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문제 정의
- MS 마커는 가축의 유전적 다양성, 유연관계 및 품종식별의 연구에 있어서 매우 유용하다. 본 연구는 26개의 MS 마커를 이용하여 토종닭 브랜드 2집단(우리맛닭, 한협3호)과 토착종 순계 2집단(화이트 레그혼, 로드 아일랜드 레드)을 대상으로 집단내 및 집단간의 유전적 다양성, 계통유전학적 관계, 유전적 균일성 등을 검증하여 고유 유전자원으로서의 가치 구명 및 개체식별력이 높은 마커를 선별하여 토종닭 브랜드 계육의 생산이력시스템에 활용 가능한 기초 자료를 제시하고자 실시 하였다. 대립 유전자형 분석결과 총 191개 중 47개(24.
- 본 연구는 현재 국내에서 유통되고 있는 대표적인 토종닭 브랜드인 “우리맛닭”과 “한협 3호” 집단 및 도입 토착종 순계 화이트 레그혼, 로드 아일랜드 레드 집단을 대상으로 26종 MS 마커의 대립 유전자형을 조사하였다.
- 본 연구는 현재 국내에서 유통되고 있는 대표적인 토종닭 브랜드인 “우리맛닭”과 “한협 3호” 집단 및 도입 토착종 순계 화이트 레그혼, 로드 아일랜드 레드 집단을 대상으로 26종 MS 마커의 대립 유전자형을 조사하였다. 이러한 분석을 기초로 집단간의 유전적 차이와 분자생물학적 유연관계를 분석 하여 토종닭 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 토종닭 브랜드의 생산이력시스템에 활용 가능한 기초자료를 제시하고자 한다.
제안 방법
- 3개의 마커(LEI0192, MCW0111, MCW0183)는 단일 PCR을 수행하였고, 나머지 23개 마커는 증폭조건, 증폭산물크기, 형광표지를 고려하여 2~4개씩 multiplex 조합을 만든 후 Accupower-Dye PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 증폭하였다. 단일 및 multiplex PCR은 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, 조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation을 실시하고, 95℃에서 60초 denaturation, 58~63℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension을 35회 반복 후 72℃에서 15분 동안 final extension을 실시하였다.
- PCR 산물은 Hi-Di Foramide (Applied Biosystems, USA)와 GeneScan 500Liz Size Standard (Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 95℃에서 10분간 denaturation 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)에 loading 하여 POP-7 polymer (Aplied Biosystems, USA)상에서 모세관 전기영동을 수행 하였다.
- 계육의 브랜드 식별력 및 생산이력 시스템에 활용 가능성 검정을 위해 본 연구에 공시된 320수 닭을 무작위 교배 집단으로 가정하여 26개 MS 마커 유전자형의 동일개체 출현확률(PI), 부모 중 한쪽을 알 경우(PE1) 및 양 부모를 알고 있을 경우(PE2)의 친자감정확률을 추정하였으며, PI 값이 높은 순서대로 MS 마커 15, 12, 10, 9, 8, 7개를 선별하여 재분석한 결과를 Table 7에 제시하였다. 전체 26개의 마커를 사용하였을 경우 동일개체 출현확률은 1.
- 3개의 마커(LEI0192, MCW0111, MCW0183)는 단일 PCR을 수행하였고, 나머지 23개 마커는 증폭조건, 증폭산물크기, 형광표지를 고려하여 2~4개씩 multiplex 조합을 만든 후 Accupower-Dye PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 증폭하였다. 단일 및 multiplex PCR은 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, 조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation을 실시하고, 95℃에서 60초 denaturation, 58~63℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension을 35회 반복 후 72℃에서 15분 동안 final extension을 실시하였다.
- 본 연구에서는 토종닭 브랜드 우리맛닭(WR), 한협3호(HH)와 토착화된 토종닭 순계 화이트 레그혼(WL), 로드 아일랜드 레드(RIR) 집단에서 각각 80수씩 총 320수의 혈액을 시료로 공시하였으며, magnetic bead 기반의 DNA 추출 kit인 MagExtractor(TOYOBO, Japan)를 이용하여 추출된 DNA를 분석에 이용하였다. 집단간의 유연관계 및 개체식별력 분석에 사용된 MS 마커는 FAO (2011)에서 권고한 닭 상염색체상의 MS 마커 13종과 이전의 연구에서 다형성이 높게 보고된 마커 13종을 선별하여 총 26종(Table 1)을 이용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 토종닭 브랜드 우리맛닭(WR), 한협3호(HH)와 토착화된 토종닭 순계 화이트 레그혼(WL), 로드 아일랜드 레드(RIR) 집단에서 각각 80수씩 총 320수의 혈액을 시료로 공시하였으며, magnetic bead 기반의 DNA 추출 kit인 MagExtractor(TOYOBO, Japan)를 이용하여 추출된 DNA를 분석에 이용하였다. 집단간의 유연관계 및 개체식별력 분석에 사용된 MS 마커는 FAO (2011)에서 권고한 닭 상염색체상의 MS 마커 13종과 이전의 연구에서 다형성이 높게 보고된 마커 13종을 선별하여 총 26종(Table 1)을 이용하였다.
데이터처리
- 26개의 MS 마커의 대립 유전자형에 대한 각 개체간의 유연관계 분석은 Genetix version 4.05 (Belkhir 등, 2004)를 이용하여 요인대응분석(Factorial correspondence Analysis: FCA)을 하고 그 결과를 3차원으로 도식화하였다.
- GeneMapper (ver. 4.0) software (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 MS 마커에 대한 대립유전자의 정확한 크기를 결정하였으며, 그 결과는 Microsoft Excel (Microsoft, ver. 2007, USA)을 이용하여 집단 별로 취합한 후 각 통계분석 방법에 적용하였다.
- 공시된 320수의 개체가 실제 몇 개의 군락으로 분류가 가능한지를 추론하기 위해 STRUCTURE software로 K 값을 2에서 6까지 설정하여 20회 분석하고, 그 결과를 Evanno 등(2005)의 방법으로 최적의 K 값을 의미하는 ΔK 값을 계산 한 결과 K = 3에서 가장 높은 수치(396.63)를 보였다(Table 5).
- 먼저 분류 가능한 집단 수(K 값)를 추정하기 위해 각각의 K (K=2-6) 값에 대한 평균 추정치 Pr (X | K)와 표준편차를 계산하고, burn-in 50,000회, MCMC (markov chain monte carlo) 반복 수 100,000회, 이를 20회 반복하여 계산된 결과를 Evanno 등(2005)의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER program (Earl and Holdt, 2012)을 사용하여 ΔK 값을 계산하여 최적의 K 값을 결정 하고, 각 클러스터에 대한 집단의 실제분포를 추정 하였다.
- 분석된 320수 개체간의 유연관계는 대립유전자형 출현빈도를 기반으로 요인대응분석(Factorial correspondence Analysis: FCA)을 하였으며, 그 결과를 Fig. 1에 3차원으로 도식화하여 나타냈는데, 그 결과 집단 별 군집을 형성함을 확인할 수 있었다. WL과 RIR 개체들이 서로 가장 먼 위치에서 군집을 형성하고, 2개의 브랜드 집단이 WL 보다는 RIR 집단에 비교적 가까운 것을 확인할수 있었다.
- 집단간의 DA 유전거리(Nei 등, 1983), 친자감정률(probability of exclusion: PE) 및 무작위 교배집단에서의 동일개체 출현가능 확률 값(probability of identity: PI)은 GeneAlEx ver. 6.4 (Peakall and Smouse, 2006)및 API-CALC ver. 1.0 (Ayres and Overall, 2004)을 이용하여 계산하였다.
이론/모형
- MS tool Kit (Park, 2001)를 이용하여 다형성지수인 기대 이형 접합도(expected heterozygosity: HExp) 및 다형정보 지수(Polymorphic Information Content: PIC)를 계산하였으며, CONVERT package (Glaubitz, 2004)를 이용하여 좌위특이 대립 유전자의 수를 확인하였다.
- 공시된 4개 집단에 대한 유전적 균일성 및 실제분포 추정은 STRUCTURE software (Pritchard 등, 2000)를 이용하여 분석 하였다. 먼저 분류 가능한 집단 수(K 값)를 추정하기 위해 각각의 K (K=2-6) 값에 대한 평균 추정치 Pr (X | K)와 표준편차를 계산하고, burn-in 50,000회, MCMC (markov chain monte carlo) 반복 수 100,000회, 이를 20회 반복하여 계산된 결과를 Evanno 등(2005)의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER program (Earl and Holdt, 2012)을 사용하여 ΔK 값을 계산하여 최적의 K 값을 결정 하고, 각 클러스터에 대한 집단의 실제분포를 추정 하였다.
성능/효과
- 26개 MS마커 사용시 동일개체 출현확률(PI)은 1.17×10-49였다.
- LEI0192 및 MCW0240에서는 토종닭 브랜드 2집단 (WR, HH)에서만 집단특이 대립유전자가 발견되었다. 3품종 중국 닭(Ding, 2010), 24품종 영국 닭(Wilkinson 등, 2011), 에디오피아 닭(Goraga 등, 2011)의 결과와 비교해보면 집단특이 대립 유전자 수는 품종 및 분석된 마커에 따라서 상이하게 나타남을 확인할 수 있었다. 분석된 4개 집단에서 MS 마커의 평균 대립 유전자수는 7.
- 2)를 확인할 수 있었다. Table 6은 320수의 개체를 실제 집단 수와 동일하게 4개 군락으로 분류할 경우의 유전적 균일성 추정결과를 나타내고 있는데, 모든 집단에서 94% 이상의 균일성을 보였으며, 토착종 순계 집단은 98.6% (WL), 99.9% (RIR)의 높은 유전적 균일성을 나타냈다.
- 2. The results of Bayesian inference based on clustering among 320 individuals from Woorimatdag (WR), Hanhyup3 (HH), White Leghorn (WL), and Rhode Island Red (RIR) chicken populations. The number of assumed genetic clusters (K) ranges from 3 to 4.
- 1에 3차원으로 도식화하여 나타냈는데, 그 결과 집단 별 군집을 형성함을 확인할 수 있었다. WL과 RIR 개체들이 서로 가장 먼 위치에서 군집을 형성하고, 2개의 브랜드 집단이 WL 보다는 RIR 집단에 비교적 가까운 것을 확인할수 있었다. 브랜드 토종닭 WR과 HH 집단 각각의 군집을 형성하지만 매우 가까운 위치에 존재하며 일부 개체는 서로 중복되는 위치에 존재하는 것이 확인되었다.
- 공시된 320수 개체에 대한 요인대응분석(FCA) 결과 4개의 군집을 형성하였지만 2개 토종닭 브랜드 집단은 타 집단에 비해 매우 가까운 거리에 위치하고 있었으며, 집단간의 DA 유전거리 결과 또한 이와 동일했다. 각 집단에 대한 유전적 균일도는 모든 집단에서 94% 이상으로 높았다. 이상의 결과는 2개 토종닭 브랜드 집단은 유전적으로 유사하지만 토종닭 순계 집단과는 유전적인 차이가 크며, 순계 2집단 또한 유전적으로 확연히 분리됨을 증명 할 수 있다.
- 본 연구는 26개의 MS 마커를 이용하여 토종닭 브랜드 2집단(우리맛닭, 한협3호)과 토착종 순계 2집단(화이트 레그혼, 로드 아일랜드 레드)을 대상으로 집단내 및 집단간의 유전적 다양성, 계통유전학적 관계, 유전적 균일성 등을 검증하여 고유 유전자원으로서의 가치 구명 및 개체식별력이 높은 마커를 선별하여 토종닭 브랜드 계육의 생산이력시스템에 활용 가능한 기초 자료를 제시하고자 실시 하였다. 대립 유전자형 분석결과 총 191개 중 47개(24.6%)가 집단 특이 대립 유전자였으며, 다형성지수의 평균은 HExp=0.667, PIC=0.630으로 산출 되었다. 공시된 320수 개체에 대한 요인대응분석(FCA) 결과 4개의 군집을 형성하였지만 2개 토종닭 브랜드 집단은 타 집단에 비해 매우 가까운 거리에 위치하고 있었으며, 집단간의 DA 유전거리 결과 또한 이와 동일했다.
- 유전거리 계산 결과를 Table 4에 제시하였다. 분석결과 토종닭 브랜드 WR과 HH집단 간의 유전거리는 0.092로 가장 가까웠으며, 순계 집단인 WL과 RIR집단은 가장 먼 0.699였다. 토종닭 2집단 모두 WL과 비교적 먼 유전거리(WR: 0.
- 3품종 중국 닭(Ding, 2010), 24품종 영국 닭(Wilkinson 등, 2011), 에디오피아 닭(Goraga 등, 2011)의 결과와 비교해보면 집단특이 대립 유전자 수는 품종 및 분석된 마커에 따라서 상이하게 나타남을 확인할 수 있었다. 분석된 4개 집단에서 MS 마커의 평균 대립 유전자수는 7.35개로 관찰되었으며, 8개의 MS 마커 (LEI0094, LEI0096, LEI0192, MCW0145, MCW0183, MCW0214, MCW0240, MCW0301)에서는 10~13개의 많은 대립유전가수가 관찰된 반면, 4개 MS 마커(ADL0262, LEI166, MCW0103, MCW0165)에서는 3개 이하의 적은 대립유전자수가 관찰되었다. FAO (2011) 권고 마커인 MCW0103의 경우 중국 닭 15품종(Chen 등, 2008) 및 베트남 H'mong 닭(Cuc 등, 2006) 분석결과에서도 본 연구 결과와 동일하게 2개의 대립유전자가 관찰된 반면, 짐바브웨 닭(Muchadeyi 등, 2007)과 이탈리아 닭(Zanetti 등, 2007)은 4개가 관찰 되었다.
- WL과 RIR 개체들이 서로 가장 먼 위치에서 군집을 형성하고, 2개의 브랜드 집단이 WL 보다는 RIR 집단에 비교적 가까운 것을 확인할수 있었다. 브랜드 토종닭 WR과 HH 집단 각각의 군집을 형성하지만 매우 가까운 위치에 존재하며 일부 개체는 서로 중복되는 위치에 존재하는 것이 확인되었다. 이와 같은 결과는 Table 4의 결과와 동일하게 브랜드 집단과 토착종 집단은 브랜드 집단과 유전적으로 확연히 구분되는 것을 의미하며, 2개의 브랜드 집단 간의 유전적 차이는 상대적으로 적다는 것을 시사한다.
- 비록 본 연구에서 분석된 마커와 동일한 마커는 아니지만 12개의 마커를 분석한 본 연구의 결과(7.33×10-20)와 유사함을 확인할 수 있다.
- 63)를 보였다(Table 5). 이 결과는 분석된 집단이 유전적으로 실제 3개의 집단으로 분류할 수 있음을 나타내는데 이는 WL 및 RIR 집단은 별개의 집단이며, 브랜드 WR과 HH 집단은 유전적으로 하나의 집단임을 시사한다. 하지만 실제 분석된 집단과 동일한 K = 4에서는 4개의 집단이 별개의 군락을 형성하는 결과(Fig.
- 각 집단에 대한 유전적 균일도는 모든 집단에서 94% 이상으로 높았다. 이상의 결과는 2개 토종닭 브랜드 집단은 유전적으로 유사하지만 토종닭 순계 집단과는 유전적인 차이가 크며, 순계 2집단 또한 유전적으로 확연히 분리됨을 증명 할 수 있다. 26개 MS마커 사용시 동일개체 출현확률(PI)은 1.
- 279)를 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 토종닭 브랜드 2개 집단은 토착종 집단과는 유전적으로 확연히 구분된다는 것을 시사하며, 2개의 토종닭 브랜드 집단은 비교적 근접한 유전거리 즉, 유전적 차이가 적다는 것을 의미한다.
- 전체 26개의 마커를 사용하였을 경우 동일개체 출현확률은 1.17×10-49, 7개 마커는 1.83×10-8로 추정되었다.
- 집단간의 유전적 거리, 개체간의 요인대응분석, Bayesian법에 의한 군락분류 및 균일성 추정결과를 종합하면 2개 토종닭 브랜드 집단은 유전적으로 유사하지만 도입종인 토종닭 순계와는 유전적으로 차이가 크며, 순계 2집단 또한 유전적으로 확연히 분리됨을 증명할 수 있다.
- 토종닭 브랜드로 유통되고 있는 2개 집단과 토착화된 토종닭 순계 2개 집단을 대상으로 26종의 MS 마커로 분석한 결과, 각 마커에서 관찰된 대립유전자의 빈도를 Table 2에 제시하였으며, 각 집단에서 관찰된 대립유전자의 수와 집단에서 특이적으로 나타나는 대립유전자의 수를 Table 1에 제시하였다. 총 191개의 대립 유전자가 확인되었으며, 그 중 47개(24.6%)가 집단특이 대립유전자로, HH 집단에서는 타 집단에 비하여 약 2배 정도인 20개의 집단특이 대립유전자가 발견되었으며, LEI0092 및 MCW0252에서 발견된 7개는 타 집단에서는 전혀 발견되지 않은 집단특이 대립유전자였다. LEI0192 및 MCW0240에서는 토종닭 브랜드 2집단 (WR, HH)에서만 집단특이 대립유전자가 발견되었다.
- 699였다. 토종닭 2집단 모두 WL과 비교적 먼 유전거리(WR: 0.381, HH: 0.317)를 보였으며, RIR과는 상대적으로 가까운 유전거리(WR: 0.211, HH:0.279)를 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 토종닭 브랜드 2개 집단은 토착종 집단과는 유전적으로 확연히 구분된다는 것을 시사하며, 2개의 토종닭 브랜드 집단은 비교적 근접한 유전거리 즉, 유전적 차이가 적다는 것을 의미한다.
후속연구
- 99%)을 기반으로 한 돈육 브랜드 식별 및 원산지 추적가능성을 제시하였다. 2011년 기준으로 닭 사육수수 149,511,309수(MIFAFF, 2012)를 고려한 동일개체 출현 및 친자감별 확률에 있어 Table 7의 결과와 같이 9~12개 정도의 MS 마커 조합과 효율성이 우수한 multiplexing PCR 시스템을 확립한다면 토종닭 브랜드 식별 및 생산 이력시스템에 활용이 가능할 것으로 판단된다. 그러나 계육의 식별에 있어서 소 및 돼지와 동일하게 MS 마커 조합을 이용할 경우 경제적 효율성 문제로 인해 실현가능성이 어려운 실정이다.
- 본 연구에서 분석된 MS 마커 및 기존의 연구에서 보고된 mtDNA의 SNP를 기반으로 효율적인 Multiplexing PCR 시스템을 확립하고 그를 검증하는 연구가 진행된다면 실제 국내 토종닭 산업에 적용할 수 있는 계육의 브랜드 식별 및 생산이력 시스템 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 677로 계산되었으며, Ding 등(2010); Bao 등(2007)의 보고와 동일하게 2개의 마커(MCW0078, MCW0103)에서 비교적 낮은 다형정보량을 확인할 수 있다. 이 결과로 분석에 공시된 품종 및 분석된 마커에 따라 대립유전자의 특성이 다양하게 나타남을 확인할 수 있었으며, 다양한 품종 및 집단을 공시하여 토종닭 브랜드 집단의 대립유전자 빈도 차이 및 특이성을 고려하여 마커를 다수 선별한다면 브랜드 계육의 식별 가능성이 높아질 것으로 판단된다.
- 33×10-20이므로 개체식별 및 친자 감별이 가능할 것으로 사료된다. 향후 경제적 효율성을 고려하여 MS 마커 및 mtDNA의 SNP를 기반으로 multiplexing PCR 시스템을 확립을 위한 연구가 이행된다면 토종닭 브랜드육의 생산이력시스템에 적용이 가능할 것으로 판단된다.
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