[국내논문]AFLP 분석에 의한 멸종위기어류 미호종개, Iksookimia choii의 유전 다양성 Genetic Diversity of an Endangered Fish, Iksookimia choii (Cypriniformes), from Korea as Assessed by Amplified Fragment Length Polymorphism원문보기
우리나라 멸종위기종 미호종개 3집단(갑천, 백곡천, 지천)의 유전 다양성 및 유전적 구조를 AFLP분석을 통해 조사하였다. 3종의 primer조합형을 이용한 AFLP분석에서 각 집단으로부터 106, 107, 104개의 밴드가 생성되었으며, 집단 내 다형 밴드의 출현 빈도는 3개 집단에서 $21.5\sim24.5%$로 유사하게 나타났고, 이형접합율$(0.067\sim0.084)$및 유전적 다양도$(0.076\sim0.087)$는 매우 낮은 값을 보였다. 집단간 유전적 거리 및 유전적 상동성 분석 역시 유사한 결과를 나타내어 본 연구에서 분석한 미호종개 3개 집단은 유전적으로 매우 밀접한 근연관계를 나타내었다. 비록 pairwise Fst 값은 매우 낮았지만 3집단은 유전적 분화가 진행되고 있었다. 본 연구는 미호종개의 유전적 다양성 및 분화에 대해 처음으로 보고된 연구이며, 미호종개의 보존을 위한 유전적 기초 정보를 제공해 준다.
우리나라 멸종위기종 미호종개 3집단(갑천, 백곡천, 지천)의 유전 다양성 및 유전적 구조를 AFLP분석을 통해 조사하였다. 3종의 primer조합형을 이용한 AFLP분석에서 각 집단으로부터 106, 107, 104개의 밴드가 생성되었으며, 집단 내 다형 밴드의 출현 빈도는 3개 집단에서 $21.5\sim24.5%$로 유사하게 나타났고, 이형접합율$(0.067\sim0.084)$및 유전적 다양도$(0.076\sim0.087)$는 매우 낮은 값을 보였다. 집단간 유전적 거리 및 유전적 상동성 분석 역시 유사한 결과를 나타내어 본 연구에서 분석한 미호종개 3개 집단은 유전적으로 매우 밀접한 근연관계를 나타내었다. 비록 pairwise Fst 값은 매우 낮았지만 3집단은 유전적 분화가 진행되고 있었다. 본 연구는 미호종개의 유전적 다양성 및 분화에 대해 처음으로 보고된 연구이며, 미호종개의 보존을 위한 유전적 기초 정보를 제공해 준다.
Genetic diversity and population genetic structure within or among three stream populations (Gab, Baekgok and Ji streams) of Korean endangered natural monument fish, Iksookimia choii, were assessed by amplified fragment length polymorphism (AFLP). AFLP analysis using three primer combinations genera...
Genetic diversity and population genetic structure within or among three stream populations (Gab, Baekgok and Ji streams) of Korean endangered natural monument fish, Iksookimia choii, were assessed by amplified fragment length polymorphism (AFLP). AFLP analysis using three primer combinations generated 104 to 106 AFLP bands, and percent polymorphic bands were similar in those three populations ranging 21.5 to 24.5%. Heterozygosity and genetic diversity within or among populations were quite low for all of these populations with average values ranging from 0.067 to 0.084 and from 0.076 to 0.087, respectively. Analyses of pairwise distance and genetic similarity among three populations of I. choii also revealed the similar results with very low genetic differentiation one another. Although pairwise Fst values were very low, our data clearly indicated distinct genetic differentiation among the three populations. This is the first report concerning the genetic diversity and differentiation of this species, and provides basic genetic information that should facilitate attempts to conserve this species.
Genetic diversity and population genetic structure within or among three stream populations (Gab, Baekgok and Ji streams) of Korean endangered natural monument fish, Iksookimia choii, were assessed by amplified fragment length polymorphism (AFLP). AFLP analysis using three primer combinations generated 104 to 106 AFLP bands, and percent polymorphic bands were similar in those three populations ranging 21.5 to 24.5%. Heterozygosity and genetic diversity within or among populations were quite low for all of these populations with average values ranging from 0.067 to 0.084 and from 0.076 to 0.087, respectively. Analyses of pairwise distance and genetic similarity among three populations of I. choii also revealed the similar results with very low genetic differentiation one another. Although pairwise Fst values were very low, our data clearly indicated distinct genetic differentiation among the three populations. This is the first report concerning the genetic diversity and differentiation of this species, and provides basic genetic information that should facilitate attempts to conserve this species.
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문제 정의
비록 pairwise Fst 값은 매우 낮았지만 3집단은 유전적 분화가 진행되고 있었다. 본 연구는 미호종개의 유전적 다양성 및 분화에 대해 처음으로 보고된 연구이며, 미 호종개의 보존을 위한 유전적 기초정보를 제공해 준다.
이에 본 연구에서는 멸종위기에 처한 미 호종개의 복원을 위한 기초연구로 AFLP기법을 이용하여 본 종의 미소 서식처로 확인된 갑천, 백곡천 및 지천3집단의 유전변이 및 다양성을 분석하고자 하였다.
제안 방법
, 2000)을 사용하였다. Fst 수치에 대한 유전적 검정(*P)은 무작위 대립 유전자 치환(random allelic permutation) 과정을 10, 000번 이상 반복하여 수행하였다. 또한 각 개체 간의 유사도matrix를 UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic means)로분석하여 각각을 군집화(chistering)하고 이를 토대로 dendrogram 을 작성하였다.
Gel 상에서 각 위치에 확인된 DNAband의 유무에 따라 0또는 1로 표시하여 matrix code를 작성한 후 TFPGA (ver. 1.3; http://iubio.bio.indiana.edu.au/tfpga/) 프로그램을 사용하여 (Miller, 1997) 미호종 개각 집단별 및 전체의 평균 이형접합율(heterozygosity)과 평균 유전 다양성 (genetic diversity)을 구하였다.
두 번째 제한효소 반응을 위해서 Mse I 제한효소(promega, USA) 2 unit을 첨가하여 65℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 절단산물을 다시 순수 분리한 후 EcoR I/Mse I adaptei를 첨가하여 ligation 반응을 실시하였다. Ligation된 DNA5)iL를 대상으로 각각 10 pM 의 EcoR I primer 및 Mse I primer (Invitrogen, USA), 1 unit Taq DNA polymerase (Intron, Korea), 0.6 mM dNTP, 10 x PCR 용액을 첨가하여 1차 PCR preamplification 반응을 수행하였다. PCR 반응 조건은 94℃에서 30초 56℃ 에서 60초, 72℃에서 60초간의 cycle을 총 20회 반복하였다.
PCR 반응 조건은 94℃에서 30초 56℃ 에서 60초, 72℃에서 60초간의 cycle을 총 20회 반복하였다. PCR 1차 반응 산물을 TE 완충용액으로 50배 희석한 후 희석산물 5 ㎕를 대상으로 EcoR I selective primer 와 Mse I selective primer를 이용하여 상기와 동일하게 2차 PCR 조성물을 제조하였다. 이때 PCR 반응은 touch-downPCR법을 이용하여 94℃에서 30초, 65~56℃ (회당 0.
회수하였다. 두 번째 제한효소 반응을 위해서 Mse I 제한효소(promega, USA) 2 unit을 첨가하여 65℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 절단산물을 다시 순수 분리한 후 EcoR I/Mse I adaptei를 첨가하여 ligation 반응을 실시하였다. Ligation된 DNA5)iL를 대상으로 각각 10 pM 의 EcoR I primer 및 Mse I primer (Invitrogen, USA), 1 unit Taq DNA polymerase (Intron, Korea), 0.
Fst 수치에 대한 유전적 검정(*P)은 무작위 대립 유전자 치환(random allelic permutation) 과정을 10, 000번 이상 반복하여 수행하였다. 또한 각 개체 간의 유사도matrix를 UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic means)로분석하여 각각을 군집화(chistering)하고 이를 토대로 dendrogram 을 작성하였다.
우리나라 멸종위기종 미호종개 3집단(갑천, 백곡천, 지천)의 유전 다양성 및 유전적 구조를 AFLP분석을 통해조사하였다. 3종의 primer 조합형을 이용한 AFLP 분석 에서 각 집단으로부터 106, 107, 104개의 밴드가 생성되었으며, 집단 내 다형 밴드의 출현빈도는 3개 집단에서 21.
PCR 1차 반응 산물을 TE 완충용액으로 50배 희석한 후 희석산물 5 ㎕를 대상으로 EcoR I selective primer 와 Mse I selective primer를 이용하여 상기와 동일하게 2차 PCR 조성물을 제조하였다. 이때 PCR 반응은 touch-downPCR법을 이용하여 94℃에서 30초, 65~56℃ (회당 0.7℃씩 감소)에서 30초, 72℃에서 60초간 12회 순환 반응을 실시 후 annealing 온도를 56℃에서 30초로 고정하여 총 24회를 반복 수행하였다. 최종 증폭산물 20㎕에 6㎕의 formamide loading dye (95% formamide, 10 mM EDTA, pH 8.
05% xylenecyanol FF)< 첨가한 후 94℃에서 5분간 가열하고 이 중 3 를 취하여 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하여 1, 600 V에서 3시간 동안 전기영동하였다.전기영동된 DNA 단편들은 silver staining kit (Promega, USA)를 이용하여 염색 후 관찰하였다.
0)로 용해시켰다. 준비한 시료는 흡광광도계측정과 0.7% agarose gel 전기영동을 통해서 DNA의 양과 질을 확인한 후실험에 이용하였다.
총 2]」g의 DNA를 EcoR I 제한효소(Promega, USA) 10unit로 37℃에서 4시간 절단한 후 절단 정도를 전기영동상으로 확인하였고 에탄올 침전을 이용하여 절단한 DNA 를 회수하였다. 두 번째 제한효소 반응을 위해서 Mse I 제한효소(promega, USA) 2 unit을 첨가하여 65℃에서 4시간 동안 반응시켰으며, 절단산물을 다시 순수 분리한 후 EcoR I/Mse I adaptei를 첨가하여 ligation 반응을 실시하였다.
7℃씩 감소)에서 30초, 72℃에서 60초간 12회 순환 반응을 실시 후 annealing 온도를 56℃에서 30초로 고정하여 총 24회를 반복 수행하였다. 최종 증폭산물 20㎕에 6㎕의 formamide loading dye (95% formamide, 10 mM EDTA, pH 8.0, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylenecyanol FF)< 첨가한 후 94℃에서 5분간 가열하고 이 중 3 를 취하여 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하여 1, 600 V에서 3시간 동안 전기영동하였다.전기영동된 DNA 단편들은 silver staining kit (Promega, USA)를 이용하여 염색 후 관찰하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 미 호종개, /iksookimia는 문화재청과 환경부의 승인을 얻은 후 2006년 8월에 채집하였으며, 갑천(대전광역시 서구도 안동), 백곡천(충북 진천군백곡면 사송리), 지천(충남 청양군 장평면 구룡리에서족대망목, 4X4 mm)를 사용하여 각각 15개 체씩 채집하였다. 채집된 미호종 개는 전장 7.
채집된 미호종 개는 전장 7.7±1.0cm, 체중 2.1± LOg 이었다.
이론/모형
choii based on genetic distance data. Dendrogram was constructed by the UPGMA clustering method. Gl-15, Gab stream population; Bl-15, Baekgok stream population; Jl-15 lane, Ji stream population.
각 집단별의 유전적 유사도 (genetic similarity)는 Nei and Li (1979)의 공식올 이용하였고, 집단 간 유전적 거리(pairwise genetic distance)와 각 집단 간의 Hardy-Wein-berg 평형(HWE)을 검정하기 위한 유전적 분화도(generic differentiation, Pst)는 Arlequin _ 프로그램(ver. 2.000, Stefan et al., 2000)을 사용하였다. Fst 수치에 대한 유전적 검정(*P)은 무작위 대립 유전자 치환(random allelic permutation) 과정을 10, 000번 이상 반복하여 수행하였다.
성능/효과
3종의 primer 조합형을 이용한 AFLP 분석 에서 각 집단으로부터 106, 107, 104개의 밴드가 생성되었으며, 집단 내 다형 밴드의 출현빈도는 3개 집단에서 21.5~24.5%로 유사하게 나타났고, 이형접합율(0.067~ 0.084) 및 유전적 다양도(0.0760.087)는 매우 낮은 값을 보였다. 집단 간 유전적 거리 및 유전적 상동성 분석 역시 유사한 결과를 나타내어 본 연구에서 분석한 미호종개 3개 집단은 유전적으로 매우 밀접한 근연관계를 나타내 었다.
본 연구에서 미 호종개의 유전 다양성은 매우 낮은 것으로 분석되었다. Ward etaZ.
0167로 집단 간분화도와 같은 경향을 보이며 집단간에 큰 차이는 없는 것으로 분석되었다(Table 2). 유전적 거리에 따른 3집단의 UPGMA dendrogram을 작성한 결과, 뚜렷한 집단의 분화는 관찰되지 않았으나 일부 집단의 개체들에서 분류되는 양상을 나타내고 있어 (Fig. 2) , 집단 간분화도와 유사한 경향을 보이며 유전적 분화가 진행되고 있음을 시사하고 있다.
087)는 매우 낮은 값을 보였다. 집단 간 유전적 거리 및 유전적 상동성 분석 역시 유사한 결과를 나타내어 본 연구에서 분석한 미호종개 3개 집단은 유전적으로 매우 밀접한 근연관계를 나타내 었다. 비록 pairwise Fst 값은 매우 낮았지만 3집단은 유전적 분화가 진행되고 있었다.
집단 간 유전적 거리는 백곡천과 지천 사이가 0.0207, 백곡천과 갑천 사이가 0.0175 그리고 갑천과 지천 사이가 0.0167로 집단 간분화도와 같은 경향을 보이며 집단간에 큰 차이는 없는 것으로 분석되었다(Table 2). 유전적 거리에 따른 3집단의 UPGMA dendrogram을 작성한 결과, 뚜렷한 집단의 분화는 관찰되지 않았으나 일부 집단의 개체들에서 분류되는 양상을 나타내고 있어 (Fig.
1). 집단별 다 형성밴드 비율은 갑천 24.5%, 백곡천 21.5%, 지천 22.1%로 갑천 집단이 가장 높게 나타났으나 집단간 큰 차이가 없었으며, 미 호종 개 전체 다형성 밴드의 비율은 30.9%로 분석되었다. 이러한 다형 밴드 비율은 이(2005)가 보고한 어름치의 17.
하천수계 집단별 15개체를 대상으로 AFLP를 수행한 결과 3개의 primer 조합(E/ACT-M/CAT, E/ACT-M/ CAC, E/ACG-M/CAC)에서 총 110개의 유효밴드가 검출되었으며 primer 조합 당 평균 37개로 나타나, 어름치 (Hemibarbus mylodon, 이, 2005)의 53개보다는 적게 나타났다(Fig. 1). 집단별 다 형성밴드 비율은 갑천 24.
후속연구
이와 같이 본종은 서식처분단을 통해 집단 간 유전자 교류가 차단됨으로써 실험한 일부 집단에서 분화가 진행된 것으로 사료된다. 따라서 이후 본종의 복원시 집단 간분화가 진행되고 있는 점을 감안하여 유전 다양성 유지를 위한 체계적인 보존 대책이 수립되어야 할 것으로 판단된다. 또한 정밀한 유전 다양성 분석 및 집단 내 유전 다양성 회복을 위한 교배지침 작성을 위해 microsatellite marker에 의한 분석도 필요하리라 판단된다.
따라서 이후 본종의 복원시 집단 간분화가 진행되고 있는 점을 감안하여 유전 다양성 유지를 위한 체계적인 보존 대책이 수립되어야 할 것으로 판단된다. 또한 정밀한 유전 다양성 분석 및 집단 내 유전 다양성 회복을 위한 교배지침 작성을 위해 microsatellite marker에 의한 분석도 필요하리라 판단된다.
본 연구에서는 집단별 15개 체씩을 분석하였는데, 이는 본 종이 멸종위기종인 동시에 천연기념물이기 때문에 실험을 위한 충분한 수의 시료 채집과 허가가 매우 제한적이기 때문이었다. 추후 분석 시료수에 따른 결과의 유의성 검토를 통해 추가 실험 여부를 결정하여야 할 것으로 판단된다.
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