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문제 정의
- 최근 매생이 추출물의 생리활성 효과에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔으나 [13-15], 추출물에 성분에 대한 체계적인 물질규명이 이루어지지 않고 있다. 본 연구에서는 효소를 이용하여 매생이를 가수분해하여 상등액에 함유되어 있는 다당류를 ultrafiltration membrane으로 분리하고 HPLC, FT-IR, 1H-NMR와 화학적인 methylation 방법을 사용하여 분리된 다당류의 분자량 및 구조를 분석하고자 한다.
제안 방법
- 05% TFA를 함유한 Acetonitrile의 조성을 변화시켜 흡광도 228 nm에서 분석하였다. ACE 저해 활성은 대조구의 HA peak 면적 값과 시료의 peak 면적 값의 차이를 백분율로 계산하였다.
- ACE 저해활성 측정은 HHL (hippuryl-His-Leu)로부터 유리되는 HA (hippuric acid)만을 HPLC (Shimadzu, Japan)로 분리하여 측정하였다. 0.
- Alditol acetate 유도체의 GC 분석조건은 칼럼 DB-5MS (60 m×0.25 mm I.D., film thickness 0.25 µm, Agilent)을 사용하였고, 여러 가지 표준 당 (rhamnose, arabinose, fucose, mannose, glucose, galactose)을 활용하여 각 당이 검출되는 시간을 측정하였다.
- HPLC 분석 조건은 칼럼 Suprema 1,000 (8×300 mm, PSS, USA)을 사용하여 0.05% NaN3 용액으로 1.0 mL/min으로 용출시켰으며 RI (refractive index) 검출기로 분석하였다.
- 2 mL를 가하여 methylation하였다. Methylation된 시료는 chloroform과 methanol의 혼합용액 (2:1)으로부터 분리하고2 M TFA로 121℃에서 6시간 가수분해한 후, NaBH4로 환원 시키고 및 acetyl화 과정을 거쳐 partially methylated alditol acetate로 전환하고 GC/MS로 분석하였다. GC/MS 분석은 DB-5MS 칼럼을 이용하여 분석하였다.
- 매생이 Alcalase 추출물의 유용성분의 분리를 위하여 한외여과막을 이용하여 분리하였다. 분리된 분획을 동결 건조하여 ACE 저해활성을 측정한 결과, 2 kDa 이상의 분획에서는 40%의 ACE 저해활성을 보였으며 2 kDa 이하의 분획에서는 82%의 높은 ACE 저해활성을 보였다 (Fig.
- 매생이 효소 추출물 및 분획물의 분자량은 표준물질인 dextran을 사용하여 상대적인 분자량을 측정하였다. Alcalase 추출물은 4개의 peak를 보였으며 각각 약 730 kDa, 8 kDa, 1 kDa, 180 Da등의 분자량 분포를 나타내었다 (Fig.
- 반응액은 0.2 µm syringe filter로 필터링하여 분석용 칼럼 (Xterra RP 15 (4.6×100 mm), Waters, USA)으로 분석하였으며, 용매는 0.05% TFA (trifluoroacetic acid)를 함유한 증류수와 0.05% TFA를 함유한 Acetonitrile의 조성을 변화시켜 흡광도 228 nm에서 분석하였다.
- 시료의 결합위치 결정을 위해 methylation하여 GC/MS (GCMS-2010, Shimadzu)로 분석하였다. 동결 건조된 분획 시료에 DMSO를 첨가하여 용해한 후 NaOH 20 mg과 CH3I 0.
- 5 mL에 녹여 10 mg의 hydroxylamine hydrochloride를 혼합후 90℃에서 30분 반응시킨다. 실온까지 냉각하여 acetic anhydride 0.5 mL을 혼합하여 90℃에서 30분 반응시켜 alditol acetate로 전환하여 gas chromatography (GC-2010, Shimadzu, Japan)로 분석하였다. Alditol acetate 유도체의 GC 분석조건은 칼럼 DB-5MS (60 m×0.
- 한외여과 2 kDa 이하 분획물의 구조 및 당쇄 결합 형태를 분석하기 위해 FT-IR, 1H-NMR, methylation 분석을 하였다. FT-IR 분석한 결과 각 peak의 작용기는 3300~3400 cm-1에서 당 고리의 전형적인 O-H의 streching 진동이 보였으며, 1650 cm-1에서 C=O streching 진동이, 1000~1200 cm-1에서는 C-H와 C-O bending 진동이 나타났으며 (Fig.
- 효소 불활성화 시킨 추출물을 적당히 증류수에 희석하고 정량펌프 (S600, LAB24, Korea)를 이용하여 유속 400 rpm으로 한외여과막으로 주입하였다. 한외여과막에 걸리는 압력은 oulet pressure valve를 조절하여 일정하게 유지하였으며 2,000 Da 이상의 물질은 저장조 (retentate)에 모여 농축되고, 2,000 Da 이하의 물질은 한외여과막을 통과하여 여과조 (permeate)로 수집하였다. 여과조의 시료는 순도를 높이기 위하여 3회 반복하여 분리하였다.
- 한외여과막에 의해 분리된 분획의 작용기를 분석하기 위해 시료제조는 KBr법을 사용하였고 시료 약 1 mg과 동량의 KBr 분말을 혼합하여 투명한 정제를 성형하고 적외선 흡수 spectrum을 FT-IR (Win FTS 165, Bio-Rad)을 이용하여 측정하였으며, 구조분석을 위한 1H-NMR의 분석은 300 MHz FT-NMR (Unity Plus 300, Varian, U.S.A.)를 이용하여 D2O에 녹여 분석하였다.
- 이는 한외여과막으로 분리한 2 kDa 이하 분획물은 주성분이 당으로 이루어진 올리고당으로 나타났다. 한외여과막으로 분리한 2 kDa 이하 분획물의 구성당을 분석하기위해 alditol acetate로 전환 하여 GC로 분석하였다. 그 결과 2 kDa 이하 분획물의 구성당 조성은 mannose 1.
- 효소 추출물 및 한외여과 분획의 분자량은 HPLC (Shimadzu)를 이용하여 측정하였다. HPLC 분석 조건은 칼럼 Suprema 1,000 (8×300 mm, PSS, USA)을 사용하여 0.
- 효소 추출물을 분리하기위해 한외여과막 시스템 (Hydrosart, MWCO 2,000 Da, Sartorius, Germany)을 이용하여 분리하였다. 효소 불활성화 시킨 추출물을 적당히 증류수에 희석하고 정량펌프 (S600, LAB24, Korea)를 이용하여 유속 400 rpm으로 한외여과막으로 주입하였다.
- 효소를 불활성화 하기 위해 100℃에서 15분간 가열하여 원심분리기 (Mega 17R, Hanil CO., Korea)로 15,600×g에서 20분간 원심분리하고 잔사를 제거한 상등액을 취하여 동결건조 후 분리용 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 0 mL/min으로 용출시켰으며 RI (refractive index) 검출기로 분석하였다. 상대적인 분자량을 측정하기 위하여 표준물질로 Dextran (670, 150, 50, 12, 5 kDa, Sigma, USA)을 사용하였다.
- 실험에 사용된 매생이는 전라남도 장흥 및 강진군 일대에서 생산된 것으로 깨끗이 씻은 후 동결 건조 (SFDSM06, SAM-WON)하여 분쇄기 (FM-681(C), HANIL)로 분쇄한 후 200 mesh 이하의 것을 시료로 사용하였다.
- 효소 추출물 제조는 단백질 분해효소 (Alcalase, Novozyme, Denmark)를 사용하여 효소 추출물을 제조하였다 [16]. 동결 건조 후 분말화한 매생이 1g을 0.
데이터처리
- Methylation된 시료는 chloroform과 methanol의 혼합용액 (2:1)으로부터 분리하고2 M TFA로 121℃에서 6시간 가수분해한 후, NaBH4로 환원 시키고 및 acetyl화 과정을 거쳐 partially methylated alditol acetate로 전환하고 GC/MS로 분석하였다. GC/MS 분석은 DB-5MS 칼럼을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 효소 추출물 및 한외여과 분획의 총당 함량은 Dubois 등 [17] 의 phenol sulfuric acid 법으로 측정하였으며, 단백질 함량은 Bradford [18] 법으로, 황산기의 함량은 Dodgson [19] 방법으로 측정하였다.
성능/효과
- 2,4,6-tri-O-methyl-glucose의 함량으로 보아 β-1,3 결합된 다 당이 주된 결합이었으며, 2,3,6-tri-O-methyl-glucose는 존재 하지 않는 것으로 보아 1,4 결합은 없는 것으로 보이며, β-1,3-glucan으로 추정된다.
- Alcalase 추출물 및 한외여과막 2 kDa 이하 분획물의 화학적 조성을 분석한 결과 Alcalase 추출물은 총당의 함량은 89.9%로 주요 성분이었으며, 단백질이 4.2% 그리고 황산기의 함량이 5.9%이었다. 이는 Na 등 [24]이 연구한 매생이 열수추출물의 화학적 조성을 분석한 결과 총당 함량 49.
- 1% 이상의 ACE 저해 활성을 보였으며, 한외여과막 (UF membrane)을 이용하여 분리한 2 kDa 이하의 분획에서는 82%의 높은 ACE 저해활성을 보였다. Alcalase 추출물은 4개의 peak를 보였으며 각각 약 730 kDa, 8 kDa, 1 kDa, 180 Da 등의 분자량 분포를 나타내었으며, 한외여과막 2 kDa 이하 분획의 분자량은 약 1 kDa의 분자량을 보였다. 한외여과막 2 kDa 이하 분획의 화학적 조성은 총당 99.
- 매생이 효소 추출물 및 분획물의 분자량은 표준물질인 dextran을 사용하여 상대적인 분자량을 측정하였다. Alcalase 추출물은 4개의 peak를 보였으며 각각 약 730 kDa, 8 kDa, 1 kDa, 180 Da등의 분자량 분포를 나타내었다 (Fig. 3). 한외여과막 2 kDa 이상 분획의 분자량 측정 시 약 730 kDa, 8 kDa, 1 kDa 등의 분자량 분포를 보였으며, 한외여과막 2 kDa 이하 분획의 분자량은 약 1 kDa의 분자량을 보였으며 2 kDa 이하 분획물은 단위체인 glucose가 5~8개가 결합된 oligomer 형태로 생각된다.
- 7%, 단백질 함량이 0%로 본 연구결과와는 상이한 결과를 보였다. Alcalase 추출물을 한외여과막으로 분리한 분획물의 화학적 조성을 분석한 결과 2 kDa 이하 분획은 총당의 함량이 99.88%로 주요 성분이었으며, 단백질 0.07%, 황산기의 함량이 0.05%로 낮은 함량을 보였다 (Table 1). 이는 한외여과막으로 분리한 2 kDa 이하 분획물은 주성분이 당으로 이루어진 올리고당으로 나타났다.
- 한외여과막으로 분리한 2 kDa 이하 분획물의 구성당을 분석하기위해 alditol acetate로 전환 하여 GC로 분석하였다. 그 결과 2 kDa 이하 분획물의 구성당 조성은 mannose 1.5%, glucose 97.2%로 함유되어있는 glucose를 주성분으로 이루어진 분자량 약 1 kDa의 oligo-glucan 인 것으로 추정된다 (Fig. 4). 이는 Zvyagintseva 등 [25]이 연구한 L.
- 또한 FT-IR 분석한 결과 890 cm-1영역에서 peak를 보여 β-glycosidic linkage을 갖는 것으로 보이며, methylation 분석한 결과 2,4,6-tri-O-methyl-glucose로 94.1%였으며 1H-NMR분석한 결과 표준물질인 Curdlan (1,3-glucan)과 같은 peak를 보여 한외여과 2 kDa 이하 분획물은 β-1,3-glucan임을 알 수 있었다.
- 또한, 1H-NMR 분석한 결과 3.53, 3.59, 3.65, 3.70, 3.80 ppm은 각각 glucan의 H1, H2, H3, H4, H5의 peak들이며 표준물질인 Curdlan (1,3-glucan)과 같은 peak를 보여 한외여과 2 kDa 이하 분획물은 β-glucan임을 알 수 있었다 (Fig. 6).
- 본 연구에서 분획된 2 kDa 이하의 분획물은 890 cm-1영역에서 peak를 보여 β-glycosidic linkage을 갖는 것으로 보인다. 또한, 한외여과2 kDa 이하 분획물의 methylation을 분석한 결과 주요 성분은 2,4,6-tri-O-methyl-glucose로 94.1% 함량을 보였으며 2,3,4,6- tetra-O-methyl-glucose가 2.6%의 함량을 보였다 (Table 2). 2,4,6-tri-O-methyl-glucose의 함량으로 보아 β-1,3 결합된 다 당이 주된 결합이었으며, 2,3,6-tri-O-methyl-glucose는 존재 하지 않는 것으로 보아 1,4 결합은 없는 것으로 보이며, β-1,3-glucan으로 추정된다.
- 매생이로부터 유용성분을 추출하기 위해 Alcalase 효소를 이용하여 추출하고 ACE 저해 활성을 측정한 결과 Alcalase 추출물에서 72.1% 이상의 ACE 저해 활성을 보였으며, 한외여과막 (UF membrane)을 이용하여 분리한 2 kDa 이하의 분획에서는 82%의 높은 ACE 저해활성을 보였다. Alcalase 추출물은 4개의 peak를 보였으며 각각 약 730 kDa, 8 kDa, 1 kDa, 180 Da 등의 분자량 분포를 나타내었으며, 한외여과막 2 kDa 이하 분획의 분자량은 약 1 kDa의 분자량을 보였다.
- 매생이로부터 유용성분을 추출하기위해 Alcalase 효소를 이용하여 추출한 결과 42.0% (w/w)의 추출 수율을 보였으며, ACE 저해활성을 측정한 결과 Alcalase 추출물에서 72.1%의 저해활성을 보였다. 이는 Lee 등 [20]이 연구한 해조류 효소 가수분해물의 ACE 저해활성을 측정한 결과와 비교하면 쇠 미역, 김, 파래, 지아누리의 pepsin 가수분해물의 ACE 저해활성은 20% 이하 보여 본 연구의 매생이 Alcalase 추출물에 비해 낮은 ACE 저해활성을 보였으며, Kim 등 [21]이 연구한 김 Alcalase 가수분해물의 ACE 저해활성이 43.
- 본 연구에서 분획된 2 kDa 이하의 분획물은 890 cm-1영역에서 peak를 보여 β-glycosidic linkage을 갖는 것으로 보인다.
- 매생이 Alcalase 추출물의 유용성분의 분리를 위하여 한외여과막을 이용하여 분리하였다. 분리된 분획을 동결 건조하여 ACE 저해활성을 측정한 결과, 2 kDa 이상의 분획에서는 40%의 ACE 저해활성을 보였으며 2 kDa 이하의 분획에서는 82%의 높은 ACE 저해활성을 보였다 (Fig. 2). 이는 Kim 등[21]이 연구한 김 pepsin 가수분해물의 분자량별 ACE 저해 활성과 비교하면 3 kDa 이하의 분획에서 60.
- Alcalase 추출물은 4개의 peak를 보였으며 각각 약 730 kDa, 8 kDa, 1 kDa, 180 Da 등의 분자량 분포를 나타내었으며, 한외여과막 2 kDa 이하 분획의 분자량은 약 1 kDa의 분자량을 보였다. 한외여과막 2 kDa 이하 분획의 화학적 조성은 총당 99.88%, 단백질 0.07%, 황산기 함량이 0.05%로 나타났으며, 구성당의 조성은 mannose 1.5%, glucose 97.2%로 주로 glucose로 구성되어있었다. 또한 FT-IR 분석한 결과 890 cm-1영역에서 peak를 보여 β-glycosidic linkage을 갖는 것으로 보이며, methylation 분석한 결과 2,4,6-tri-O-methyl-glucose로 94.
후속연구
- 한편 생분해 또는 가수 분해에 대한 기술개발도 시도되고 있다. 따라서 효소를 이용하여 가수분해 또는 저분자화하여 물성을 개량하면 다양한 용도로 이용성이 크게 확대될 것으로 예상된다.
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