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문제 정의
- 본 연구에서는 미 역귀를 추출, 각 용매별로 분획하여 항균 효과와 암세포 성장억제 및 QR 유도활성 효과 등의 생리활 성을 연구하였다. 미 역은 일반적으로 콜레스테롤 배출 작용, 중금속(Cd) 및 방사능 물질(Sr)의 체내 흡수 억 제, 배출 작용 과 정 장 작용이 있으므로 식 이 섬유 식 품으로서 효과가 많다.
- 특히 미역의 부위 중 알긴산 함량이 높은 미역귀는 일부 식용으로는 사용하고 있으나 거의 대부분 식품개발품에서 소외 되고 있는 점 에 착안하여 본 연구를 시도하게 되 었으며 특히 미역귀가 가지는 항균활성을 측정하고 암세포 증식억 제 (cytotoxicity) 효과와 암예방 효소계 인 quinone reductase 의 유도효과를 연구하여 식용으로는 많이 쓰이지 않으나 기 능성 식품으로서의 개발 가능성을 타진해 보았다.
제안 방법
- 이를 위해 각 세포 주를 1X IO, cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL 씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양 한 후 용매 종류별 분획 물을 각각 일정 량의 dimethyl sulfoxide ①MSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250 μg/mL의 농도로 첨 가하였다. 48시간 동안 배 양한 후 각 well에 PBS 완충액 에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 UL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan0] 홑어 지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼 합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spec- trophotometer를 이용하여 570 nm, 690 nm에서 각각 흡광 도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대 적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 자궁경부암 세포인 HeLa(human cervices adenocarcinoma), 대장암 세포인 HT- 29, 유방암 세포인 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 간암 세 포인 HepG2(human hepatocellular carcinoma)이며 2004년 8월 부산대학교 의과대학 생화학교 실에서 제공받았다. HeLa, HT-29, MCF-7 및 HepG2 세포 주는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum (FBS) 100 mL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin 10 mL/} 함유된 배지를 사용하여, 37℃ 5% CO2 incubator에서 mono- layer로 배양하였다.
- HepG2 세포를 세포배양용 petridish 에 24시간동안 안정 화시 킨 다음 미 역 귀 분획 물을 60, 120, 180, 240 및 300 Ug/ mL씩 농도별로 처리 하여 48시간동안 배양한 후, 위상차 현 미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 괴사형태 변화를 관찰한 후 사진 촬영하였다.
- 5% pyridine, 5 mM potassium phosphate(pH 7.4) 혼합액 을 25。JiL씩 첨가하여 효 소반응을 정 지 시 키 고 UV-visible spectrophotometer를 이 용 하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.
- QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법 (17) 을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2 세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1 X 104 cells/mL 되 도록 HepG2 세포를 분주하여 , 37 ℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배 양한 후 미 역 귀 추출 물을 각각 DMSO에 녹여 80, 160, 240 및 320 Ug/mL의 농도 로 첨가하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거 하였다.
- 항균성 시 험용 평 판배 지는 멸균 후 petri dish에 20 mL씩 분주하여 응고시키고 전배양한 각종 시 험균을 무균적으로 첨가하여 기층용 배지 위에 다시 10 mL씩 분주하여 2중의 평 판배지를 만들었다. 각 용매 분획 별 추출물의 농도를 1,000에서 2, 500 Ug/mL로 증 량시 키면서 멸균된 disc(직경 8 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) 에 흡수, 건조시켜 균주가 도말된 plate 표면에 올려놓은 후 37℃ incubator에서 24시간 배 양하여 disc 주위에 생 성 된 clear zone의 직경 (mm)으로부터 각 분획 물의 항균활성을 측정 하 였으며 이 실험을 5회 반복하여 평균치를 나타내었다.
- 미역귀의 분획물 첨가에 HepG2 세포주의 형태가 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여 여러 농도의 미역귀 methanol 추출물(UPM)을 48시간동안 처리한 후 위상차현미경을 이용하여 암세포의 형태를 관찰하였다. Fig.
- 이 시료를 추출 . 분획 하여 각 균주에 대한 항균효과와 암 세포주에 대한 암세포 증식 억 제 효과(cytotoxicity) 및 quinone reductase(QR) 유도 물질 검색에 사용하였다.
- 시료로 사용된 미 역귀는 건조 후 분말화 하여 methanol을 첨가한 후 37℃에서 진탕한 후 4시간 동안 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 미역귀의 methanol 추출물(UPM)을 얻고, 이 추출물을 각 용매별로 분획하여 hexane층(UPMH), methanol층(UPMM), butanol층(UPMB) 및 수층분획 물(UPMA)로 각각 분획 하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
- MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 de- hydrogenase가 황색 수용성 물질 인 MTT에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한다. 이를 위해 각 세포 주를 1X IO, cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL 씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양 한 후 용매 종류별 분획 물을 각각 일정 량의 dimethyl sulfoxide ①MSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200 및 250 μg/mL의 농도로 첨 가하였다. 48시간 동안 배 양한 후 각 well에 PBS 완충액 에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 UL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan0] 홑어 지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼 합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spec- trophotometer를 이용하여 570 nm, 690 nm에서 각각 흡광 도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대 적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법 (17) 을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2 세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1 X 104 cells/mL 되 도록 HepG2 세포를 분주하여 , 37 ℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배 양한 후 미 역 귀 추출 물을 각각 DMSO에 녹여 80, 160, 240 및 320 Ug/mL의 농도 로 첨가하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거 하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 UL의 lysis bufferdO mM Tris-HCl, pH 8.
- 계통분획 추출물의 항균성 검 색은 paper disc method] 16) 를 이용하였으며, 사용균주는 단백질 식품과 식중독 원인균 인 Proteus mirabilis, 식 중독 원 인균인 Staphylococcus aureus, 단백질 식품 부패 원 인균인 Serratia marcescens 균이 었으 며, 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배 지 는 Nutrient agar (Difco), Yeast extract을 사용하였다. 항균성 시 험용 평 판배 지는 멸균 후 petri dish에 20 mL씩 분주하여 응고시키고 전배양한 각종 시 험균을 무균적으로 첨가하여 기층용 배지 위에 다시 10 mL씩 분주하여 2중의 평 판배지를 만들었다. 각 용매 분획 별 추출물의 농도를 1,000에서 2, 500 Ug/mL로 증 량시 키면서 멸균된 disc(직경 8 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
대상 데이터
- QR 유도 활성 측정 을 보다 신속하고 정확하게 측정 하기 위해 본 실험에서는 유일하게 QR 유도활성을 가진 인체간 암세포주인 HepG2를 사용하여 실험을 행하였으며, 그 결과는 Fig. 6에 나타내었다.
- 본 실험에 사용된 미역귀 (Undariapinnatifida Sporophyll) 는 2004년 5월 전남 무안군에 위치한 (주)삼일물산에서 공급 받아 사용하였다. 이 시료를 추출 .
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 자궁경부암 세포인 HeLa(human cervices adenocarcinoma), 대장암 세포인 HT- 29, 유방암 세포인 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 간암 세 포인 HepG2(human hepatocellular carcinoma)이며 2004년 8월 부산대학교 의과대학 생화학교 실에서 제공받았다. HeLa, HT-29, MCF-7 및 HepG2 세포 주는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum (FBS) 100 mL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin 10 mL/} 함유된 배지를 사용하여, 37℃ 5% CO2 incubator에서 mono- layer로 배양하였다.
- 암세 포 증식 억 제 실험에 사용된 시 약 중 NP-40과 mena- dionee Sigma사(St. Louis, USA) 제품을 사용하였고 flavin adenine dinucleotide(FAD), dicumarol 및 glucose-6-phos- phate dehydrogenase는 Amresco사(USA) 제품을 구입 하였으며, minimum essential medium(MEM), Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)과 phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island Biologic Co., USA)에서 구 입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.
이론/모형
- 계통분획 추출물의 항균성 검 색은 paper disc method] 16) 를 이용하였으며, 사용균주는 단백질 식품과 식중독 원인균 인 Proteus mirabilis, 식 중독 원 인균인 Staphylococcus aureus, 단백질 식품 부패 원 인균인 Serratia marcescens 균이 었으 며, 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배 지 는 Nutrient agar (Difco), Yeast extract을 사용하였다. 항균성 시 험용 평 판배 지는 멸균 후 petri dish에 20 mL씩 분주하여 응고시키고 전배양한 각종 시 험균을 무균적으로 첨가하여 기층용 배지 위에 다시 10 mL씩 분주하여 2중의 평 판배지를 만들었다.
- 4) 혼합액 을 25。JiL씩 첨가하여 효 소반응을 정 지 시 키 고 UV-visible spectrophotometer를 이 용 하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.
- 미역귀 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 세포의 생 육을 측정하는 MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-di- phenyl tetrazolium bromide) assay를 사용하여 행하였다. MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 de- hydrogenase가 황색 수용성 물질 인 MTT에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한다.
성능/효과
- 63%의 높은 효과를 나타내었다. Fig. 3은 유방암세포주인 MCF-7의 결과이며, 이 경우에도 정도의 차이는 있었으나 HeLa와 HT-29 세포 주의 경우와 같이 UPMM에서 그 효과가 나타났으며 최종첨 가농도인 500 μg/mL을 첨 가했을 때 HeLa와 HT-29 세포주 에 비해서는 낮은 62.42%의 효과를 나타내었다. Fig.
- 미역귀의 분획물 첨가에 HepG2 세포주의 형태가 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여 여러 농도의 미역귀 methanol 추출물(UPM)을 48시간동안 처리한 후 위상차현미경을 이용하여 암세포의 형태를 관찰하였다. Fig. 5에서 나타난 바와 같이 시료의 처리 후 암세포주는 농도 의존적으로 세포밀 도의 감소현상과 형태적인 변화를 관찰할 수 있으며, 각 처리 농도 증가에 따라 세포막의 형 태가 쭈그러들고 기포현상 도 관찰할 수 있었으며, 처리농도가 높은 경우 세포의 부착 력이 상실되는 등 손상된 세포의 형태가 뚜렷이 관찰되었다. 이것으로 보아 암세포의 형태학적 변형 정도는 미역귀 methanol 추출물의 일정농도처리 에 따라 암세포 성장이 억 제되었음을 보여준다고 할 수 있겠다.
- HepG2 세포주에 미역귀시료의 각 분획물을 80, 160, 240 및 320 pg/mL의 농도로 첨가했을 때 각 첨가물의 농도에 따라서 농도 의존적으로 QR 활성이 증가하는 경향을 보였 으며, 특히 hexane 분획 층인 UPMH에서 아주 좋은 QR 유도 활성효과를 나타내었고, 그 다음으로는 methanol 추출물과 그 분획 층인 UPM과 UPMM에서 QR 유도 활성 효과가 서서히 증가하였다. 특히 hexane 분획 층 UPMH의 경우 용매 대 조군을 1.
- 미역의 뿌리부분이며 식품개발품으로 소외되고 있는 미역 귀를 이용하여 식중독 및 식품부패원인균 등을 이용한 항균 활성을 측정 해 보았으며 특히 식 중독원 인균인 Staphylococus au形。us에 시료의 UPMM층의 항균효과가 보였고 단백질식 품부패균인 Serratia marcescerzs에는 UPMB와 UPMM, UPMH 등에서 전반적으로 항균효과가 보였다. 또 4종의 인 체 암 세 포주 HeLa, HT-29, MCF-7 및 HepG2에 대한 암세 포 성장억제 실험을 한 결과 사용한 4종의 암세포주에서 모두 정도의 차이는 있으나 시 료첨 가 농도에 의 존적으로 성 장 저지 효과가 나타났다. 특히 시료의 methanol 분획 층인 UPMM 에서 괄목할 만한 높은 효과를 나타내었으며 HeLa, HT-29 및 HepG2세포에서 는 UPMM의 농도를 500 Hg/mL 첨가 시 이미 97.
- 2의 HT-29 세포주의 경우와 비 슷하였다. 이와 같은 결과에서 UPMM 분획에서의 암세포 증식 억제효과가 제일 컸다는 결과는 시료 중에 포함되어 있는 점액성 다당류 fucoidan과 alginic acid 등의 분자극성도를 고려했을 때 이 분획증에서의 극성물질의 활성효과를 인지할 수 있었다. Fucoidan과 alginic acide 항종양, 항고혈압, 항균, 알레르기 예방 등의 여러 생 리활성들이 이미 보고되어져 있다(12T5).
- 1은 자궁경부암세포주인 HeLa에 용매별 각 시료 분 획 물을 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL씩 농도를 증가시 키 며 첨 가하였을 때의 암세포 증식 억 제 효과를 나타낸 그림 이 며, 여러 용매 분획층 중 methanol 분획층인 UPMM에서 그 효과가 뛰 어났다. 즉, UPMM의 시료 농도 400 μg/mL를 첨가했을 때 다른 분획물에서 보다 69.95%의 암세포 증식 억 제 효과를 보였고, 500 μg/mL를 첨가했을 때는 97.71%의 매우 높은 효과가 나타났다. 대 장암 세 포주인 HT-29에 대한 암세포 증식억제 실험 결과는 Fig.
- 1의 HeLa 세포주에 대한 암세포 증식억제 효과와 같이 UPMM에서 그 효과가 제 일 컸다. 즉, 시 료농도 400 Ug/mL 을 첨가했을 때 UPMM 분획물은 다른 분획물의 경우보다 그 효과가 커서 83.11%의 높은 수치를 보였으며, 최종 첨가 농도인 500 Ug/m丄을 첨가했을 때는 98.63%의 높은 효과를 나타내었다. Fig.
- HepG2 세포주에 미역귀시료의 각 분획물을 80, 160, 240 및 320 pg/mL의 농도로 첨가했을 때 각 첨가물의 농도에 따라서 농도 의존적으로 QR 활성이 증가하는 경향을 보였 으며, 특히 hexane 분획 층인 UPMH에서 아주 좋은 QR 유도 활성효과를 나타내었고, 그 다음으로는 methanol 추출물과 그 분획 층인 UPM과 UPMM에서 QR 유도 활성 효과가 서서히 증가하였다. 특히 hexane 분획 층 UPMH의 경우 용매 대 조군을 1.0으로 하여 비교한 결과, 160, 240 및 320 Ug/mL의 시료첨가 농도에서 각각 1.36, 2.00 및 2.36으로 농도의존적 인 QR 유도활성효과를 나타내었으며, UPM의 경우는 240, 320 Ug/mL의 시료 첨가 시 각각 1.56, 1.75를 나타내었다.
- 또 4종의 인 체 암 세 포주 HeLa, HT-29, MCF-7 및 HepG2에 대한 암세 포 성장억제 실험을 한 결과 사용한 4종의 암세포주에서 모두 정도의 차이는 있으나 시 료첨 가 농도에 의 존적으로 성 장 저지 효과가 나타났다. 특히 시료의 methanol 분획 층인 UPMM 에서 괄목할 만한 높은 효과를 나타내었으며 HeLa, HT-29 및 HepG2세포에서 는 UPMM의 농도를 500 Hg/mL 첨가 시 이미 97.71, 98.63 및 90.32%의 높은 암세포 성 장억 제 효과를 나타내었다. 한편, 사용한 4가지 암세포주 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 HepG2를 이용한 quinone reductase 유도 활성여부를 측정한 결과 UPMH의 첨가농도 320 Jig/ mL에서 대조군보다 2.
- 32%의 높은 암세포 성 장억 제 효과를 나타내었다. 한편, 사용한 4가지 암세포주 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 HepG2를 이용한 quinone reductase 유도 활성여부를 측정한 결과 UPMH의 첨가농도 320 Jig/ mL에서 대조군보다 2.36배의 높은 QR유도효과를 나타내었다. 이와 같은 실험결과에서 식품이나 건강 및 약리적 효과가 있는 식품으로 알려진 미역귀의 기능성 식품으로서의 개 발이 기대되어진다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 Bae(18)에 의해 연구된 여주 분획성분 의 항발암 효과에 대한 결과와 비슷하였으며 본 연구에서 사용한 미 역 귀 분획 물 중 비극성 hexane 용매층인 UPMH에서 QR 유도효과가 제 일 높았으므로 이 분획 층에서 의 quinone reductase inducer가 존재 함을 추정 할 수 있 었 고 식 품산업 에 있어서의 암예방 효과를 지닌 기능성 식품개발에 매우 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과에 의하면 미역의 부위 중 뿌리부분으로 비교적 식용으로서의 빈도가 낮은 미역귀의 극성물질 용해 층인 UPMM과 UPMB에서 항균활성이 나타났으므로 이층 에서의 활성성분이 천연식품 보존제로서의 산업화 이용이 가능할 것으로 생각된다.
- 36배의 높은 QR유도효과를 나타내었다. 이와 같은 실험결과에서 식품이나 건강 및 약리적 효과가 있는 식품으로 알려진 미역귀의 기능성 식품으로서의 개 발이 기대되어진다.
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