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문제 정의
- 본 연구에서는 AFLP 분석을 통해 국내 및 중국에 서식하는 민들레, 산민들레, 흰민들레, 서양민들레 그리고 흰털민들레 (T. platypecidum) 5종 104점의 유연관계 및 주성분 분석 (PCA, principal component analysis)을 통해 유전 다양성을 평가하고 보다 우수한 한약 재료로 이용될 수 있는 민들레의 종 특성평가를 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- -80℃에서 보관한 시료는 액체질소와 막자사발을 이용하여 분쇄하였으며, DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였고, 이를 0.8% agarose gel에서 전기영동하여 추출된 genomic DNA의 양과 질 등의 상태를 확인하였으며 농도를 NanoDrop 1000 spectrophotometer (NanoDrop, USA)를 이용하여 260 ㎚에서 정량하였다.
- Capillary electrophoresis system을 이용하여 나온 AFLP 마커에 대한 각 시료들의 DNA 정보는 Gene Mapper (Applied Biosystems, USA) 프로그램을 이용하여 DNA fingerprinting profile을 분석하였다. 각 시료의 DNA 절편의 증폭여부는 전체 시료의 PCR 증폭 산물에서 noise peak를 제외하고 명확하게 PCR 증폭된 peak들만 분석에 이용하기 위해 형광 값 150을 기준으로 band의 유·무를 1 (유) 또는 0 (무)으로 점수를 부여하였으며, 유전적 유연관계와 주성분 분석은 NTSYSpc version 2.
- 65 U의 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa, Japan)이 포함된 10 μl의 반응액에서 실시하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 그리고 72℃에서 2분을 12회 반복하도록 반응시켰으며, annealing 온도는 1회 반복할 때마다 0.7℃씩 낮아지도록 touch down PCR을 수행하였다. Touch down PCR 후에는 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 그리고 72℃에서 2분의 반응조건을 30회 반복하여 반응시켰다.
- Selective PCR 증폭은 pre-selective amplification을 실시한 반응액을 1/10로 희석하여 2 μl를 주형 DNA로 사용하였으며, 2.5 μM의 MseI primer, 1 μM의 EcoRI primer, 10 × buffer, 8 mM의 dNTP 그리고 0.65 U의 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa, Japan)이 포함된 10 μl의 반응액에서 실시하였다.
- 총 6조합의 EcoRI (+3) 과 MseI (+3) primer를 이용하여 selective PCR 증폭을 수행하였으며, EcoRI primer는 6-FAM과 VIC 형광 dye가 결합된 것을 사용하였다 (Table 2). Selective PCR된 시료들은 36 cm capillary가 장착된 ABI3130 XL (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 전기영동을 하였다.
- 수집한 민들레 시료는 한국한의학연구원 분류동정자문회의 동정을 거쳐 그 종을 확정지었으며, 각 종별 시료의 기원식물은 압착석엽표본을 제작하여 한국한의학연구원 표본관에 보관하였다. 또한 수집한 민들레 식물체의 잎을 깨끗이 씻어 액체질소에 급냉시켜 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였으며 이들을 genomic DNA 추출에 이용하였다.
- 250 ng의 genomic DNA에 제한효소 EcoRI과 MseI을 처리하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 제한효소 처리 후 genomic DNA에 생긴 특이절편 말단에 adapter를 결합시키고 이를 1/10로 희석하여 pre-selective amplification을 진행하였다 (Table 2). PCR 증폭 조건은 94℃에서 30초, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분을 총 20회 반복하도록 반응시켰으며, 1.
- Touch down PCR 후에는 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 그리고 72℃에서 2분의 반응조건을 30회 반복하여 반응시켰다. 총 6조합의 EcoRI (+3) 과 MseI (+3) primer를 이용하여 selective PCR 증폭을 수행하였으며, EcoRI primer는 6-FAM과 VIC 형광 dye가 결합된 것을 사용하였다 (Table 2). Selective PCR된 시료들은 36 cm capillary가 장착된 ABI3130 XL (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 전기영동을 하였다.
대상 데이터
- 81에서 2개의 sub-group을 형성하였다. 민들레 sub-group I에는 경상남도 남해군과 사천시에서 수집한 시료들이 포함되었고, 민들레 sub-group II에는 제주도와 경상남도 거제시에서 수집한 것들이 유집을 이루었다. 흰민들레는 강원도와 경상남도 일대에서만 채집할 수 있었으며, 채집지역에 따라서 명확한 유집을 형성하지 못하였으나 유사도 0.
- Group II에는 국내 재래종인 민들레와 흰민들레가 포함되었다. 민들레는 경상남도와 제주도 일대에서 수집하였고 유사도 0.81에서 2개의 sub-group을 형성하였다. 민들레 sub-group I에는 경상남도 남해군과 사천시에서 수집한 시료들이 포함되었고, 민들레 sub-group II에는 제주도와 경상남도 거제시에서 수집한 것들이 유집을 이루었다.
- 본 실험에 분석용도로 사용한 산민들레는 강원도 3개 지역 11개체, 민들레는 제주도와 경상남도 남해안 일대 13개 지역 19개체, 흰털민들레는 흑룡강성 1개 지역 7개체, 흰민들레는 강원도와 경상남도 남해안 일대 21개 지역 29개체 그리고 서양민들레는 제주도, 강원도 및 경상남도 남해안 일대 23개 지역 38개체를 직접 방문 채집하여 총 104개체의 유전자원 계통을 공시하였다 (Fig. 1, Table 1). 수집한 민들레 시료는 한국한의학연구원 분류동정자문회의 동정을 거쳐 그 종을 확정지었으며, 각 종별 시료의 기원식물은 압착석엽표본을 제작하여 한국한의학연구원 표본관에 보관하였다.
- 흰털민들레는 중국 흑룡강성 철력시 일대에서 수집하였으며 분석에 이용한 다른 민들레 4종에 비해 비교적 높은 유사도를 보였다. 서양민들레는 강원도, 경상남도 및 제주도 등지에서 채집하였고 유사도 0.81에서 2개의 sub-group을 형성하였다. 경상남도 남해군과 거제시에서 채집한 시료들은 유집되어 sub-group을 이뤘으나 강원도와 제주도에서 채집한 시료에서는 지역별 유집이 이뤄지진 않았다.
데이터처리
- 각 시료의 DNA 절편의 증폭여부는 전체 시료의 PCR 증폭 산물에서 noise peak를 제외하고 명확하게 PCR 증폭된 peak들만 분석에 이용하기 위해 형광 값 150을 기준으로 band의 유·무를 1 (유) 또는 0 (무)으로 점수를 부여하였으며, 유전적 유연관계와 주성분 분석은 NTSYSpc version 2.2 (Exeter Software, USA) 프로그램의 비가중산술평균 (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)과 Mini tab 16 (Minitab Inc., USA) 프로그램의 다변량 주성분 분석법을 각각 이용하여 작성하였다.
이론/모형
- AFLP 분석은 AFLP Analysis System I과 AFLP Pre-Amp Primer Mix I kit (Invitrogen, USA)을 사용하여 사용자 지침에 따라 진행하였다. 250 ng의 genomic DNA에 제한효소 EcoRI과 MseI을 처리하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
성능/효과
- 7%로서 가장 적은 polymorphism을 보였다. 6쌍의 primer 조합 전체의 polymorphism은 44.4%였는데, 이는 AFLP를 이용하여 민들레 서식지 3곳에서 채집한 189개체로부터 83%의 polymorphism을 얻은 결과 (Van Der Hulst et al., 2000)와 Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)을 이용한 국내 서식하는 흰민들레와 서양민들레 2종의 수집유전자원 30점에서 96%의 polymorphism을 보였다는 이전의 보고 (Ryu and Bae, 2011) 그리고 연 (Nelumbo nucifera Gaertn.) 32계통을 대상으로 10개의 primer를 사용하였을 때 91.2%의 polymorphism을 보인 것 (Ryu et al., 2010)과는 차이를 보였다. 반면 마늘 20품종을 대상으로 한 AFLP primer 3조합에서 43%의 polymorphism 결과와 (Morales et al.
- AFLP 분석을 통해 얻어진 523개의 다형성 peak들은 NTSYSpc program의 비가중 산술평균 분석 (UPGMA)을 이용하여 유사도 (similarity coefficient)를 확인한 결과, 그 범위는 0.64에서 0.99에 걸쳐 나타났다 (Fig. 3). 유사도 0.
- AFLP 분석을 통해 얻어진 유연관계와 주성분분석 결과를 종합하면 5종의 민들레 모두 유전 유사도에서 종별 구분이 이뤄졌음을 확인하였다. 또한 국내종인 민들레와 흰민들레 두 종간의 유전 유사도가 높아 하나의 그룹을 형성하였으며, 국외종인 서양민들레와 중국 수집종 흰털민들레 그리고 국내종이지만 형태적으로 토종 민들레와 차이가 있는 산민들레가 종간의 유전 유사도를 넓게 분포하며 하나의 그룹을 형성함을 확인하였다.
- 제한효소 처리 후 genomic DNA에 생긴 특이절편 말단에 adapter를 결합시키고 이를 1/10로 희석하여 pre-selective amplification을 진행하였다 (Table 2). PCR 증폭 조건은 94℃에서 30초, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분을 총 20회 반복하도록 반응시켰으며, 1.5% agarose gel에서 전기영동으로 결과를 확인하였다.
- 전체 6쌍의 primer조합 가운데 M-CAA/E-AAG에서 가장 많은 223개의 total peak와 120개의 polymorphic peak가 확인되었으며, M-CAA/E-AGC에서 가장 적은 173개의 total peak와 67개의 polymorphic peak가 확인되었다 (Table 3). Polymorphism은 M-CAA/E-AAG에서 53.8%로 최대값을 보였고, 그 다음으로 M-CAA/EAGG에서 52.6%의 높은 값을 보여 이들 두 조합이 민들레 유전자원들을 분류하는데 이용성이 높을 것이라 판단되며, M-CAA/E-ACC가 28.7%로서 가장 적은 polymorphism을 보였다. 6쌍의 primer 조합 전체의 polymorphism은 44.
- 국내·외 다양한 자생지에서 수집된 민들레 유전자원 5종 104점을 대상으로 AFLP 분석을 한 결과, 6쌍의 primer 조합에서 1,176개의 total peak가 확인되었고 그 중에서 523개가 polymorphic peak였다. Primer 조합당 평균 total peak개수는 196개였으며, polymorphic peak는 평균 87개가 확인되었다. Fig.
- 국내·외 다양한 자생지에서 수집된 민들레 유전자원 5종 104점을 대상으로 AFLP 분석을 한 결과, 6쌍의 primer 조합에서 1,176개의 total peak가 확인되었고 그 중에서 523개가 polymorphic peak였다.
- AFLP 분석을 통해 얻어진 유연관계와 주성분분석 결과를 종합하면 5종의 민들레 모두 유전 유사도에서 종별 구분이 이뤄졌음을 확인하였다. 또한 국내종인 민들레와 흰민들레 두 종간의 유전 유사도가 높아 하나의 그룹을 형성하였으며, 국외종인 서양민들레와 중국 수집종 흰털민들레 그리고 국내종이지만 형태적으로 토종 민들레와 차이가 있는 산민들레가 종간의 유전 유사도를 넓게 분포하며 하나의 그룹을 형성함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 민들레 수집 유전자원들 간의 유전다양성 분석을 통해 민들레 품종육성을 위한 기초자료 및 종 판별 또는 원산지 구별을 위한 분자마커 개발로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 64를 기준으로 2개의 큰 group이 나뉘었는데 산민들레, 흰털민들레, 서양민들레가 group I에 속하였고 민들레와 흰민들레가 group II에 속하였다. 민들레 종 내에서의 유사도는 흰민들레가 0.82 값으로 가장 높았으며 그 다음으로 흰털민들레 0.81, 민들레 0.77, 산민들레 0.75 그리고 서양민들레 0.74 순으로 유전적 다양성을 보였다.
- 2에서 보는 바와 같이 M-CAA/E-AAG primer 조합의 AFLP 지문분석 패턴을 분석한 결과, 주로 peak가 분포한 범위는 100200 bp였다. 전체 6쌍의 primer조합 가운데 M-CAA/E-AAG에서 가장 많은 223개의 total peak와 120개의 polymorphic peak가 확인되었으며, M-CAA/E-AGC에서 가장 적은 173개의 total peak와 67개의 polymorphic peak가 확인되었다 (Table 3). Polymorphism은 M-CAA/E-AAG에서 53.
- 주성분분석을 통해 얻어진 민들레 5종 104점의 이차원상에서 분포도 분석결과는 first principal component ‘0’을 기준으로 산민들레가 분포하며 음의 값에는 국외종인 서양민들레와 흰털민들레가 분포하며 양의 값에는 국내종인 민들레와 흰민들레가 분포하는 등 민들레 5종이 종간 군집을 형성하는 것을 보여준다 (Fig. 4).
- 민들레 sub-group I에는 경상남도 남해군과 사천시에서 수집한 시료들이 포함되었고, 민들레 sub-group II에는 제주도와 경상남도 거제시에서 수집한 것들이 유집을 이루었다. 흰민들레는 강원도와 경상남도 일대에서만 채집할 수 있었으며, 채집지역에 따라서 명확한 유집을 형성하지 못하였으나 유사도 0.88에서 2개의 subgroup으로 나누어짐을 확인하였다. 흰민들레 sub-group I에는 주로 경상남도 남해군과 거제시의 채집시료들이 포함되었고, 흰민들레 sub-group II에는 주로 강원도 양구군과 인제군의 채집시료가 포함되었다.
- Ahn 등 (2003)은 민들레속 6종의 수집유전자원 9점을 이용하여 종간 형태적 특성을 분석한 결과 총포외편의 돌기가 민들레와 흰민들레에서만 나타나고 나머지 서양민들레와 산민들레 등에서는 나타나지 않음을 보고하였는데, 이것은 산민들레가 국내종임에도 불구하고 민들레와 흰민들레의 토종과는 형태 및 유전학적으로 차이가 있음을 보여준다. 흰털민들레는 중국 흑룡강성 철력시 일대에서 수집하였으며 분석에 이용한 다른 민들레 4종에 비해 비교적 높은 유사도를 보였다. 서양민들레는 강원도, 경상남도 및 제주도 등지에서 채집하였고 유사도 0.
후속연구
- 또한 국내종인 민들레와 흰민들레 두 종간의 유전 유사도가 높아 하나의 그룹을 형성하였으며, 국외종인 서양민들레와 중국 수집종 흰털민들레 그리고 국내종이지만 형태적으로 토종 민들레와 차이가 있는 산민들레가 종간의 유전 유사도를 넓게 분포하며 하나의 그룹을 형성함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 민들레 수집 유전자원들 간의 유전다양성 분석을 통해 민들레 품종육성을 위한 기초자료 및 종 판별 또는 원산지 구별을 위한 분자마커 개발로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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