[논문]부채마 에탄올 추출물의 아토피 피부염 억제 효과

도영복; 송영순

doi:10.14400/jdc.2019.17.8.257

부채마 에탄올 추출물의 아토피 피부염 억제 효과
Suppressing Effects of Ethanol Extract from Dioscoreae Rhizoma on atope Dermatitis 원문보기

디지털융복합연구 = Journal of digital convergence, v.17 no.8, 2019년, pp.257 - 264

도영복 (대전대학교 보건의료대학원) , 송영순 (동방문화대학원대학교 약용작물학)

초록
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본 연구는 부채마 70% 에탄올 추출물(DR)이 RBL-2H3 마스트 세포에서 항원에 의한 세포활성의 영향과 BALB/c 쥐에서 dinitrofluorobenzene에 의해 유도된 마스트 세포-매개 알레르기 접촉성피부염에 미치는 영향을 조사했다. DNP-HSA 항원과 Anti-DNP IgE 항체에 의해 활성 된 RBL-2H3 세포에서 에탄올 추출물은 급성 항원반응 표지인 ${\beta}$-hexosaminidase 분비와 히스타민 등을 억제하였고, 후기 항원반응 표지인 IL-4와 $TNF-{\alpha}$ 생성을 억압하였다. DNFB-유도 접촉성 알러지성 피부염 동물 모델에서 에탄올 추출물 처리는 귀 부기를 감소시키고 혈청 히스타민과 IL-4 분비를 억제시켰으며, DR 처리는 피부염 유발 부분에서 마스트 세포 유입을 효과적으로 방지하였다. 이러한 결과로, 에탄올 추출물은 아토피 피부염과 같은 마스트 세포-매개 알러지성 질병의 치료제로 사용할 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate the effect of 70% ethanol extract (DR) on the mast cell-mediated allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in BALB / c mice, which affects the cell activity by antigen in RBL-2H3 mast cells Respectively. The ethanol extracts of RBL-2H3 cells activated by DNP-HSA and anti-DNP IgE antibodies inhibited the secretion of ${\beta}$-hexosaminidase, histamine, and IL-4 and $TNF-{\alpha}$ Production was suppressed. In the DNFB-induced contact allergic dermatitis animal model, treatment with ethanol extract reduced ear swelling and inhibited serum histamine and IL-4 secretion, and DR treatment effectively prevented mast cell infiltration in dermatitis-induced areas. As a result, the ethanol extract may be used as a therapeutic agent for mast cell-mediated allergic diseases such as atopic dermatitis.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Effects of DR on cell viability.
그림 Fig. 2. Effects of DR on β-hexosaminidase release.
그림 Fig. 3. Effects of DR on histamine release.
그림 Fig. 4. Effects of DR on IL-4 release.
그림 Fig. 5. Effects of DR on TNF-α release.
그림 Fig. 6. Effects of DR on clinical symptom of ear swelling.
그림 Fig. 7. Effects of DR on DNFB-induced ear swelling.
그림 Fig. 8. Effects of DR on total serum IgE.

AI 본문요약
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문제 정의

부채마 70% 에탄올 추출물로 아토피 피부염증 예방의 효과를 조사하기 위해, 1차로 에탄올 추출물이 RBL-2H3 마스트세포 활성에 어떠한 영향을 미치는가를 조사했다. 에탄올 추출물은 독성 없는 농도 Fig.
항원의 특이적인 IgE는 mast cell의 Fcε 수용 체와 결합해서 특정 항원에 대한 조기 allergy 반응과 후기 allergy반응을 유도한다. 이러한 사실을 고려할 때, 접촉성 피부염 동물실험에서 DR 처리가 혈청 IgE 생성에 의해 어떤 영향을 미치는가를 조사하였다. 犧牲日에 접촉성 피부염 동물실험은 채취한 혈액 속의 총 IgE 양을 관찰한 결과, 정상 군에 비해 DNFB/DW 대조군은 혈청 IgE 농도가 높이 나타났다.
이에 본 연구는 부채마의 70%를 에탄올 추출물의 아토피 피부염 예방 효과에 조사를 위한, 1차적인 에탄올 추출물처리가 RBL-2H3 염증의 활성화에 어떠한 영향을 미치는가 조사했다. 결과적으로, 귀 부종의 IL-4 농도와 히스타민 농도의 조직병리학적 결과를 종합했을 때 부채마 추출물은 mast cell의 과도한 활성에 따라 유발되는 알러지성 피부질병의 예방효과가 있다고 관련되어지며, 향후 부채마의 추출물은 mast cell에 대한 활성억제 약물로서 개발될 수 있을 것으로 생각한다.
그러나 장기간 사용 시 피부위축이나 성장지연의 부작용 문제로 새로운 아토피피부염의 치료제 및 부작용이 적은 천연물 개발에 관심이 많은 추세로 가고 있다. 이에 연구는 항염증 효능을 갖는 부채마가 아토피 피부염에 효과가 있을 것으로 보고, 부채마 70% 에탄올 추출물의 마스트 세포 활성에 따른 효과를 관찰하고, 실험동물 BALB/c 생쥐의 DNFB를 귀에 감작시킨 후 아토피피부염을 유발시켜, 부채마 추출물 효능을 조사 및 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고한다.

가설 설정

부채마가 항염증 효용이 있다는 것을 착안하고, 마스트세포-매개 피부염 증상 및 조직병리학적 관점을 증진시켜 줄 수 있을 것이라는 가설을 세우고 본 연구를 시행했다. 부채마는 여러해살이 넝쿨식물로, 뿌리와 줄기는 가로로 뻗어 있는 원기둥 모양의 황갈색이며, 잎은 호생 (alternate)하고 심장형이다.

제안 방법

4개 군으로 실험동물을 분류했으며, 오른 쪽 귀에 DNFB 도포 하지 않은 정상 군, DNFB/DW 실험 군, DNFB/Dex양성대조 군과 DR를 도포한 실험 군 등으로 분류하고, 실험 군 산정을 3R의 원칙에 준하여 최소수를 사용했다.
BALB/c 생쥐를 7일간 순화하여 등 부분을 제모하고 3일간 적응시켜, DNFB는 acetone과 olive oil을 4:1 비율로 혼합용액에 1.5% 농도를 용해한 후 4일째는 날 등 부분에 0.5% DNFB를 20 μL씩 1일 1회(4일간) 피부에 도포하고 감작을 유도했다.
DNFB를 도포 하고, 피부조직의 상태 측정을 위해 쥐의 양쪽 귀 두께를 측정했다. 두께는 vernier calipers를 이용한 귀 두께는 1, 3, 12, 24, 48시간 간격으로 양쪽 귀 두께 상태를 측정했다.
DNFB를 처리한 대조군은 처리하지 않은 정상 군 귀에 비하여 짓무름, 홍반, 피부건조, 혈종 등에 의해 변화를 확인했다. 이와 같은 증상들을 종합하여 점수로 비교해 본 결과, DNFB/DW 대조군에 비하여 DW 대조군에 비하여 실험 군 DNFB/DR 군과 DNFB/Dex 실험 군에서 육안점수는 유의적으로 감소했다(Fig.
DR 및 Dex를 3일 동안 귀에 도포하고, DNFB를 귀에 20 μL 도포하고 자극하여 접촉성 피부염을 유발시켰다.
DR는 RBL-2H3 세포의 성장과 독성의 영향이 미치지 않는 것으로 확인 되었으며, RBL-2H3 세포의 RBL-2H3 세포 의 모든 실험에서는 0, 10, 100, 200 μg/mL의 농도로 DR를 처리했다.
Ear swelling 측정을 반영하기 위해 DNFB를 자극했다. 귀 두께가 최고치를 도달할 때 부검을 실시하고 대동 맥에서 혈액 채취하여 1시간 동안 상온에서 응고시켜, 원심분리기에서 3,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 후 얻어진 혈청을 냉동 보관했다.
IgE ELISA kit로 실험동물 쥐에서 채취하여 냉동 보관한 혈청으로 IgE 농도를 측정하고, IgE 용액과 혈청50 μL씩 첨가하여 2시간 반응시켜, anti-IgE 항체용액 50 μL씩 2시간 반응시켰다.
RBL-2H3 세포 48 well plate 5 × 105 cell/mL 농도를 분주한 다음, anti-DNP IgE(30 ng/mL)로 감작하여, 37℃ 5% CO2 배양기로 24시간 동안 배양하였으며, 농도에 따라 DNP-BSA(100 ng/mL)를 첨가한 후 24시간 배양시켰다.
RBL-2H3 세포에서 과립감소의 지표로 사용되는 β -hexosaminidase 분비를 측정하고 DR처리가 mast cell 활성에 어떠한 영향을 미치는가에 조사하였다.
RBL-2H3 세포의 생존율이 DR처리에 영향을 미치는지 조사하였다(Fig.1 참고). RBL-2H3 세포 0, 10, 100, 200, 400 μg/mL까지 24시간 동안 DR를 처리하지 못한 대조군과 유의적인 차이를 볼 수 없었다.
6에 DNFB 피부접촉에 의해 제작된 알레르기성 접촉성 피부염은 실험동물의 귀 병변을 보였다. 각 실험 군 별로 DNFB의 시료를 처리하여 오른쪽 귀 부분을 관찰하고, 형태학적 변화를 확인했다.
귀 두께가 최고치에 도달한 시간에 부검을 실시하기 위해 ear swelling 측정결과를 반영했고 귀를 적출하여 포르말린 10%를 7일간 고정시킨 다음, 파라핀 블록을 만들고 4 μm 두께 조직을 절편하고 TB 염색과 H&E 염색 실시 후, 병변 유무와 마스트세포를 광학현미경으로 확인했다.
농도에 대한 시료를 처리하고, 5mg/mL MTT 용액을 100μL을 첨가하여 24시간 동안 배양한 다음 다시 30분을 추가 하고, 포르마잔 생성물 DMSO를 통한 용해액은 96-well plate의 일정량을 첨가하고 흡수되는 흡광도 값은 540nm 파장에서 측정 했다.
5g (15%)을 수득했다. 동물실험에 사용된 세포실험의 각 시료는 자주 빛 포르마잔 생성물질로 변화하는 MTT 환원을 기반으로 측정했다.
DNFB를 도포 하고, 피부조직의 상태 측정을 위해 쥐의 양쪽 귀 두께를 측정했다. 두께는 vernier calipers를 이용한 귀 두께는 1, 3, 12, 24, 48시간 간격으로 양쪽 귀 두께 상태를 측정했다.
또한, RBL-2H3 세포는DR 처리에서 IL-4 mRNA 생성에 대하여 효과를 조사하고, DR의 IL-4 생성과 억제에 대한 효과를 검증했다(Fig. 4.B 참고).
또한, RBL-2H3 세포의 추출물처리가 TNF-α mRNA 생성에 의해 미치는 효과를 조사하고, DR의 TNF-α 생성과 억제에 따른 효과를 검증했다 (Fig. 5 참고).
부채마 70%는 에탄올 추출물의 알레르기성 피부의 원인으로 알려진 mast cell의 과도한 활성조절 가능성을 조사하고, 실험동물 mast cell의 매개 질병에 대한 효능도를 조사 후 이와 같은 결과를 얻었다.
세포 RBL-2H3는 항체-항원의 자극에 의존하는 TNF-α 분비에 대하여 DR 처리 효과를 조사했다.
스테로이드 약물 농도의 Dex는 문헌을 참고하여 100 nM과 양성 대조군으로 이용하였다. 100 nM의 Dex는 RBL-2H3의 세포에 처리하였고 세포독성은 나타나지 않았다.
실험은 프로토콜에 의해 진행하였고, microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정한 후 IL-4와 TNF-α의 농도를 계산했다.
알레르기 즉시반응 지표인 세포외 방출에 대하여 억압 효과를 살펴보기 위해 β-Hexosaminidase 분비를 측정했다.
즉시반응 알레르기 지표인 세포외배출작용의 억제 효과 분석을 위하여 히스타민 ELISA kit(Abnova, USA)을 사용하고 공급자에 대한 실험 프로토콜 따라 측정했다.
건조한 부채마 뿌리를 분쇄하여 분말 30g의 에탄올 70g과 혼합한 후, 2시간 동안 80℃의 단회 환류냉각으로 추출했다. 질적여과지(qualitative filter paper, ADVANTEC, Japan)로 여과한 추출물을 감압농축기 (N-100 rotary evapor ator, EYELA, Japan)로 농축했으며, 초저온 동결기로 건조 (PVTFD-10R, Ilshin Lab Co. Ltd., Korea)시킨 부채마 70% 에탄올 추출물 4.5g (15%)을 수득했다. 동물실험에 사용된 세포실험의 각 시료는 자주 빛 포르마잔 생성물질로 변화하는 MTT 환원을 기반으로 측정했다.

대상 데이터

실험관외(in vitro) mast cell model로 사용한 RBL-2H3 세포는 한국 세포 주 은행에서 분양 및 10% 열처리하여, FBS와 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 DMEM 배지에서 분양받아, 세포는 37℃, 5% CO2 조건 에서 과밀도 상태를 해결하기 위하여, 0.05% trypsin-EDTA solution을 처리한 후 세포를 부유시킨 다음 계대 배양했다.
실험에 사용된 anti-dinitropheny1, dexameth asone, Dulbecco's modification Eagleme dium(DMEM), DNP-HSA(human serum albumin), trypsin-EDTA, tetrazolium bromide salt(MTT), penicillin, gE (anti-DNP IgE), hematoxylin/ eosin (H&E), toluidine blue, dimethylsulfox ide(DMSO), Dulbecco's modification Eagle me dium (DMEM), streptomycin 및 DNF B는 Sigma-Aldrich BRL(USA)로부터 구입한 후 사용했다.
실험에 사용한 5주령 100 마리 수컷 BALB/c 생쥐를 샘타 코에서 구입했으며, 1주일간 순화기간을 거쳐 12시간 간격으로 명암조절 및 습도와 온도 23 ± 2℃와 50∼ 60%를 유지했으며, 평균 무게는 20.22 ± 1.54g이다.

데이터처리

실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타냈고, one-way ANOVA로 분석하였으며, 비교는 Prism software(Graphpad Software, USA)를 사용했으며, 사후 검정은 Bonferroni multiple range t-test를 이용한 후 통계적인 유의성은 P < 0.05로 정했다.

이론/모형

밀집 세포의 미토콘드리아 탈수소화 효소에 의한 RBL-2H3 세포의 독성은 자주 빛 포르마잔 생성물로 변화하는 MTT 분석법을 이용한 후 측정했다.

성능/효과

7은 DNFB에 의한 알레르기성 접촉성 피부염이 실험동물을 통하여 귀 부종을 나타낸 것이다. DNFB/DW 대조군은 DNFB 도포 전과 DNFB 도포 후 를 48시간 비교했을 때 ,귀 두께는 현저하게 증가했으며, DNFB/DR 실험 군을 DNFB/Dex 양성 대조군과 DNFB/DW 대조군을 비교 했을 때 귀 두께가 유의하게도 감소했다. 이 같은 결과는 조직병리학적 소견과도 일치했다(Fig.
이러한 사실을 고려할 때, 접촉성 피부염 동물실험에서 DR 처리가 혈청 IgE 생성에 의해 어떤 영향을 미치는가를 조사하였다. 犧牲日에 접촉성 피부염 동물실험은 채취한 혈액 속의 총 IgE 양을 관찰한 결과, 정상 군에 비해 DNFB/DW 대조군은 혈청 IgE 농도가 높이 나타났다. 이와 같은 혈청 IgE 농도는 DNFB/DW 대조군에 비해, DNFB/Dex 양성 대조군이 유의하게 감소되었다.
결론적으로 혈액 IL-4 농도는 비정상적으로 상승할 수 있을 것이다. 이 같은 점을 고려할 때, 犧牲日의 접촉성 피부염 실험에 채취한 혈액에서 IL-4 농도를 조사하여, 정상군보다 DNFB/DW 대조군은 혈청 IL-4 농도가 높게 나타났다.
다시 말해, 정상군은 이상 소견이 발견되지 않았고 DNFB/DW 대조군에서만 특이한 면역세포, 급성부종 및 浸潤에 의하여 해면화(spongiosis)와 유사한 중등도 이상에서의 피부염 증상이 발견되었으며, DNFB/DR 실험 군은 DNFB/Dex 양성 대조군과 DNFB/DW 대조군을 비교했을 때, 피부염 증상은 개선되어졌다 (Fig. 7B 참고).
셋째, 부채마는 귀 부종을 억제했으며, 넷째, 부채마는 mast cell을 포함한 과립세포에서 유래된 것으로 추정하여 혈액의 히스타민 농도와 IL-4 생성을 유의하게 감소시켰고, 다섯째, TB 및 H&E 염색결과 세포 악화 정도나 부분 유입은 부채마에 따라 감소되었다.
에탄올 추출물은 독성 없는 농도 Fig. 1에서 항체-항원 반응에 의하여 활성 된 RBL-2H3 마스트포의 조기 면역반응인 과립감소 및 히스타민 분비를 효과적으로 억압하였고 Fig. 2와 Fig. 3에서 볼 수 있듯이 마스트 세포의 후기 면역 과민반응인 염증성 사이토카인(IL-4 및 TNF-α) 분비를 억압했다.
이 같은 연구결과는 70%의 에탄올 추출물에서 mast cell의 과도한 활성과 아토피피부염증 개선효과가 있음을 제시했다.
결론적으로 혈액 IL-4 농도는 비정상적으로 상승할 수 있을 것이다. 이 같은 점을 고려할 때, 犧牲日의 접촉성 피부염 실험에 채취한 혈액에서 IL-4 농도를 조사하여, 정상군보다 DNFB/DW 대조군은 혈청 IL-4 농도가 높게 나타났다.
DNFB를 처리한 대조군은 처리하지 않은 정상 군 귀에 비하여 짓무름, 홍반, 피부건조, 혈종 등에 의해 변화를 확인했다. 이와 같은 증상들을 종합하여 점수로 비교해 본 결과, DNFB/DW 대조군에 비하여 DW 대조군에 비하여 실험 군 DNFB/DR 군과 DNFB/Dex 실험 군에서 육안점수는 유의적으로 감소했다(Fig. 6 참고).
犧牲日에 접촉성 피부염 동물실험은 채취한 혈액 속의 총 IgE 양을 관찰한 결과, 정상 군에 비해 DNFB/DW 대조군은 혈청 IgE 농도가 높이 나타났다. 이와 같은 혈청 IgE 농도는 DNFB/DW 대조군에 비해, DNFB/Dex 양성 대조군이 유의하게 감소되었다. 하지만, DNFB/DR 실험 군에서는 별다른 차이가 나타나지 않았다(Fig.
Anti-DNP-IgE 항체에 감작한 RBL-2H3 세포는 DNP-HSA 항원의 반응에 의해 히스타민 분비가 현저히 증가했다. 이와 같은 히스타민 증가는 DR 처리에 의하여 농도는 의존적으로 감소하였으며, 양성 대조 약물 또한 Dex에 의하여 유의하게도 감소하였다(Fig. 3 참고).
DNFB를 이용한 접촉성 피부염 실험동물에서 볼 수 있는 침윤된 mast cell은 조기 allergy반응에서 세포외 배출 과정을 거쳐 많은 양의 히스타민을 분비할 수 있으며, 그로인한 혈액의 히스타민 농도는 비정상적으로 상승될 것이다. 이점을 고려해볼 때 犧牲日의 접촉성 피부염 실험은 혈액의 히스타민 농도를 조사했으며, DNFB/DW 는 정상군보다 대조군의 혈청 히스타민 농도가 높이 나타났다.
첫째, RBL-2H3 mast cell에서 부채마는 세포독성이 보이지 않는 농도에서 mast cell의 조기 allergen 반응의 지표인 β-hexosaminidase 히스타민 농도를 의존적으로 억제했으며, 둘째, 부채마는 후기 allergen 반응의 지표인 IL-4와 TNF-α의 분비 농도에 따라 의존적으로 감소시켰다.

후속연구

이에 본 연구는 부채마의 70%를 에탄올 추출물의 아토피 피부염 예방 효과에 조사를 위한, 1차적인 에탄올 추출물처리가 RBL-2H3 염증의 활성화에 어떠한 영향을 미치는가 조사했다. 결과적으로, 귀 부종의 IL-4 농도와 히스타민 농도의 조직병리학적 결과를 종합했을 때 부채마 추출물은 mast cell의 과도한 활성에 따라 유발되는 알러지성 피부질병의 예방효과가 있다고 관련되어지며, 향후 부채마의 추출물은 mast cell에 대한 활성억제 약물로서 개발될 수 있을 것으로 생각한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	부채마의 특징은?	부채마(Dioscoreae Rhizoma)는 마과의 넝쿨 식물 및 여러해살이풀로서 국화 마, 단풍마의 根莖을 약재로 사용하며, 性味는 苦, 溫, 甘이고, 歸經은 肺, 肝, 腎과학질, 활혈통락, 거풍제습, 진해, 천식억제, 지해거담 등의 효능이 있다[1].
	아토피 증상은 어떻게 나타나는가?	인간의 면역계는 특정 항원에 의해 비정상적으로 반응하여 상해를 유발시키는 질환을 아토피(atopy)라 말하며, 여기에는 알레르기성 비염과 천식, 아토피 피부염 등이 있다[3,5]. 아토피 증상으로는 아토피 피부염이 첫 번째 증상으로 나타나며, 뒤를 이어 천식과 알레르기성 비염 순으로 나타날 수 있다[5-8].
	부채마의 약리작용은 무엇이 있나?	약리작용으로는 心筋肉의 혈류량 증가 및 항산화와 혈압, 콜레스테롤 등을 강하시키며, 피부 발진과 염증에도 사용한다. 또한 쥐의 체액 및 세포면역을 억압시키며 대식세포의 탐식능력 등을 증강시킨다[2].

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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