[논문]마 에탄올추출물의 피부 collagen 합성 촉진 및 MMPs 활성 억제효과

김대성; 전병국; 임난영; 문연자; 이영은; 우원홍

마 에탄올추출물의 피부 collagen 합성 촉진 및 MMPs 활성 억제효과
Ethanol Extract of Dioscorea batatas Stimulates Procollagen Production and Reduces UVB-induced MMPs Activity in Skin 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.27 no.2, 2013년, pp.183 - 188

김대성 (원광대학교 한의학전문대학원 한약자원개발학과) , 전병국 (원광대학교 한의학전문대학원 한약자원개발학과) , 임난영 (원광대학교 뷰티디자인학과) , 문연자 (원광대학교 한의과대학 해부학교실) , 이영은 (원광대학교 생활과학대학 식품영양학과) , 우원홍 (원광대학교 한의과대학 해부학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Ultraviolet (UV) B irradiation induces the production of matrix metalloproteinases (MMPs), which are responsible for the degradation or synthesis inhibition of collagenous extracellular matrix in connective tissues, causing skin photoaging. In this study, we examined the inhibitory effect of MMP-1 expression of yam extract in tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$)-stimulated human dermal fibroblast neonatal (HDFn) cell and preventive effect of UVB-induced damage in hairless mice skin. The synthesis of procollagen and the release of MMP-1 in HDFn cells were measured by EIA kit and MMP-1 assay kit, respectively. UVB radiation was applied to the backs of the mice three times a week for 8 weeks. Mice were randomly divided into three groups, and were topical application with the Dioscorea batatas (DB, 6%) or vehicle. Reduction of TNF-${\alpha}$-induced procollagen synthesis was increased by DB (50 ug/ml), which was higher than positive control group (TGF-${\beta}$). Also, pre-treatment of HDFn cells with DB inhibited TNF-${\alpha}$-induced release of MMP-1. In vivo study, we found that preventive effect of DB against UV-induced epidermal thickness. DB suppressed the expression of MMP-3 and MMP-13 induced by UVB irradiation. Our results show that DB have preventive effect of UV-induced skin damage in hairless mice.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

마는 musin을 비롯한 polyphoenol, saponin, tannin, diosgenin, allantoin, uronic acid, chellidonic acid, sitosterol, arginine, yonogenin 등의 생리활성 물질을 포함하고 있다^12-16). Polyphoenol, saponin, tannin 등이 마에 다량 함유되어 있어 항노화 및 보습효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구에서 마 에탄올추출물이 collagenase 활성과 human dermal fibroblast에서 MMP-1 활성 및 procollagen 합성에 미치는 영향을 측정하였다. 또한 광노화 모델로 알려진 hairless mouse에서 UVB에 의해 유도되는 MMPs의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
본 실험의 인체 진피 섬유아세포 배양에서 마 시료는 MMP-1 활성을 억제하였고 procollagen의 합성을 촉진하였다. 따라서 Hairless mice를 이용한 in vivo에서 마 시료가 MMP-3과 MMP-13의 활성을 억제하는지 조사하였다. 실험결과 UVB군은 대조군에 비해 MMP-3의 발현이 6.
Polyphoenol, saponin, tannin 등이 마에 다량 함유되어 있어 항노화 및 보습효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구에서 마 에탄올추출물이 collagenase 활성과 human dermal fibroblast에서 MMP-1 활성 및 procollagen 합성에 미치는 영향을 측정하였다. 또한 광노화 모델로 알려진 hairless mouse에서 UVB에 의해 유도되는 MMPs의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
Procollagen은 아미노 말단과 카르복시 말단에 프로펩티드라는 펩티드염기서열을 포함하고, 프로펩티드는 endopeptidase에 의해 분리된다^27,28). 본 실험에서 마 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 마 시료를 세포에 25, 50 μg/ml 농도로 처리하고 24시간 배양 후 procollagen 양을 조사한 결과는 Fig.
본 실험은 마 에탄올추출물이 피부 광노화에 의한 주름 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 마는 collagenase 활성을 억제하였고, 사람의 진피 섬유아세포(HDFn)에서 MMP-1의 활성 억제 및 procollagen의 합성을 증가시켰다.

제안 방법

Collagenase 활성 억제력 평가 실험은 EnzCheck Gelatinase/Collagenase assay kit (Invitrogen, USA)를, substrate 로는 DQTM gelatins from pig skin, fluorescein conjugate를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 reaction buffer 150 μl, 시료 20 μl, collagenase (10 u/ml) 20 μl, gelatin (100 μg/ml) 10 μl를 가하여 잘 섞어준 후 37℃ 암실에서 1시간 동안 반응 시켰다.
5 mW/cm²로 하였다. UV 조사량은 처음 1주간 60 mJ/cm2, 2주째는 90 mJ/cm², 이 후 8주까지 120 mJ/cm²로 조사하였다.
도포액의 기본 로션은 에탄올, 프로필렌글리콜, 증류수를 각각 3:5:2의 비율로 혼합하여 제조하였다. 대조군의 도포액은 기본 로션으로 실험군의 도포액은 마 시료를 6%의 농도로 기본 로션에 녹여 제조하였다.
도포액의 기본 로션은 에탄올, 프로필렌글리콜, 증류수를 각각 3:5:2의 비율로 혼합하여 제조하였다. 대조군의 도포액은 기본 로션으로 실험군의 도포액은 마 시료를 6%의 농도로 기본 로션에 녹여 제조하였다.
주 6일 일정한 시간에 도포액 50 μl를 무모생쥐의 등 부분에 도포하고 15분 후 UV를 조사하였다. 무모생쥐의 등쪽 피부에 조사한 자외선량을 측정하기 위해 UV meter(Waldmann Co, Germany)를 이용하였으며, 조사량은 20 cm의 거리에서 0.5 mW/cm²로 하였다. UV 조사량은 처음 1주간 60 mJ/cm2, 2주째는 90 mJ/cm², 이 후 8주까지 120 mJ/cm²로 조사하였다.
배양 후 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였다. 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 Procollagen type-Ⅰ C peptide (PIP) EIA kit(Takara)를 사용하여 측정하였다.
본 실험에서는 마 시료가 인체 진피 섬유아세포의 MMP-1 활성에 미치는 영향을 조사하고자 시료를 25, 50 μg/ml 농도로 처리하고 24시간 후 MMP-1의 활성을 측정하였으며, MMP-1의 활성은 TNF- α로 유도하였다.
체중 20±g(6주령)의 암컷 무모쥐(SKH-1 hairless mice)를 오리엔트사로부터 구입하여, 항온항습(22±℃, 50±5% RH)하에서 12시간 싸이클(09:00-21:00)로 명암이 자동 조절되는 동물사육실에서 1주간 적응시켰다. 사료는 마우스 전용사료를 자유 급식하였으며 음수는 2차 D.W를 자유 급이 하였다.
양성대조군으로 TGF-β를 10 ng/ml, 음성대조군으로 TNF-α를 10 ng/ml의 농도로 첨가하였다.
일반 적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고, 6 μm 절편을 잘라 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 실시하여 관찰하였다.
조직준비를 위해 동물을 희생시킨 후 등쪽 피부를 절개하여 filter paper에 부착한 후 10% 중성 포르말린에 고정시켰다. 일반 적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고, 6 μm 절편을 잘라 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 실시하여 관찰하였다.
주 6일 일정한 시간에 도포액 50 μl를 무모생쥐의 등 부분에 도포하고 15분 후 UV를 조사하였다.
배양 후 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였다. 측정은 MMP-1 Biotrack activity Assay Kit(Amersham Bioscience)을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
파라핀 포매된 조직을 6 μm 두께로 잘라 탈파라핀 과정을 거쳐 3% H2O2로 내인성 과산화효소를 억제 하였다.

대상 데이터

구입한 세포를 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin (100 IU/50 g/ml)을 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다.
마 시료는 금마농협(익산시)에서 마(Dioscorea batatas)분말을 구입하여 사용하였다. 마 분말 400 g에 에탄올 4,000 ml를 넣고 실온에서 7일간 추출한 후 여과지에 여과시킨 다음 감압농축하고 동결건조 시켜 분말 형태의 시료 12 g(수득률 3%)을 얻었다.
일반 적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하고, 6 μm 절편을 잘라 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 실시하여 관찰하였다. 면역 조직화학은 Histostain^Ⓡ-SP Broad Spectrum (AEC) kit와 1차 항체 goat polyclonal IgG MMP-3, rabbit polyclonal IgG MMP-13은 Santa Cruz(CA, USA)사 제품을 사용하였다. 파라핀 포매된 조직을 6 μm 두께로 잘라 탈파라핀 과정을 거쳐 3% H2O2로 내인성 과산화효소를 억제 하였다.
세포는 HDFn 세포를 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 사용하였다. 구입한 세포를 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin (100 IU/50 g/ml)을 첨가하여 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 배양하였다.
체중 20±g(6주령)의 암컷 무모쥐(SKH-1 hairless mice)를 오리엔트사로부터 구입하여, 항온항습(22±℃, 50±5% RH)하에서 12시간 싸이클(09:00-21:00)로 명암이 자동 조절되는 동물사육실에서 1주간 적응시켰다.

데이터처리

실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였고 0.05 이하일 경우 *를, 0.01 이하일 경우 **를 표시하여 유의성을 나타내었다.

이론/모형

세포생존율 측정은 Mosmann의 방법¹⁷⁾에 의하여 실시하였다. 24-well 배양 용기에 HDFn 세포를 2×10⁴ 개씩 분주하고 24시간 배양 후 마 에탄올추출물을 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 하에서 24시간 배양하였다.

성능/효과

50 μg/ml 농도에서는 대조군에 비해 procollagen 합성이 40% 증가되었고, 양성대조군인 TGF-β 처리군 보다 6% 높게 증가되었다(Fig. 3).
7배 증가되었으며 마 시료의 전처리군은 UVB군에 비해 MMP-3의 발현이 약 2/3 감소되었다. MMP-13의 경우 UVB에 의해 약 4.7배 증가하였고, 마 시료 전처리군은 UVB군에 비하여 약 1/3 가량 MMP-13의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이상의 실험결과 마 시료는 Hairless mice에서 UVB 에 의한 피부 표피층의 손상을 억제하고, MMP-3, 13 발현을 억제한 것을 알 수 있었으며 이는 마 에탄올추출물이 자외선에 의한 피부 손상을 예방하는 효과가 있을 것으로 사료된다.
마는 collagenase 활성을 억제하였고, 사람의 진피 섬유아세포(HDFn)에서 MMP-1의 활성 억제 및 procollagen의 합성을 증가시켰다. 또한 hairless mice에 마를 국소 도포한 결과, UVB에 의해 비후된 표피 두께가 감소되었고, MMP-3, -13의 활성이 현저히 감소되었다. 이상의 결과 마는 피부의 collagen 생성을 촉진하고 MMPs의 활성을 억제함으로서 UVB로 인한 주름생성에 예방 효과가 있을 것으로 사료 된다.
본 실험에서 마 시료가 collagenase 활성에 미치는 영향을 측정한 결과, 5, 10, 15, 20, 25 μg/ml 농도에서 각각 8%, 18%, 25%, 30%, 33%로 collagenase의 활성을 억제하였으며, 억제효과는 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 1).
설치류에서는 MMP-13이 MMP-1의 기능을 하고 있다³⁵⁾. 본 실험의 인체 진피 섬유아세포 배양에서 마 시료는 MMP-1 활성을 억제하였고 procollagen의 합성을 촉진하였다. 따라서 Hairless mice를 이용한 in vivo에서 마 시료가 MMP-3과 MMP-13의 활성을 억제하는지 조사하였다.
실험 결과, MMP-1 활성이 대조군은 4.51 ng/ml, TNF-α 처리군은 14.56 ng/ml로 TNF-α에 의해 MMP-1 활성이 증가하였다.
실험 결과, TNF-α군의 경우 procollagen 양은 대조군에 비해 약 22% 감소하였으며, procollagen 생성을 촉진시키는 것으로 알려진 TGF-β29)군의 경우 대조군에 비해 34% 증가하였다.
따라서 Hairless mice를 이용한 in vivo에서 마 시료가 MMP-3과 MMP-13의 활성을 억제하는지 조사하였다. 실험결과 UVB군은 대조군에 비해 MMP-3의 발현이 6.7배 증가되었으며 마 시료의 전처리군은 UVB군에 비해 MMP-3의 발현이 약 2/3 감소되었다. MMP-13의 경우 UVB에 의해 약 4.
이상의 결과 인체 진피 섬유아세포에서 TNF-α에 의해 촉진된 MMP-1의 활성을 마 시료는 효과적으로 억제시켰고, 감소된 procollagen 합성은 촉진시켰음을 확인하였다.
5). 이상의 실험결과 마 시료는 Hairless mice에서 UVB 에 의한 피부 표피층의 손상을 억제하고, MMP-3, 13 발현을 억제한 것을 알 수 있었으며 이는 마 에탄올추출물이 자외선에 의한 피부 손상을 예방하는 효과가 있을 것으로 사료된다.
정상 피부 조직인 경우 피하지방층이 널리 분포하지만 UV 노출 시 교원섬유의 분포가 다양하게 관찰되는 특징이 있다^30,31). 피부 조직의 병리학적 관찰 결과, 대조군과 UV군을 비교해 보았을 때 UV 조사에 의해 약 3배 정도의 표피 두께가 증가한 것을 확인 할 수 있었으며, 마 시료군은 UV군에 비해 표피 두께가 약 절반 가량 줄어든 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4). 지속적인 자외선에 노출 시 각질층은 표피를 자외선으로부터 보호하기 위하여 두꺼워지는 현상이 나타나게 되는데 이는 피부가 자외선으로부터 손상을 받았다는 것을 의미하며 마 시료 처리 시 표피층의 두께가 줄어든 것은 자외선으로부터 피부 손상을 감소시키는 예방효과가 있음을 의미한다.
한편 시료와 TNF-α를 병용 처리한 경우 MMP-1의 활성은 25, 50 μg/ml 농도에서 각각 9.26, 5.27 ng/ml 였고, 시료에 의해 TNF-α에 의해 증가되었던 MMP-1 활성이 각각 36%, 64%로 감소되었다(Fig. 2).

후속연구

또한 hairless mice에 마를 국소 도포한 결과, UVB에 의해 비후된 표피 두께가 감소되었고, MMP-3, -13의 활성이 현저히 감소되었다. 이상의 결과 마는 피부의 collagen 생성을 촉진하고 MMPs의 활성을 억제함으로서 UVB로 인한 주름생성에 예방 효과가 있을 것으로 사료 된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한방에서 마는 어디에 사용되는가?	batatas)로 분류되는 종류가 주로 재배되며, 익산지역에서는 ‘서동마’인 마(Dioscorea aimadoimo)를 주로 재배하고 있다10,11). 한방에서는 산약이라 하고 맛은 달고 성질은 平하며, 비장(脾臟)이 허약하여 나는 설사(泄瀉), 이질(痢疾), 노점(癆漸)으로 인한 해수(咳嗽), 유정(遺精), 대하증(帶下症), 소변빈삭(小便頻數)의 치료에 사용되고 민간에서는 자양강장 및 피부미용에 이용되고 있다. 마는 musin을 비롯한 polyphoenol, saponin, tannin, diosgenin, allantoin, uronic acid, chellidonic acid, sitosterol, arginine, yonogenin 등의 생리활성 물질을 포함하고 있다12-16).
	피부는 어떻게 구성되어있는가?	피부는 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 있으며 collagen은 진피층의 80-90%를 차지하고 있는 주요 구조 단백질로 type-Ⅰcollagen 이 대부분을 차지하며 type-Ⅱ collagen, fibronectin 등으로 구성되어 있다. 또한 collagen은 섬유아세포의 작용에 의해 합성되며 자외선으로부터 피부 손상을 막아주고 수분 균형을 유지하여 주름 예방 및 탄력적인 피부를 유지하는데 필수적인 요소이기 때문에 collagen의 감소는 피부노화 및 주름생성과 매우 밀접한 관계를 가지고 있다5,6).
	마에 포함된 생리활성 물질은 무엇이 있는가?	한방에서는 산약이라 하고 맛은 달고 성질은 平하며, 비장(脾臟)이 허약하여 나는 설사(泄瀉), 이질(痢疾), 노점(癆漸)으로 인한 해수(咳嗽), 유정(遺精), 대하증(帶下症), 소변빈삭(小便頻數)의 치료에 사용되고 민간에서는 자양강장 및 피부미용에 이용되고 있다. 마는 musin을 비롯한 polyphoenol, saponin, tannin, diosgenin, allantoin, uronic acid, chellidonic acid, sitosterol, arginine, yonogenin 등의 생리활성 물질을 포함하고 있다12-16). Polyphoenol, saponin, tannin 등이 마에 다량 함유되어 있어 항노화 및 보습효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구에서 마 에탄올추출물이 collagenase 활성과 human dermal fibroblast에서 MMP-1 활성 및 procollagen 합성에 미치는 영향을 측정하였다.

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Mariani, T.J., Sandefur, S., Roby, J.D., Pierce, R.A. Collagenase-3 induction in rat lung fibroblasts requires the combined effects of tumor necrosis factor-alpha and 12-lipoxygenase metabolites: a model of macrophage-induced, fibroblast-driven extracellular matrix remodeling during inflammatory lung injury. Mol Biol Cell 9(6):1411-1424, 1998.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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