[논문]Fetal bovine serum의 농도에 따른 infectious hematopoietic necrosis virus와 infectious pancreatic necrosis virus의 감염가 변화

김형준; 박정수; 권세련

doi:10.7847/jfp.2018.31.2.081

[국내논문] Fetal bovine serum의 농도에 따른 infectious hematopoietic necrosis virus와 infectious pancreatic necrosis virus의 감염가 변화
Effects of fetal bovine serum concentrations on viral infectivity titers of infectious hematopoietic necrosis virus and infectious pancreatic necrosis virus 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.31 no.2, 2018년, pp.81 - 85

김형준 (VHS OIE 표준실험실, 국립수산물품질관리원) , 박정수 (선문대학교 수산생명의학과) , 권세련 (선문대학교 수산생명의학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Fetal bovine serum (FBS) is an essential element of cell growth and can also affect the viral replication. In this study, we tried to find out whether FBS concentration affects the viral infectivity titer of IHNV and IPNV. EPC cells were suspended with MEM supplemented with various concentrations of FBS (MEM0, MEM2, MEM5 and MEM10) and cultured in 96-well plate. Each virus was 10-fold diluted virus and inoculated in 96-well plate. The highest infectivity titer of IHNV was $10^{7.88}\;TCID_{50}/mL$ in 96-well plate using MEM5 and the lowest one was $10^{7.30}\;TCID_{50}/mL$ in 96-well plate using MEM10. The highest infectivity titer of IPNV was $10^{7.47}\;TCID_{50}/mL$ in 96-well plate using MEM5 and the lowest one was $10^{6.97}\;TCID_{50}/mL$ in 96-well plate using MEM10. This study showed that not only 0% FBS but 10% FBS leads low infectivity titer of IHNV and IPNV. Therefore, it is considered that the desirable concentration of FBS is 2% or 5% for measurement of infectivity titer of IHNV and IPNV.

주제어

표/그림 (2)

그림 Fig. 1. Infectivity titers of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in EPC cells which were prepared in 96-well plate using minimum essential medium (MEM) supplemented with 0, 2, 5 and 10% (v/v) FBS (feral bovine serum). TCID50, 50% tissue culture infectious dose.
그림 Fig. 2. Epithelioma papillosm cyprinid (EPC) cells inoculated with 10⁴-fold diluted infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Cells were prepared in 96-well plate using minimum essential medium (MEM) supplemented with 0, 2, 5 and 10% (v/v) FBS (MEM0, MEM2, MEM5 and MEM10, respectively) and observed at 6 d after viral inoculation. Bar=100μm.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 IHNV와 IPNV의 infectivity titer를 측정하는 실험에서 다양한 농도의 FBS가 포함된 배지를 사용하여, 바이러스의 감염가 측정 결과에 어떠한 영향을 주는지 알아보고자 하였다.
Fetal bovine serum (FBS)는 세포의 성장에 필수 적인 요소이므로 바이러스의 증식에도 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에서는 바이러스의 감염가 측정 결과에 대해 FBS가 어떠한 영향을 주는지 알아 보고자 하였다. IHNV와 IPNV의 감염가를 측정하는 실험에서 다양한 농도의 FBS가 포함된 MEM 배지(MEM0, MEM2, MEM5 MEM10)를 사용하여 96-well plate를 준비한 후 단계 희석된 바이러스를 접종하여 감염가를 비교하였다.

제안 방법

각 배지로 준비된 96-well plate에 IHNV과 IPNV를 10^-1 ~ 10^-10까지 10단계 희석한 후 50 μL씩 접종하였다. 50% tissue culture infectious does (TCID₅₀)을 결정하기 위해 15℃에서 14일 동안 cytopathic effect (CPE)를 관찰하였다. 각 바이러스의 감염가 측정 실험은 3반복으로 수행되었다.
Epithelioma papillosm cyprinid (EPC) cells inoculated with 10⁴-fold diluted infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Cells were prepared in 96-well plate using minimum essential medium (MEM) supplemented with 0, 2, 5 and 10% (v/v) FBS (MEM0, MEM2, MEM5 and MEM10, respectively) and observed at 6 d after viral inoculation. Bar=100µm.
본 연구에서는 바이러스의 감염가 측정 결과에 대해 FBS가 어떠한 영향을 주는지 알아 보고자 하였다. IHNV와 IPNV의 감염가를 측정하는 실험에서 다양한 농도의 FBS가 포함된 MEM 배지(MEM0, MEM2, MEM5 MEM10)를 사용하여 96-well plate를 준비한 후 단계 희석된 바이러스를 접종하여 감염가를 비교하였다. IHNV의 감염가 측정 결과 MEM5을 사용한 경우 10^7.
50% tissue culture infectious does (TCID₅₀)을 결정하기 위해 15℃에서 14일 동안 cytopathic effect (CPE)를 관찰하였다. 각 바이러스의 감염가 측정 실험은 3반복으로 수행되었다.
각 배지로 준비된 96-well plate에 IHNV과 IPNV를 10-1 ~ 10-10까지 10단계 희석한 후 50 μL씩 접종하였다.
IHNV는 RtWanju09 분리주(Kim, 2010)를, IPNV는 VR-299 (ATCC)를 사용하였다. 농도에 따른 바이러스의 감염가 차이를 비교하기 위해 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco)가 첨가된 minimum essentialmedium (MEM) 배지에 0, 2, 5 및 10%의 농도로 FBS (Gibco)를 첨가한 후 각각의 배지를 MEM0,MEM2, MEM5 및 MEM10으로 하고 실험에 사용하였다.
바이러스 감염가 측정을 위해 EPC 세포를 trypsin-EDTA (Gibco)로 박리시키고 MEM에 현탁한 후 2000xg에서 원심분리하고 MEM0로 다시 현탁 하는 과정을 2회 반복하였다. 원심분리로 형성된 세포 pellet을 MEM0, MEM2, MEM5 및 MEM10으로 각각 다시 현탁하고 96-well plate에 접종한 후 15℃에서 하루 동안 배양하였다.
바이러스의 배양을 위해 epithelioma papulosum cyprinid (EPC) 세포를 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco)가 첨가된 minimum essential medium (MEM) 배지로 계대·배양하였다.

대상 데이터

바이러스의 배양을 위해 epithelioma papulosum cyprinid (EPC) 세포를 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco)가 첨가된 minimum essential medium (MEM) 배지로 계대·배양하였다. IHNV는 RtWanju09 분리주(Kim, 2010)를, IPNV는 VR-299 (ATCC)를 사용하였다. 농도에 따른 바이러스의 감염가 차이를 비교하기 위해 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco)가 첨가된 minimum essentialmedium (MEM) 배지에 0, 2, 5 및 10%의 농도로 FBS (Gibco)를 첨가한 후 각각의 배지를 MEM0,MEM2, MEM5 및 MEM10으로 하고 실험에 사용하였다.

성능/효과

IHNV의 감염가 측정 결과 MEM5로 EPC 세포를 현탁하여 96-well plate를 만든 경우에 10^7.88 TCID₅₀/ mL라는 가장 높은 감염가를 나타내었고 MEM2를 사용한 경우에도 10^7.88 TCID₅₀/mL의 높은 감염가를 보였다(Fig. 1). 반면 MEM0와 MEM10을 사용한 경우의 감염가는 각각 10^7.
IHNV와 IPNV의 감염가를 측정하는 실험에서 다양한 농도의 FBS가 포함된 MEM 배지(MEM0, MEM2, MEM5 MEM10)를 사용하여 96-well plate를 준비한 후 단계 희석된 바이러스를 접종하여 감염가를 비교하였다. IHNV의 감염가 측정 결과 MEM5을 사용한 경우 10^7.88 TCID₅₀/mL 라는 가장 높은 감염가를 나타내었고 MEM10을 사용한 경우에는 가장 낮은 감염가(10^7.30 TCID₅₀ / mL)를 보였다. 한편 IPNV은 MEM2에서 10^7.
본 연구 결과로부터 MEM0에서뿐만 아니라 일반적으로 세포를 배양할 때 사용하는 10%의 FBS 농도에서도 바이러스 감염가가 낮아 진다는 것을 알 수 있었다. 따라서 2% 또는 5%의 FBS가 포함된 배지를 감염가 측정 실험에 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다.
즉 VHSV, IHNV 및 IPNV의 배양 및 감염가 측정에서 FBS가 10% 포함된 배지를 사용하는 것은 오히려 바이러스의 증식을 저하시킬 수 있으며 실제 감염 가보다 낮게 나오게 하는 결과를 초래할 수 있다. 따라서 2% 또는 5%의 FBS가 포함된 배지를 배양 및 감염가 측정 실험에 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다. 본 연구의 결과는 우리나라의 어류에 발병하는 주요 RNA 바이러스의 배양연구를 위한 기초지식을 제공하고 있으며 실험방법의 표준화 필요성을 제시하고 있다.
그 연구 결과들에 따르면 소 혈청에는 β inhibitor가 함유되어 있고 말과 기니피그 혈청에는 α2-macroglobulin과 glycoprotein inhibitor가 포함되어 있어서 influenza virus의 infectivity와 hemagglutinating activity를 방해한다고 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서 10%의 FBS가 포함된 배지에서 바이러스의 감염가가 낮아진 것은 혈청 내에 존재하는 다양한 inhibitor에 의한 것일 가능성이 있다. 한편 IPNV은 MEM2에서 감염 가가 10^7.
97 TCID₅₀/mL이라는 가장 낮은 감염가를 보였다. 본 연구 결과로부터 MEM0에서뿐만 아니라 일반적으로 세포를 배양할 때 사용하는 10%의 FBS 농도에서도 바이러스 감염가가 낮아 진다는 것을 알 수 있었다. 따라서 2% 또는 5%의 FBS가 포함된 배지를 감염가 측정 실험에 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다.
본 연구 결과와 Kim et al. (2018)의 연구 결과를 통하여 FBS가 세포의 성장뿐 아니라 어류 주요 바이러스인 VHSV, IHNV 및 IPNV의 증식 및 감염가에도 영향을 미치는 것을 확인하였다. FBS가 전혀 첨가되지 않은 MEM0에서 바이러스 감염가가 낮아지는 것뿐만 아니라 일반적으로 세포를 배양할 때 사용하는 10%의 FBS 농도에서도 낮은 감염가를 보인 것은 흥미로운 결과라고 할 수 있겠다.
30 TCID₅₀ / mL)를 보였다. 한편 IPNV은 MEM2에서 10^7.47TCID₅₀/mL로 가장 높은 감염가를 보였고 MEM0를사용한 경우 10^6.97 TCID₅₀/mL이라는 가장 낮은 감염가를 보였다. 본 연구 결과로부터 MEM0에서뿐만 아니라 일반적으로 세포를 배양할 때 사용하는 10%의 FBS 농도에서도 바이러스 감염가가 낮아 진다는 것을 알 수 있었다.

후속연구

따라서 2% 또는 5%의 FBS가 포함된 배지를 배양 및 감염가 측정 실험에 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다. 본 연구의 결과는 우리나라의 어류에 발병하는 주요 RNA 바이러스의 배양연구를 위한 기초지식을 제공하고 있으며 실험방법의 표준화 필요성을 제시하고 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral haemorrhagic septicaemiavirus, VHSV)의 증식에 대해 FBS가 미치는 영향에 대한 결과는 무엇인가?	우리 연구팀은 이전 연구에서 바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral haemorrhagic septicaemiavirus, VHSV)의 증식에 대해 FBS가 미치는 영향에 대해 조사한 바 있다. 그 연구 결과에 따르면 FBS가 포함되지 않은 배지에서는 바이러스의 증식이 좋지 않았던 반면, FBS를 최종 농도 2%, 5% 그리고 10%가 되게끔 포함시킨 배지에서의 바이러스의 증식은 서로간에 유의적인 차이가 없을 정도로 높은 바이러스 감염가를 나타내었다(Kim et al., 2018). VHSV의 증식 차이를 알아보기 위해 50% tissue culture infectious dose (TCID50 )를 측정한 실험에서 2% FBS가 포함된 배지를 사용되었는데 그이유는 10% FBS가 포함된 배지에 세포를 현탁하여 96-well plate를 만든 것보다 2% FBS가 포함된 배지에 현탁한 세포로 준비한 96-well plate에서 더높은 감염가를 나타내는 것을 확인하였기 때문이었다.
	전염성조혈기괴사증바이러스란 무엇인가?	전염성조혈기괴사증바이러스(infectious hema-topoietic necrosis virus, IHNV)는 Family Rhabdovir-idae, Genus Novirhabdovirus에 속하며, 약 11kb의 negative-sense RNA를 가진 탄환모양의 외막이 있는 바이러스이다 (Tordo et al., 2005).
	바이러스의 세포배양이 중요한 이유는 무엇인가?	현재 IHN을 진단하기 위한 방법으로서 세포배양법을 선행적으로 수행한 후 혈청학적 진단과 분자생물학적 진단을 수행하고 있다(OIE, 2018). 바이러스의 세포배양은 확정진단에 앞서 감염력 있는 바이러스의 배양을 통하여 바이러스의 존재를 확인함과 동시에 추가적으로 진행되는 혈청학적 및 분자생물학적 진단을 통한 확정진단을 수행하기 위한 전 작업으로서 중요한 의미가 있다. IHNV의 세포배양 시 10% fetal bovine serum (FBS)가 첨가된 배지를 사용하라고 명시되어 있는 반면, IPNV 의 경우에 현재 OIE aquatic manual 목록에서는 빠져 있으나 이전의 Aquatic manual (OIE, 2009)에 의하면 2% FBS가 첨가된 배지를 사용하는 것으로 되어 있어 두 바이러스 간에 차이가 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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