성능/효과
- PSM은 γ-secretase 복합체의 구성분자인 PS 및 NCT의 단백질 양상에는 영향을 주지 않은 반면, BACE에 의한 대사 물질인 β-CTF의 경우는 PSM의 농도 의존적으로 감소 양상을 보여, DMSO 처리군(CON)에 비해 PSM 10 ㎍/㎖ 농도에서 45.1 ± 2.2%가 감소되었다(Fig. 4A).
- PSM은 농도 의존적으로 BACE1의 단백질 발현을 감소시켜 DMSO 처리군(CON)에 비해 PSM 10 ㎍/㎖ 농도에서 27.3 ± 2.2%가 감소되었다(Fig. 4C).
- 결과에 기술한 바와 같이,PSM은 Aβ 40 및 Aβ42의 분비량을 농도 의존적으로 감소시켰는데, 이는 APP의 대사에 관여하는 β-secretase 또는 γ-secretase의 활성이 저해되었음을 시사한다.
- 더불어 BACE1의 단백질 발현도 β-CTF와 같은 양상으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 또한, PSM 농도 의존적으로 세포내 holo APP의 양은 감소시켰으며 세포외로 분비되는 sAPPα 양은 현저히 증가시켜 DMSO 처리군(CON)에 비해 PSM 10 ㎍/㎖ 농도에서 230.7 ± 10.8%가 증가되었다(Fig. 4B).
- 9%의 세포독성을 보였으나. 본 실험에 사용한 PSM의 농도인 10 ㎍/㎖과 그의 5배인 50 ㎍/㎖ 농도에서의 세포독성은 관찰되지 않았다(Fig 2).
- 이 결과를 통하여 APP의 최종 대사과정에 관여하는 효소 γ-secretase 복합체의 중요한 구성분자인 PS-NTF와 NCT 의 안정성에는 영향이 없으며, 다른 구성분자인 PS1-CTF, PEN2, APH-1 등의 안정성에도 변화가 없음을 추정할 수 있다.
- 이상의 결과로부터 PSM은 BACE1의 단백질 발현을 감소시키는 활성을 갖고 있으며, β -secretase를 저해할 것으로 추정할 수 있다.
- 한편, PSM의 APPswe 세포주에 대한 독성을 관찰하기 위해 CCK assay를 실시한 결과, 100 ㎍/㎖ 농도에서는 9.1 ± 3.9%의 세포독성을 보였으나.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해보면, PSM을 치매 치료제 개발을 위한 β-secretase 저해 후보약물로 응용할 수 있다고 사료된다.
- 향후 化香樹에 의한 Aβ 분비저해활성의 기전을 명확히 규명하기 위해서는 면역형광염색법에 의해 APP 및 관련 분자의 세포내 분포를 확인하고, BACE 및 γ-secretase의 in vitro 효소활성도 측정해야할 것이다.
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