[논문]점액세균 Myxococcus stipitatus KYC4013에 의한 생리활성물질 생산

안동주; 박수현; 이종석; 조경연

doi:10.4014/kjmb.1403.03003

점액세균 Myxococcus stipitatus KYC4013에 의한 생리활성물질 생산
Production of Bioactive Substances by a Myxobacterium Myxococcus stipitatus KYC4013 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.42 no.4, 2014년, pp.331 - 338

안동주 (호서대학교 생명공학과) , 박수현 (호서대학교 생명공학과) , 이종석 (경기과학기술진흥원 경기바이오센터) , 조경연 (호서대학교 생명공학과)

초록
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국내 분리 Myxococcus 속 점액세균 207 균주들 중 가장 높은 항진균 활성을 보인 M. stipitatus KYC4013 균주의 배양 추출물을 고분해능 LC-MS로 비교 분석한 결과 melithiazol 유도체로 추정되는 5개 항진균 물질과 phenalamide 유도체로 추정되는 3개 이차대사산물을 생산하고 있는 것으로 나타났다. Melithiazol 유도체 추정 물질들은 CYS 배지에서 가장 잘 생산되었으며, phenalamide 유도체 추정 물질들은 VY3 배지에서 가장 잘 생산되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Myxococcus stipitatus KYC4013 extract exhibited the most potent antifungal activity among the extracts of 207 Myxococcus strains isolated in Korea. High-resolution LC-MS analysis revealed that M. stipitatus KYC4013 produces five antifungal substances and three other secondary metabolites that were predicted to be melithiazol and phenalamide derivatives, respectively. The putative melithiazol derivatives were best produced in CYS medium and the putative phenalamide derivatives were best produced in VY3 medium.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

stipitatus에 속한 균주들이 다른 Myxococcus 종 균주들에 비해 강한 활성을 보이는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 M. stipitatus 균주들의 배양추출물을 대상으로 HPLC 분석을 실시하여 항진균 활성을 보이는 물질피크를 찾고자 하였다. 46균주들의 배양추출물을 용리조건1로 분석하였을 때 가장 강한 항진균 활성을 보인 KYC4013 균주의 배양추출물은 23-25분 부근에서 6개의 피크를 보였다(Table 1, Fig.
본 연구에서는 국내에서 분리한 Myxococcus 속 균주들을 대상으로 배양추출물을 제조하여 항미생물 활성물질 생산 균주들을 선별하였으며, 이 중 강력한 항진균 물질을 생산하는 M. stipitatus KYC4013을 대상으로 이 균주가 생산하는 생리활성물질을 분석하고 생산 특성을 조사하였다.

제안 방법

albicans가 각각 도말된 평판배지 위에 배양추출물을 흡수시킨 6 mm 종이디스크를 올려놓았다. 2일간 배양한 후, 생장저지환의 지름을 측정하여 항미생물 활성을 조사하였다.
C. albicans가 각각 도말된 평판배지 위에 배양추출물을 흡수시킨 6 mm 종이디스크를 올려놓았다. 2일간 배양한 후, 생장저지환의 지름을 측정하여 항미생물 활성을 조사하였다.
13개의 유도체가 알려져 있는데, 국내에서는 Ahn 등이 Myxococcus sp. JW154로부터 melithiazol F를 분리하여 식물병원균에 대한 in vivo 활성을 조사하였다[1]. 질량분석 결과 외에도 KYC4013 배양추출물의 HPLC 분석에서 검출된 S1, S2, S7, S8, S9 피크 분획의 UV 스펙트럼이 melithiazol의 UV 스펙트럼과 유사하며 항진균 활성을 갖는 것으로 보아 이들 다섯 피크 물질들은 모두 melithiazol의 유도체인 것으로 사료된다.
일반적인 점액세균 균주들의 배양추출물 분석을 위해서는 20분간 5-100% B 용매 기울기, 20-25분간 100% B 용매, 25-30분간 5% B 용매로 용리하였다(용리조건1). M. stipitatus KYC4013 균주가 생산하는 항진균 물질들의 분석을 위해서는 10분간 5-60% B 용매 기울기, 10-40분간 60% B 용매, 40-60분간 60-100% B 용매 기울기, 그리고 60-70분에는 100% B 용매로 용리하였다(용리조건2). 용리액은 photo diode array (PAD) 검출기를 사용하여 검출하였다.
S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들이 모두 동일한 항진균 활성을 보이므로 PDA 검출기로 얻은 각 피크의 UV 스펙트럼을 비교 분석하여 유도체일 가능성을 조사하여 보았다. 그 결과 S1, S2, S7, S8, S9 피크 분획 모두가 240 nm와 310 nm 부근에서 최대 흡광을 보여 스펙트럼이 서로 유사하였다(Fig.
Zorbax SB-C18 칼럼(4.6 × 150 mm, 5 μm)을 장착한 Agilent 1260 VL Infinity Series HPLC 시스템을 사용하였다(Agilent Technologies, USA).
배지에 따른 물질생산 특성을 조사하기 위하여 M. stipitatus KYC4013 균주를 VY3, CY, CYE, CF, CYS, CYC, CYG 배지에서 7일 동안 배양한 뒤, 추출물을 제조하여 생리활성물질 생산 양상을 분석하였다. S1, S2, S7, S8, S9 피크물질은 CYS 배지에서 가장 많이 생산된 반면 S4, S5, S6 피크물질은 VY3 배지에서 높은 생산을 보였다(Fig.
stipitatus KYC4013 균주가 생산하는 항진균 물질들의 분석을 위해서는 10분간 5-60% B 용매 기울기, 10-40분간 60% B 용매, 40-60분간 60-100% B 용매 기울기, 그리고 60-70분에는 100% B 용매로 용리하였다(용리조건2). 용리액은 photo diode array (PAD) 검출기를 사용하여 검출하였다.
용리조건1을 사용한 HPLC 분석에서 6개의 피크가 서로 가깝게 존재하므로 KYC4013 균주의 배양추출물을 용리조건2로 분석하여 보았다. 그 결과 6개의 피크들이 43.
7 μm)을 장착한 Accela UHPLC(Thermo Scientific, USA)와 LTQ-Orbitrap XL 고분해능 질량분석기(Thermo Scientific, USA)를 사용하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유한 증류수, 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴을 사용하였으며 20분간 5-70% B 용매 기울기, 20-24분간 70-100% B 용매, 24-27분간 100% B 용매로 유속은 0.4 ml/min 조건으로 용리하였다. 질량분석 스펙트럼은 HESI 이온화 소스를 사용하여 m/z 100-1,500 분자량 범위의 스펙트럼을 검색하였다.
4 ml/min 조건으로 용리하였다. 질량분석 스펙트럼은 HESI 이온화 소스를 사용하여 m/z 100-1,500 분자량 범위의 스펙트럼을 검색하였다.
질량분석기를 이용한 배양추출물 분석은 Waters BEH C18 칼럼(2.1 × 150 mm, 1.7 μm)을 장착한 Accela UHPLC(Thermo Scientific, USA)와 LTQ-Orbitrap XL 고분해능 질량분석기(Thermo Scientific, USA)를 사용하였다.
항진균 활성을 보인 S1, S2 피크, 그리고 활성을 나타내지는 않았지만 상대적으로 높은 피크를 보인 S4 피크를 분획으로 분리한 후, 고해상도 질량분석기로 분석하였다. S1 피크물질은 m/z ([M+H]⁺) 값이 471.

대상 데이터

(A) CYG medium control extract. (B-E) M. stipitatus KYC4013, KYC4174, KYC2004, and KYC2018 extracts, respectively. Extracts were separated by HPLC using separation condition 1 described in the Materials and Methods section.
CYC 배지는 CYG 배지에서 탄소원으로 포도당 대신 키토산을 넣어준 배지이고, CYS 배지는 포도당 대신 가용성 전분을 넣어준 배지이다. P. aeruginosa, S. aureus의 배양에는 NA [14], C. albicans는 YM [14]을 사용하였다. 모든 균주들은 32°C에서 배양하였다.
점액세균 균주는 모두 본 연구팀이 국내에서 순수 분리한 균주들을 사용하였다[14]. Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Candida albicans ATCC 18804는 생명공학연구원 생물자원센터에서 구입하였다.
5 μg/ml cyanocobalamine을 함유하고 있었으며, 미량원소용액은 1리터당 100 mg MnCl₂· 4H₂O, 20 mg CoCl₂, 10 mg CuSO₄, 10 mg Na₂MoO₄· 2H₂O, 20 mg ZnCl₂, 5 mg LiCl, 5 mg SnCl₂·2H₂O, 10 mg H₃BO₃, 20 mg KBr, 20 mg KI, 8 g EDTA Na-Fe³⁺ salt (trihydrate)를 함유하고 있었다. 물질생산을 위한 다른 배지로는 CY [11], CYE [13], CF [13], CYC, CYS 배지[14]를 사용하였다. CYC 배지는 CYG 배지에서 탄소원으로 포도당 대신 키토산을 넣어준 배지이고, CYS 배지는 포도당 대신 가용성 전분을 넣어준 배지이다.
점액세균 균주의 일반적인 배양을 위해서는 VY3 배지[14]를 사용하였으며, 배양추출물의 제조를 위해서는 CYG 배지를 사용하였다. CYG 배지는 0.

성능/효과

stipitatus 균주들의 배양추출물을 대상으로 HPLC 분석을 실시하여 항진균 활성을 보이는 물질피크를 찾고자 하였다. 46균주들의 배양추출물을 용리조건1로 분석하였을 때 가장 강한 항진균 활성을 보인 KYC4013 균주의 배양추출물은 23-25분 부근에서 6개의 피크를 보였다(Table 1, Fig. 1B). 하지만 활성이 없는 KYC2018 균주의 크로마토그램에서는 이러한 피크가 보이지 않았으며(Table 1, Fig.
stipitatus KYC4013 균주의 배양추출물을 고분해능 LC-MS로 비교 분석한 결과 melithiazol 유도체로 추정되는 5개 항진균 물질과 phenalamide 유도체로 추정되는 3개 이차대사산물을 생산하고 있는 것으로 나타났다. Melithiazol 유도체 추정 물질들은 CYS 배지에서 가장 잘 생산되었으며, phenalamide 유도체 추정 물질들은 VY3 배지에서 가장 잘 생산되었다.
항진균 활성을 보인 S1, S2 피크, 그리고 활성을 나타내지는 않았지만 상대적으로 높은 피크를 보인 S4 피크를 분획으로 분리한 후, 고해상도 질량분석기로 분석하였다. S1 피크물질은 m/z ([M+H]⁺) 값이 471.1418로 C₂₄H₂₆O₄N₂S₂의 화학식을 가진 물질일 것으로 분석되었으며, S2 피크물질은 m/z ([M+H]⁺) 값이 423.1415으로, C₂₀H₂₆O₄N₂S₂의 화학식을 가진 물질일 것으로 분석되었다(Fig. 3). S4 피크물질은 m/z ([M+H]⁺) 값이 508.
stipitatus KYC4013 균주를 VY3, CY, CYE, CF, CYS, CYC, CYG 배지에서 7일 동안 배양한 뒤, 추출물을 제조하여 생리활성물질 생산 양상을 분석하였다. S1, S2, S7, S8, S9 피크물질은 CYS 배지에서 가장 많이 생산된 반면 S4, S5, S6 피크물질은 VY3 배지에서 높은 생산을 보였다(Fig. 4). 따라서 melithiazol은 CYS 배지에서 가장 잘 생산되며, phenalamide는 VY3 배지에서 가장 잘 생산되는 것으로 나타났다.
각 피크분획을 받아 C. albicans에 대한 성장저해활성을 측정하였는데, S1, S2, S7, S8, S9 피크분획들은 모두 항진균 활성을 보였지만 S3, S4, S5, S6 피크분획들은 활성을 보이지 않았다(Table 2).
국내 분리 Myxococcus 속 점액세균 207 균주들 중 가장 높은 항진균 활성을 보인 M. stipitatus KYC4013 균주의 배양추출물을 고분해능 LC-MS로 비교 분석한 결과 melithiazol 유도체로 추정되는 5개 항진균 물질과 phenalamide 유도체로 추정되는 3개 이차대사산물을 생산하고 있는 것으로 나타났다. Melithiazol 유도체 추정 물질들은 CYS 배지에서 가장 잘 생산되었으며, phenalamide 유도체 추정 물질들은 VY3 배지에서 가장 잘 생산되었다.
용리조건1을 사용한 HPLC 분석에서 6개의 피크가 서로 가깝게 존재하므로 KYC4013 균주의 배양추출물을 용리조건2로 분석하여 보았다. 그 결과 6개의 피크들이 43.66분(S1), 44.25분(S2), 44.58분(S3), 45.01분(S4), 45.54분(S5), 45.7분(S6), 46.21분(S7), 46.71분(S8), 47.65분(S9)에 각각 검출되는 9개 피크로 분리되었다(Fig. 2A). 각 피크분획을 받아 C.
1D). 그리고 KYC4174 균주와 같이 항진균 활성이 약한 균주들의 배양추출물에서는 6개 피크가 모두 검출되었지만 피크들이 상대적으로 낮게 나타났다(Table 1, Fig. 1C).
9개 피크 이외의 다른 피크분획들도 항진균 활성을 보이지 않았다. 따라서 KYC4013 균주의 배양추출물이 C. albicans에의 성장을 저해하는 강한 항진균 활성을 보이는 이유는 S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들 때문인 것으로 사료되었다.
CF 배지에는 극미량의 영양분만을 함유하고 있어 점액세균 세포들을 올려놓을 경우 영양분 부족으로 곧바로 자실체 형성이 유도된다. 따라서 M. stipitatus KYC4013은 CYE와 같이 영양분 함량이 높은 배지나 CF와 같이 영양분이 거의 없는 배지에서는 생리활성물질을 잘 생성하지 못하며, CYS, CYG, VY3와 같이 초기에 영양성장을 하다가 후기에 영양분이 고갈되는 배지에서 물질을 잘 생성하는 것으로 보인다.
4). 따라서 melithiazol은 CYS 배지에서 가장 잘 생산되며, phenalamide는 VY3 배지에서 가장 잘 생산되는 것으로 나타났다. CYE, CF, CYC 배지에서는 모든 피크 물질들이 CY 배지에 비해 훨씬 적은 양 생산되었다(Fig.
2B). 따라서 이들 다섯 개 피크 물질들은 동일 계열 항진균 물질일 가능성이 높은 것으로 나타났다. 한편 S4, S5, S6 피크분획의 UV 스펙트럼도 서로 유사하여(Fig.
3). 얻어진 화학식을 기초로 물질 데이터베이스를 분석한 결과, S1 피크물질은 melithiazol F, S2 피크물질은 melithiazol A 또는 E일 것으로 나타났으며, S4 피크물질은 phenalamide C일 것으로 분석되었다. S5와 S6 피크의 혼합분획은 m/z ([M+H]⁺) 값이 492.
albicans의 성장을 억제하는 항진균 물질을 생산함을 보고하였다[14]. 이 활성조사에서 M. stipitatus에 속한 균주들이 다른 Myxococcus 종 균주들에 비해 강한 활성을 보이는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 M.
JW154로부터 melithiazol F를 분리하여 식물병원균에 대한 in vivo 활성을 조사하였다[1]. 질량분석 결과 외에도 KYC4013 배양추출물의 HPLC 분석에서 검출된 S1, S2, S7, S8, S9 피크 분획의 UV 스펙트럼이 melithiazol의 UV 스펙트럼과 유사하며 항진균 활성을 갖는 것으로 보아 이들 다섯 피크 물질들은 모두 melithiazol의 유도체인 것으로 사료된다.
stipitatus JW117 균주로부터 phenalamide A1, A2, A3를 분리하여 다약제 내성 암세포에 대한 활성을 조사하였다[2]. 질량분석 결과 외에도 KYC4013 배양추출물의 HPLC 분석에서 검출된 S4, S5, S6 피크 분획의 UV 스펙트럼이 phenalamide의 UV 스펙트럼과 유사하므로 이들 피크 물질들은 모두 phenalamide의 유도체인 것으로 사료된다.
약한 항진균 활성을 보인 KYC4174 균주의 배양추출물에서도 S1-S9의 9개 피크가 모두 검출되었다. 하지만 활성을 보이지 않은 KYC2004 균주의 배양추출물에서는 항진균 활성을 보이는 S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들은 검출되지 않았고 항진균 활성이 없는 S3-S6의 4개 피크만 검출되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	점액세균의 특징은 무엇인가?	점액세균(myxobacteria)은 δ-Proteobacteria 문(phylum)의 Myxococcales 목(order)으로 분류되는 그람음성 세균으로 토양 및 썩은 나무껍질이나 식물, 초식동물들의 배설물 등에서 집단으로 서식하며 다른 유기물 등을 분해하거나 주변의 미생물을 죽이고 분해하여 영양분을 얻는다[9, 11, 20]. 7과(family) 22속(genus)이 알려져 있는데[3, 9], 이 중 Corallococcus, Myxococcus, Nannocystis, Sorangium 속에 속하는 균주들이 다른 속 균주들에 비해 많은 수 분리되었다[4].
	점액세균의 주변 다른 미생물들을 죽이고 분해하여 영양분을 얻는 특성으로 생긴 특징은?	7과(family) 22속(genus)이 알려져 있는데[3, 9], 이 중 Corallococcus, Myxococcus, Nannocystis, Sorangium 속에 속하는 균주들이 다른 속 균주들에 비해 많은 수 분리되었다[4]. 주변의 다른 미생물들을 죽이고 분해하여 영양분을 얻는다는 특성에서 알 수 있듯이 점액세균은 다양한 이차대사 생리활성물질을 생산하여 현재까지 약 100종류의 기본 구조를 갖는 500여개의 물질이 분리되었다[7, 17]. Sorangium 속은 대표적인 생리활성물질 생산 점액세균 종류로 점액세균에서 분리된 생리활성물질의 약 48%가 이 속에 속하는 균주들에서 분리되었다[4].
	유도체일 가능성을 조사하기 위해 실시한 UV 스펙트럼 실험에서, PDA 검출기를 통해 얻은 S1, S2, S7, S8, S9 피크 분획에서 240 nm와 310 nm 부근 최대 흡광을 보이는 것은 무엇을 시사하는가?	2B). 따라서 이들 다섯 개 피크 물질들은 동일 계열 항진균 물질일 가능성이 높은 것으로 나타났다. 한편 S4, S5, S6 피크분획의 UV 스펙트럼도 서로 유사하여(Fig.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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