선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 미역발효추출물이 HCT-15 세포 성장증식 억제효과가 apoptosis에 의한 결과인지 조사하기 위해 DNA 분절현상을 조사하였다. HCT-15 세포 (1.
- 이러한 결과는 미역 발효추출물의 활성성분을 대장암치료에 이용할 수 있는 가능성의 근거를 제시하는 것이다. 향후 대장암치료제로 미역발효추출물을 개발하기 위해서는 폭넓은 분자기전 연구에 관한 실험을 보충하여야 하고, 임상에서의항대장암효능을 입증하기 위하여 동물실험모델을 통하여 in vivo 실험연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이 등9)이 다시마 Laminaria religiosa 에서 추출한 fucoidan extract 가 apoptosis 와 세포증식에 효과가 있음을 보고하였으나, 미역 발효추출물의 항암작용에 대한 보고는 아직 없었다. 이에 본 연구에서는 미역 발효추출물의 항암작용을 알아보기 위하여, 미역발효추출물의 HCT-15 대장암세포에서의 세포증식 억제효과를 검색하고 세포증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위하여 DNA 분절검사 및 cell cycle, morphology의 변화를 알아보았으며, apoptosis 유도신호전달기전에 중요한 Bcl-2, Bax 그리고 caspase-3 의 발현양상을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Bcl-2의 발현 양을 측정하기 위해 1차 항체로서 Anti-Mouse Bcl-2 (Santa-Cruz), Anti-Rabbit Bax(Santa-Cruz) 와 Anti-Rabbit caspase-3 (Santa-Cruz)를 TTBS 용액에서 희석(1:1000또는 1:500)하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase) 가 결합된 Antimouse IgG(Vector)와 Rabbit-Antimouse IgG(Santa-Cruz)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30 분 간 반응시킨 후, TTBS로 4회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Co.)과 1 분간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
- 96-well microplate에 실험할 세포를 3.0×105 cells/㎖로 넣고, 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75, 100 ㎍/㎖의 농도로, Fucoidan을 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 4 일간 배양하였다.
- 1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2 시간동안 실시하였다. Bcl-2의 발현 양을 측정하기 위해 1차 항체로서 Anti-Mouse Bcl-2 (Santa-Cruz), Anti-Rabbit Bax(Santa-Cruz) 와 Anti-Rabbit caspase-3 (Santa-Cruz)를 TTBS 용액에서 희석(1:1000또는 1:500)하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase) 가 결합된 Antimouse IgG(Vector)와 Rabbit-Antimouse IgG(Santa-Cruz)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30 분 간 반응시킨 후, TTBS로 4회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Co.
- Different kinds of cells (1.0~3.0×105 cells/㎖) were treated with 1, 10, 30, 50 and 100 ㎍/㎖ of the Fucoidan for 4 days and measured for viability by MTT assay.
- Different kinds of cells (1.0~3.0×105 cells/㎖) were treated with 10, 30, 50, 75 and 100 ㎍/㎖ of the FUP extracts for 4 days and measured for viability by MTT assay.
- HCT-15 세포 (1.0 × 105 /㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역의 발효 추출물을 처리한 다음 6, 12, 24 시간동안 배양하였다.
- HCT-15 세포 (1.0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역발효추출물을 처리한 다음 6, 12, 24 시간동안 배양하고 Internucleosomal DNA분절현상을 agarose gel 전기영동을 통하여 조사하였다.
- HCT-15 세포 (1.0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역발효추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다.
- HCT-15 세포 (1.0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역의 발효 추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS(Phosphate Buffered Saline) 로 세척하였다.
- HCT-15 세포 (1.0 ×105/㎖)에 100 ㎍/㎖의 농도로 Fucoidan을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한후, apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 Hoechst 33342 용액으로 염색한 후 형광현미경하에서 관찰하였다.
- HCT-15 세포 (1.0 ×105/㎖)에 50 ㎍/㎖의 농도로 미역발효추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 Hoechst 33342 용액으로 염색한 후 형광현미경하에서 관찰하였다.
- HCT-15세포 (1.0 × 105/㎖)에 미역발효추출물은 50㎍/㎖의 농도로, Fucoidan은 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 Hoechst 33342 (H33342; Sigma, MO, USA) 용액을 가하여 37℃에서 10 분간 염색한 후 형광현미경 (IX-71, Olympus, Japan)하에서 관찰하였다17).
- HL-60/MX2 cells (1.0×106 cells/㎖) were treated 10, 30, 75 and 100 ㎍/㎖ of the FUP extracts and flow cytometry analysis of MX accumulation was performed as described in the materials and methods.
- HL-60/MX2(1.0 × 106 cells/㎖) 세포를 무혈청 배지와 함께 microtube에 넣은 후, 미역발효추출물을 10, 30, 75, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.
- Mitoxantrone 이라는 항암제에 내성을 가지고 있는 HL-60/MX2 세포에 10, 30, 75, 100 ㎍/㎖의 농도로 미역 발효추출물을 투여하고, 유세포분석기(FACS)를 통해 측정한 데이터로 control과 비교를 하였을 때, 항암제에 내성을 가진 HL-60/MX2 세포에는 억제효과가 없는 것으로 보였다 (Figure 9).
- 세포에 일률적으로 존재하는 β-actin 은 control 로 normalization으로 사용되었다. anti-apoptosis 유전자로 알려진 Bcl-2와 pro-apoptosis 유전자로 알려진 Bax의 protein level을 조사하였다. HCT-15 세포 (1.
- 여기에 150 ㎕ dimethylsulfoxide(DMSO : Sigma, MO, USA)를 가하여 침전물을 용해시킨 다음 microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식억제 정도를 조사하였다15). 그 중 가장 효과적인 대장암세포에 대하여 미역발효추출물의 세포사멸을 실험하였다.
- 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식억제 정도를 조사하였다15). 그 중 가장 효과적인 대장암세포에 대하여 미역발효추출물의 세포사멸을 실험하였다.
- 0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역의 발효 추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS(Phosphate Buffered Saline) 로 세척하였다. 그 후 -20℃에서 70% ethanol로 30분 동안 고정 시키고 PBS 세척 후 RNase A (1 ㎎/㎖)를 처리한 다음에 propidium iodide (PI; Sigma, MO, USA)로 염색하고, Coulter EPICS XLTM Flow Cytometer (Coulter, Miami, FL, USA)로 세포주기를 분석하였다16).
- 미역발효추출물을 HCT-15 세포에 각각 50 ㎍/㎖농도로 6, 12, 24 시간 동안 처리하여 DNA ladder를 확인한 결과, 미역발효추출물 처리군에서 뚜렷한 DNA ladder를 관찰할 수 있었다. 그리고 HCT-15 세포의 DNA 분절을 유도하는 미역발효추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 다음, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다. 그 결과, 미역발효추출물 처리에 의하여 apoptotic 세포, 즉 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는 것을 확인하였다.
- . 미역발효추출물 처리에 의하여 HCT-15 세포의 apoptosis가 유도되는지 DNA 분절현상을 전기영동으로 관찰 하였다. 미역발효추출물을 HCT-15 세포에 각각 50 ㎍/㎖농도로 6, 12, 24 시간 동안 처리하여 DNA ladder를 확인한 결과, 미역발효추출물 처리군에서 뚜렷한 DNA ladder를 관찰할 수 있었다.
- 미역발효추출물에 의한 HCT-15 대장암 세포의 apoptosis 유도 기전을 밝히기 위해 anti-apoptosis 유전자로 알려진 Bcl-2와 pro-apoptosis 유전자로 알려진 Bax의 protein level을 조사하였다. Bcl-2 Family는 미토콘드리아로부터 apoptosis 동안에 AIF (apoptosis induced factor)와 cytochrome c의 방출을 방해함으로써 apoptosis를 방지한다.
- . 미역발효추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 6, 12, 24, 48 시간 동안 처리하고, western blot방법을 이용하여 caspase-3 발현변화를 관찰한 결과 처리 군에서 12 시간부터 caspase-3가 cleavage 되는 것을 확인하였다. 즉 cleaved caspase-3가 시간 의존적으로 활성화되어 apoptosis가 이루어짐으로써 HCT-15 대장암세포의 성장증식을 억제함을 알 수 있다.
- 미역발효추출물이 HCT-15 대장암세포의 apoptosis 유도 효과 및 기전에 미치는 영향을 분자생물학적 방법으로 실험하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 2 g 투입하여 40℃~45℃에서 6 시간 발효하였다. 발효 후 125℃로 30 분 가열하여 미생물과 효소를 멸균하고 불활성화하여 얻은 미역발효추출물을 냉동건조 분말하였다. 이 분말을 원하는 농도에 따라 물에 용해시킨 후 실험용 배지로 희석하여 사용 하였다.
- 세포를 수집한 후 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, WI, USA)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.5% agarose gel에서 40 분 (100 V)동안 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하고 UV transilluminator (Spectronics Corporation Westbury, NY, USA)하에서 DNA fragmentation 현상을 관찰 하였다.
- 세포 밖으로 약물을 배출함으로써 약물의 축적을 감소시키는 세포막 이동능을 FACS를 이용하여 간접적으로 측정하였다. HL-60/MX2(1.
- 37℃, 5% CO2 항온기에서 30분 동안 배양한 후 5 µM mitoxantrone 이 되도록 처리하고 30 분 동안 재배양하였다. 세포 부유액을 차가운 PBS 용액으로 3번 세척한 후 500 ㎕ PBS 로 부유한 다음, 유세포분석기로 형광을 나타내는 세포를 측정하였다.
- 0 × 105 /㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역의 발효 추출물을 처리한 다음 6, 12, 24 시간동안 배양하였다. 세포를 수집한 후 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, WI, USA)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.
- 세포의 성장증식에 대한 Fucoidan의 효과를 MTT assay로 검색하였다. HCT-15, MCF-7, HL-60, A549, HL-60/ADR, HEL-299 에서 Fucoidan을 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포 증식 억제 효과를 검색한 결과, HCT-15 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 62% 이상의 growth inhibition 값을 보였고, MCF-7 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 34%, HL-60 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 52%, A549 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 65% 이상의 growth inhibition 값을 보였다.
- 세포의 성장증식에 대한 미역발효추출물과 후코이단(The fucoidan from Fucus vesiculosus, 이하 Fucoidan으로 표기)의 효과를 비교하기 위하여 MTT(Sigma, MO, USA)의 환원에 따른 formazan 침전물(N,N'-diphenyl-formazyl-benzene)의 생성 정도로 세포 독성을 검색하였다.
- 그 약리학적 작용은 혈압과 혈중 콜레스테롤 수치를 내리며, 갑상선 기능 부족을 바로 잡고, 조직이나 혈액에 들어간 후 병리적 산물의 흡수를 촉진시켜 병태조직을 붕괴하고 용해시키는 작용을 하고1), 항암작용8) 뿐만 아니라 apoptosis 유도작용도 알려져 있다9). 이와 같이 효능이 우수하고 식용으로 애용하는 미역을 가지고 발효한 추출액을 대장암에 적용하여 보았다.
대상 데이터
- 0×105 cells/㎖) were treated with 10, 30, 50, 75 and 100 ㎍/㎖ of the FUP extracts for 4 days and measured for viability by MTT assay. All experiments were performed in triplicate. Data were presented as means ± SD from three separate experiments.
- HCT-15(human colon cancer), MCF-7(human breast cancer), HL-60(human promyelocytic leukemia), HL-60/MX2(mitoxantrone resistant human promyelocytic leukemia), HL-60/ADR(adriamycin resistant human promyelocytic leukemia), A549(human lung carcinoma) 그리고 정상 세포주인 HEL-299(human embryonic lung cell)를 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank), ATCC(American type culture collection)과 내성세포연구센터(Research Center for Resistant Cells)로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 배지는 100 units/㎖의 Penicillin-Streptomycin(GIBCO Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO Inc, NY, USA)을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하였다.
- HCT-15(human colon cancer), MCF-7(human breast cancer), HL-60(human promyelocytic leukemia), HL-60/MX2(mitoxantrone resistant human promyelocytic leukemia), HL-60/ADR(adriamycin resistant human promyelocytic leukemia), A549(human lung carcinoma) 그리고 정상 세포주인 HEL-299(human embryonic lung cell)를 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank), ATCC(American type culture collection)과 내성세포연구센터(Research Center for Resistant Cells)로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 배지는 100 units/㎖의 Penicillin-Streptomycin(GIBCO Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO Inc, NY, USA)을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 배양은 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 Penicillin-Streptomycin(GIBCO Inc, USA), FBS(GIBCO Inc, USA), Trypsine(GIBCO Inc, USA), RPMI 1640(GIBCO Inc, USA), MTT(Sigma, USA), DMSO(Sigma, USA), PI(Sigma, USA), H33342(Sigma, USA), Fucoidan(Sigma, USA), Caspase Detection Kit(Sigma, USA), Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA), Bio-Rad Protein assay Kit(BIO-RAD, USA), Anti-Mouse Bcl-2(Santa-Cruz, USA), Anti-Rabbit Bax(Santa-Cruz, USA), Anti-Rabbit caspase-3(Santa-Cruz, USA), Rabbit-Antimouse IgG(Santa-Cruz, USA) 등이다. 본 실험에 사용된 기기는 Microplate Reader(Amersham Pharmacia Biotech, USA), UV transilluminator(Spectronics Corporation Westbury, USA), Coulter EPICS XLTM Flow Cytometer(Coulter, USA), round bottom test tube(Sigma, USA), 형광현미경(Olympus, Japan) 등이다.
- 본 실험에 사용된 기기는 Penicillin-Streptomycin(GIBCO Inc, USA), FBS(GIBCO Inc, USA), Trypsine(GIBCO Inc, USA), RPMI 1640(GIBCO Inc, USA), MTT(Sigma, USA), DMSO(Sigma, USA), PI(Sigma, USA), H33342(Sigma, USA), Fucoidan(Sigma, USA), Caspase Detection Kit(Sigma, USA), Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA), Bio-Rad Protein assay Kit(BIO-RAD, USA), Anti-Mouse Bcl-2(Santa-Cruz, USA), Anti-Rabbit Bax(Santa-Cruz, USA), Anti-Rabbit caspase-3(Santa-Cruz, USA), Rabbit-Antimouse IgG(Santa-Cruz, USA) 등이다. 본 실험에 사용된 기기는 Microplate Reader(Amersham Pharmacia Biotech, USA), UV transilluminator(Spectronics Corporation Westbury, USA), Coulter EPICS XLTM Flow Cytometer(Coulter, USA), round bottom test tube(Sigma, USA), 형광현미경(Olympus, Japan) 등이다.
- 제주도 서귀포시 우도면 앞바다에서 자생하는 미역(U. pinnatifida)을 2006년도 겨울에 채취하였으며, 채취한 미역을 水洗하여 염분과 이물질을 제거한 후 수분함량이 5~10%되게 자연건조 보관 후 사용하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻은 결과를 Student’s t-test를 이용하여 통계 처리하였고, p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포의 성장증식에 대한 미역발효추출물의 효과를 MTT assay로 검색하였다. HCT-15, MCF-7, HL-60, HL-60/MX2, HL-60/ADR, HEL-299 에서 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포 증식 억제 효과를 검색한 결과, HCT-15 세포에 처리한 50 ㎍/㎖에서부터 50% 이상의 growth inhibition 값을 보였고, MCF-7과 HL-60 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서도 40% 이상의 growth inhibition을 보였다.
- 우선 미역발효추출물의 HCT-15 세포증식에 대한 억제 효과는 MTT assay를 이용하여 검색하였다. 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75 및 100 ㎍/㎖의 농도로 HCT-15 세포에 처리한 결과, 100 ㎍/㎖의 농도에서 68% 로 가장 높은 HCT-15 세포 증식 저해 효과를 보였다.
- 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75 및 100 ㎍/㎖의 농도로 HCT-15 세포에 처리한 결과, 100 ㎍/㎖의 농도에서 68% 로 가장 높은 HCT-15 세포 증식 저해 효과를 보였다. 정상 세포의 증식을 억제하는지 알아보기 위하여 HEL-299에 같은 방법으로 미역발효추출물을 처리하여 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 30 ㎍/㎖의 농도에서는 1%, 50 ㎍/㎖의 농도에서는 4%, 75 ㎍/㎖의 농도에서는 21%, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 23%까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다.
성능/효과
- 1. 미역발효추출물은 HCT-15 대장암세포의 성장증식을 효과적으로 억제하였으나, HEL-299 정상세포에서는성장억제효과가 적었다.
- 2. DNA분절검사에서 DNA ladder가 나타나며, 세포주기 변화측정에서는 sub-G1 hypodiploid cells이 증가하였으며, 핵의 형태학적 변화에서는 세포와 chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화가 뚜렷하게 확인 되었고, western blot에서는 Bcl-2가 감소하고, Bax 단백질이 증가하였다. 또 caspase-3의 cleavage가 확인되어 caspase-3의 활성을 확인하였다.
- 3. HCT-15 대장암세포의 caspase-3의 활성이 일어나고, Bcl-2가 감소되는 apoptosis 유도기전을 보임으로써 HCT-15 대장암세포의 증식억제를 확인할 수 있었다.
- 4. 미역발효추출물은 적은 농도에서도 HCT-15 대장암세포가 자연사멸 되었고, 양약에 내성이 생기지 않은 암세포에 더욱 효과가 있었다.
- HEL-299에서는 50 ㎍/㎖의 농도에 9%, 100 ㎍/㎖의 농도에 11% 까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. Fucoidan도 HEL-299 세포보다 HCT-15 대장암 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HCT-15 대장암 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299 세포의 증식은 4% 이하로 억제 되었다. 이상의 결과로 대장암세포에서는 미역발효추출물이 Fucoidan보다 적은 농도에서 좋은 효과를 보인다.
- HCT-15 세포 (1.0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖의 농도로 미역발효추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, western blot방법을 이용 하여 Bcl-2와 Bax 발현 변화를 관찰한 결과, 처리군에서 Bcl-2 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Bax 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다 (Figure 7).
- 세포의 성장증식에 대한 Fucoidan의 효과를 MTT assay로 검색하였다. HCT-15, MCF-7, HL-60, A549, HL-60/ADR, HEL-299 에서 Fucoidan을 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포 증식 억제 효과를 검색한 결과, HCT-15 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 62% 이상의 growth inhibition 값을 보였고, MCF-7 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 34%, HL-60 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 52%, A549 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 65% 이상의 growth inhibition 값을 보였다. 또한 HL-60/ADR 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 62% 그리고 정상 세포주에 대한 세포 독성실험을 위해 HEL-299 세포에 Fucoidan 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 가장 높은 농도인 100 ㎍/㎖에서 약 11% 정도의 세포 독성을 보였다(Figure 2).
- 세포의 성장증식에 대한 미역발효추출물의 효과를 MTT assay로 검색하였다. HCT-15, MCF-7, HL-60, HL-60/MX2, HL-60/ADR, HEL-299 에서 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포 증식 억제 효과를 검색한 결과, HCT-15 세포에 처리한 50 ㎍/㎖에서부터 50% 이상의 growth inhibition 값을 보였고, MCF-7과 HL-60 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서도 40% 이상의 growth inhibition을 보였다. 그리고 정상 세포주에 대한 세포 독성 실험을 위해 HEL-299 세포에 미역발효추출물 10, 30, 50, 75, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 가장 높은 농도인 100 ㎍/㎖에서 약 20% 정도의 세포 독성을 보였다 (Figure 1).
- 미역발효추출물과 Fucoidan의 항암효과를 비교하기 위해서, Fucoidan을 1, 10, 30, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 HCT-15 세포에 처리한 결과, 100 ㎍/㎖의 농도에서 62%로 가장 높은 HCT-15 세포 증식 저해 효과를 보였다. HEL-299에서는 50 ㎍/㎖의 농도에 9%, 100 ㎍/㎖의 농도에 11% 까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. Fucoidan도 HEL-299 세포보다 HCT-15 대장암 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HCT-15 대장암 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299 세포의 증식은 4% 이하로 억제 되었다.
- 정상 세포의 증식을 억제하는지 알아보기 위하여 HEL-299에 같은 방법으로 미역발효추출물을 처리하여 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 30 ㎍/㎖의 농도에서는 1%, 50 ㎍/㎖의 농도에서는 4%, 75 ㎍/㎖의 농도에서는 21%, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 23%까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. 미역발효추출물이 HEL-299 세포보다 HCT-15 대장암 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HCT-15대장암 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299세포의 증식은 4% 이하로 억제 되었다.
- 0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 미역발효추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다. 그 결과, apoptotic 세포, 즉 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는 것을 확인하였다(Figure 4).
- 그리고 HCT-15 세포의 DNA 분절을 유도하는 미역발효추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 다음, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다. 그 결과, 미역발효추출물 처리에 의하여 apoptotic 세포, 즉 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는 것을 확인하였다. 이것으로 보아 이 추출물에 의하여 HCT-15 세포의 apoptosis가 유도되는 것으로 보인다.
- HCT-15, MCF-7, HL-60, HL-60/MX2, HL-60/ADR, HEL-299 에서 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포 증식 억제 효과를 검색한 결과, HCT-15 세포에 처리한 50 ㎍/㎖에서부터 50% 이상의 growth inhibition 값을 보였고, MCF-7과 HL-60 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서도 40% 이상의 growth inhibition을 보였다. 그리고 정상 세포주에 대한 세포 독성 실험을 위해 HEL-299 세포에 미역발효추출물 10, 30, 50, 75, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 가장 높은 농도인 100 ㎍/㎖에서 약 20% 정도의 세포 독성을 보였다 (Figure 1).
- 이것으로 보아 이 추출물에 의하여 HCT-15 세포의 apoptosis가 유도되는 것으로 보인다. 동일한 처리 방법으로 apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 H33342를 이용한 핵염색으로 조사한 결과, 미역의 발효추출물 처리에 의하여 cell shrinking, chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들이 뚜렷하게 확인 되었다. 또 Fucoidan을 이용하여 apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 관찰하려 하였지만, 50 ㎍/㎖ 농도로는 잘 나타나지 않아 100 ㎍/㎖ 농도로 H33342를 이용한 핵염색으로 조사한 결과, cell shrinking, chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들이 12 hr 이후부터 뚜렷하게 확인 되었다.
- 그러나 표에서 보듯이 농도 별로 처리를 해보았지만 그런 결과를 보이지 않았다. 따라서 미역발효추출물이 항암제에 내성을 가진 HL-60/MX2세포에는 억제효과가 없는 것으로 보였다. 항암제에 내성을 가진 HL-60/ADR는 미역발효추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서 12% 로 억제력이 저조하나, Fucoidan은 62% 로 억제효과를 보였다.
- 동일한 처리 방법으로 apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 H33342를 이용한 핵염색으로 조사한 결과, 미역의 발효추출물 처리에 의하여 cell shrinking, chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들이 뚜렷하게 확인 되었다. 또 Fucoidan을 이용하여 apoptosis 동안에 나타나는 형태학적 변화를 관찰하려 하였지만, 50 ㎍/㎖ 농도로는 잘 나타나지 않아 100 ㎍/㎖ 농도로 H33342를 이용한 핵염색으로 조사한 결과, cell shrinking, chromatin 응축 및 apoptotic body 등과 같은 형태학적 변화들이 12 hr 이후부터 뚜렷하게 확인 되었다.
- HCT-15, MCF-7, HL-60, A549, HL-60/ADR, HEL-299 에서 Fucoidan을 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포 증식 억제 효과를 검색한 결과, HCT-15 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 62% 이상의 growth inhibition 값을 보였고, MCF-7 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 34%, HL-60 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 52%, A549 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 65% 이상의 growth inhibition 값을 보였다. 또한 HL-60/ADR 세포에 처리한 100 ㎍/㎖에서 62% 그리고 정상 세포주에 대한 세포 독성실험을 위해 HEL-299 세포에 Fucoidan 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과 가장 높은 농도인 100 ㎍/㎖에서 약 11% 정도의 세포 독성을 보였다(Figure 2).
- 미역발효추출물과 Fucoidan의 항암효과를 비교하기 위해서, Fucoidan을 1, 10, 30, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 HCT-15 세포에 처리한 결과, 100 ㎍/㎖의 농도에서 62%로 가장 높은 HCT-15 세포 증식 저해 효과를 보였다. HEL-299에서는 50 ㎍/㎖의 농도에 9%, 100 ㎍/㎖의 농도에 11% 까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다.
- 0 × 105/㎖)에 50 ㎍/㎖의 농도로 미역발효추출물을 처리한 다음 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양한 후, western blot방법을 이용 하여 Bcl-2와 Bax 발현 변화를 관찰한 결과, 처리군에서 Bcl-2 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Bax 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다 (Figure 7). 미역발효추출물은 HCT-15 세포의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HCT-15 세포의 성장 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.
- 우선 미역발효추출물의 HCT-15 세포증식에 대한 억제 효과는 MTT assay를 이용하여 검색하였다. 미역발효추출물을 10, 30, 50, 75 및 100 ㎍/㎖의 농도로 HCT-15 세포에 처리한 결과, 100 ㎍/㎖의 농도에서 68% 로 가장 높은 HCT-15 세포 증식 저해 효과를 보였다. 정상 세포의 증식을 억제하는지 알아보기 위하여 HEL-299에 같은 방법으로 미역발효추출물을 처리하여 MTT assay를 수행하였다.
- 특히 세포사멸을 촉진하는 여러 가지 조건 아래서도 세포가 지속적으로 생존하는 것으로 봐서 Bcl-2가 세포생존에 중요한 역할을 한다고 판단하였고, 이어서 Bcl-2의 역할이 세포의 apoptosis를 억제하기 때문이라는 것이 증명되었다25). 미역발효추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 6, 12, 24, 48 시간 동안 처리하고, western blot방법을 이용하여 Bcl-2와 Bax 발현 변화를 관찰한 결과, 처리 군에서 시간 의존적으로 Bcl-2 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Bax 발현은 증가됨을 확인할수 있었다. 미역의 발효추출물은 HCT-15 대장암 세포의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HCT-15 대장암세포의 성장 증식을 억제함을 확인할수 있었다.
- 미역발효추출물 처리에 의하여 HCT-15 세포의 apoptosis가 유도되는지 DNA 분절현상을 전기영동으로 관찰 하였다. 미역발효추출물을 HCT-15 세포에 각각 50 ㎍/㎖농도로 6, 12, 24 시간 동안 처리하여 DNA ladder를 확인한 결과, 미역발효추출물 처리군에서 뚜렷한 DNA ladder를 관찰할 수 있었다. 그리고 HCT-15 세포의 DNA 분절을 유도하는 미역발효추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 다음, DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 세포주기를 유세포 분석기로 조사하였다.
- 그 결과, 30 ㎍/㎖의 농도에서는 1%, 50 ㎍/㎖의 농도에서는 4%, 75 ㎍/㎖의 농도에서는 21%, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 23%까지 HEL-299 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. 미역발효추출물이 HEL-299 세포보다 HCT-15 대장암 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HCT-15대장암 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299세포의 증식은 4% 이하로 억제 되었다.
- 미역발효추출물을 50 ㎍/㎖ 농도로 6, 12, 24, 48 시간 동안 처리하고, western blot방법을 이용하여 Bcl-2와 Bax 발현 변화를 관찰한 결과, 처리 군에서 시간 의존적으로 Bcl-2 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, Bax 발현은 증가됨을 확인할수 있었다. 미역의 발효추출물은 HCT-15 대장암 세포의 Bcl-2 level을 down-regulation하여 apoptosis를 유도함으로써 HCT-15 대장암세포의 성장 증식을 억제함을 확인할수 있었다.
- Fucoidan도 HEL-299 세포보다 HCT-15 대장암 세포의 증식을 더 강력히 억제하는 것을 알 수 있으며, HCT-15 대장암 세포의 증식을 50% 억제하는 농도에서는 HEL-299 세포의 증식은 4% 이하로 억제 되었다. 이상의 결과로 대장암세포에서는 미역발효추출물이 Fucoidan보다 적은 농도에서 좋은 효과를 보인다.
- 따라서 미역발효추출물이 항암제에 내성을 가진 HL-60/MX2세포에는 억제효과가 없는 것으로 보였다. 항암제에 내성을 가진 HL-60/ADR는 미역발효추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서 12% 로 억제력이 저조하나, Fucoidan은 62% 로 억제효과를 보였다. 이러한 결과로 보아 미역발효추출물은 양약에 내성이 생기지 않은 암세포에 더욱 효과가 있다.
후속연구
- 미역발효추출물은 in vitro 실험에서 대장 암세포에 대하여 항암효과가 인정되었으므로, 미역발효추출물을 항암에 응용할수 있을 것으로 사료되며, 미역발효추출물의 임상에서의 항대장암효능을 입증하기 위하여 동물실험모델을 통하여 실험연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이러한 결과는 미역 발효추출물의 활성성분을 대장암치료에 이용할 수 있는 가능성의 근거를 제시하는 것이다. 향후 대장암치료제로 미역발효추출물을 개발하기 위해서는 폭넓은 분자기전 연구에 관한 실험을 보충하여야 하고, 임상에서의항대장암효능을 입증하기 위하여 동물실험모델을 통하여 in vivo 실험연구가 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.