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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 인삼의 발효를 통한 가공제품의 개발을 위한 연구의 일환으로 β-glucosidase 활성이 있는 유산균주를 이용하여 발효한 인삼, 홍삼의 ginsenoside 유용 유도체의 전환 검토 및 발효에 의한 품질특성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 β-glucosidase 활성이 있는 유산균주를 이용하여 발효인삼의 ginsenoside 유용 유도체의 전환 검토및 품질특성 알아보고자 하였다.
제안 방법
- β-glucosidase 활성 유산균 주를 검색하여 인삼 및 홍삼 발효에 따른 TLC 패턴, ginsenoside 함량 변화, 총 페놀성 화합물 함량, 전자공여능및 총당 함량을 분석하였다.
- 인삼/홍삼 발효에 따른 총 페놀성 화합물 함량 및 전자공 여능 (1) 홍삼액 발효 기간에 따른 총 페놀성 화합물 함량및 전자공여능 발효기간에 따른 영향을 알아보기 위하여 5종의 유산균주를 이용하여 홍삼액 10 ˚Brix를 각각 MRS 배지에 10%, 20%로 첨가하여 7일간 발효를 실시한 후 총 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과는 Fig. 5와 같다.
- 37℃에서 24시간 전배양한 유산균 100 μL을 인삼/홍삼 추출물 1 mL을 포함하는 MRS 배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, Detroit, USA) 6 mL에 접종하여 37℃에서 65시간 동안 혐기적으로 배양하여 TLC 및 ginsenoside 함량을 분석하였다.
- 37℃에서 24시간 전배양한 유산균 100 μL을 인삼/홍삼 추출물 1 mL을 포함하는 MRS 배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, Detroit, USA) 6 mL에 접종하여 37℃에서 65시간 동안 혐기적으로 배양하여 TLC 및 ginsenoside 함량을 분석하였다. 발효기간에 따른 품질특성을 알아보기 위하여 홍삼추출물에 대한 유산균 발효는 37℃에서 7일간 실시하였으며, 발효균주에 따른 인삼/홍삼 발효액의 품질특성을 알아보기 위해 37℃에서 72시간 발효 후 총페놀성 화합물 및 전자공여능을 측정하였다.
- 배양액 1 mL에 수포화 부탄올 200 μL를 첨가하여 진탕한후 분리된 부탄올 층을 이용하여 TLC 분석에 이용하였다.
- 이 용액 5 mL를 취하여 추출물 0.5 mL와 혼합한 후 상온에서 10분간 방치시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 시료 첨가구와 무첨가구의흡광도 차이를 백분율(%)로서 표시하여 전자공여능으로 하였다.
- 인삼 추출물은 6년근 백삼을 90℃, 120 rpm에서 용매비 10배로 4시간 열수추출한 후 감압농축하여 15 ˚Brix로 농축하였으며, 홍삼발효액은 홍삼엑기스(고려홍삼정, 70 ˚Brix)를 20˚Brix로 희석하여 홍삼 발효에 사용하였다. 인삼/홍삼의 유산균 발효는 MRS 배지 6 mL에 인삼 추출물(15 ˚Brix), 홍삼 추출물(20 ˚Brix)를 각각 1 mL을 첨가한 후 멸균한 다음각 유산균주 배양액 0.1 mL를 접종하여 37℃에서 65시간 동안 발효를 실시하였다. 인삼/홍삼 발효액 ginsenoside 분석조건은 Table 1과 같으며, UPLC-PDA를 이용하여 ginsenoside 14종(Rg1, Re, Rf, Rh1, Rg2(s), Rg2(r), Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3(s), Rg3(r), Rh2(s), Rh2(r))에 대한 분석을 실시하였다.
- 시험용액의 전자공여능(electron donating ability, EDA) 시험은 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)를 사용한 방법으로 측정하였다. 즉, DPPH 시약 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL를 가하고 50% ethanol 용액을 blank로 하여 517 nm에서 DPPH 용액의 흡광도를 약 1.0으로 조정하였다. 이 용액 5 mL를 취하여 추출물 0.
- 진세노사이드의 TLC 분석은 인삼/홍삼 발효액을 80℃에서 4시간 열수추출한 후 부탄올로 추출한 시료를 silica gel TLC 판(TLC aluminium sheet silica gel 60F254, Merck, Darmstadt, Germany)에 점적하여 부탄올/에틸아세테이트/ 물(5 : 1 : 4, 혼합용매의 상층사용)로 전개한 다음 10% H2SO4 용액을 분무한 후 110℃에서 5분간 가열하여 발색시켜 표준품 대비 시료 중의 ginsenosides pattern을 비교 확인 하였다.
대상 데이터
- 인삼 및 홍삼 발효에 사용한 균주는 충남 아산 배방읍 세출리 지역에서 수집한 16종의 김치로부터 분리한 균주중 Lactobacillus plantarum KC-1, Lactobacillus brevis KC-2, Lactobacillus sp. KC-3, KC-5, KC-35와 분양받은 균주 및 보유하고 있는 유산균 Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenterioides KCTC 3718, Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis KCTC 1058, L. plantarum Danisco, Bifidobacterium longum Danisco, B. bifidum Danisco-W, B. bifidum Danisco-Y 등 10여개 균주를 사용하였다. 발효시 사용한 균주는 esculin agar법을 이용하여 β-glucosidase 활성 유무를 검색한 후 활성이 있는 것으로 나타난 균주를 실험에 사용하였다.
- 발효시 사용한 균주는 esculin agar 법을 이용하여 β -glucosidase 활성 유무를 검색한 후 활성이 있는 것으로 나타난 균주를 실험에 사용하였다.
- 발효시 사용한 균주는 esculin agar법을 이용하여 β-glucosidase 활성 유무를 검색한 후 활성이 있는 것으로 나타난 균주를 실험에 사용하였다.
- 인삼 발효 및 TLC(Thin layer chromatography) 확인에 사용한 인삼, 홍삼은 충남 금산 인삼 시장에서 2010년도에 구입한 것을 사용하였으며, 포장 가공된 제품은 인삼가공 업체로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 인삼 및 홍삼 종류에 따른 TLC 사포닌 패턴 확인을 위해 사용된 시료는 인삼, 홍삼(건조물), 백삼(4 years curved ginseng, Jinan, Korea), 백삼(6 years, Youngju, Korea), 홍삼(6 years, Joongang Ginseng Farming Association, Youngju, Korea), 흑삼 6년근, 발효홍삼정(60 ˚Brix), 홍삼농축액(70 ˚Brix)을 사용하였다.
- 인삼 발효 및 TLC(Thin layer chromatography) 확인에 사용한 인삼, 홍삼은 충남 금산 인삼 시장에서 2010년도에 구입한 것을 사용하였으며, 포장 가공된 제품은 인삼가공 업체로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 인삼 및 홍삼 종류에 따른 TLC 사포닌 패턴 확인을 위해 사용된 시료는 인삼, 홍삼(건조물), 백삼(4 years curved ginseng, Jinan, Korea), 백삼(6 years, Youngju, Korea), 홍삼(6 years, Joongang Ginseng Farming Association, Youngju, Korea), 흑삼 6년근, 발효홍삼정(60 ˚Brix), 홍삼농축액(70 ˚Brix)을 사용하였다.
- 인삼/홍삼의 유산균 발효에 따른 ginsenoside 함량 변화를 알아보기 위하여 시료는 다음과 같이 제조하였다. 인삼 추출물은 6년근 백삼을 90℃, 120 rpm에서 용매비 10배로 4시간 열수추출한 후 감압농축하여 15 ˚Brix로 농축하였으며, 홍삼발효액은 홍삼엑기스(고려홍삼정, 70 ˚Brix)를 20˚Brix로 희석하여 홍삼 발효에 사용하였다. 인삼/홍삼의 유산균 발효는 MRS 배지 6 mL에 인삼 추출물(15 ˚Brix), 홍삼 추출물(20 ˚Brix)를 각각 1 mL을 첨가한 후 멸균한 다음각 유산균주 배양액 0.
- 표준물질로는 gallic acid 를 5~50 μg/mL의 농도로 조제하여 검량 곡선의 작성에 사용하였다.
이론/모형
- 발효액의 총당 함량은 Dubois 등(11)에 의한 방법으로 측정하였다. 적절히 희석된 시료 0.
- 시험용액의 전자공여능(electron donating ability, EDA) 시험은 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)를 사용한 방법으로 측정하였다.
- 총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Denis법(12)을 이용하여 측정하였다. 시험용액을 일정하게 희석한 검액 1 mL에 Folin-Ciocalteu 시약 1 mL를 가해 혼합하고, 3분 후 10% Na2CO3 2 mL를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치한 다음 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 37℃에서 65시간 발효 후 Rg2r, Rh2s, Rh2r은 모두 불검출되었으며, 인삼 및 홍삼 추출물 발효에서 발효전과 비교하여 Rg1, Re는 감소한 반면, Rh1, Rg2s, Rd, Rg3r, Rg3s는 발효 후 모두 증가한 것으로 나타났 다.
- 4와같다. 37℃에서 65시간 발효 후 ginsenosides 함량을 분석한 결과 Rg2r, Rh2s, Rh2r는 모두 불검출되었으며, 인삼/홍삼 추출물 발효에서 발효전과 비교하여 Rg1, Re는 감소한 반면, Rh1, Rg2s, Rd, Rg3r, Rg3s는 발효 후 모두 증가한 것으로 나타났다. 홍삼에서 대표적인 성분으로 알려져 있는 Rg3의 경우 홍삼액 발효전 104.
- 68 μg/mL으로 증가하였다. 7일간 발효 후 홍삼 액의 총 페놀성 화합물 및 전자공여능은 일부 균주에서는 발효전과 비교하여 감소하다가 다시 증가하는 경향을 나타 내기도 하였으나, 발효가 0~7일차까지 진행됨에 따라 전반적으로 약간 감소되는 경향을 나타내었다. 전자공여능은 인삼 추출물 발효액은 발효 후 균주 종류에 따라 증가하는경향을 보였으나, 홍삼 추출액은 발효 후 낮아지는 경향을보였다.
- 그러나, 홍삼 추출액 발효시에는 발효전 전자공여능 68.62%에서 발효 실시 후 48.00∼56.05%로 낮아지는 경향을 보였다.
- 77 mg/10 g으로 낮게 나타나 전체 적으로 발효시 무발효추출물의 폴리페놀 함량 보다 낮았다고 보고하였다. 또한, 발효시간의 변화에 따른 폴리페놀 함량은 균주 종류에 따라 증가하거나 감소하였으며, 효소 처리 발효인삼 추출물의 경우 발효 48시간까지는 폴리페놀 함량이 증가하였으나 72시간 발효에서는 함량이 감소하였 다고 하였다. Kim 등(18)은 유산균을 이용하여 37℃에서 7일간 발효시킨 홍삼 발효물의 폴리페놀 함량은 대조구 22.
- 03%의 진세노사 이드 전환율을 나타내었다고 하였다(15). 또한, 발효에 따라 고분자 진세노사이드 Re의 Rg2로의 전환 패턴을 확인한 결과 진세노사이드 Re가 감소함에 따라 Rg2가 점차적으로증가하는 것을 확인하여 본 연구결과와 일치하는 경향을나타내었다. 인삼/홍삼 발효에 따른 총 페놀성 화합물 함량 및 전자공 여능 (1) 홍삼액 발효 기간에 따른 총 페놀성 화합물 함량및 전자공여능 발효기간에 따른 영향을 알아보기 위하여 5종의 유산균주를 이용하여 홍삼액 10 ˚Brix를 각각 MRS 배지에 10%, 20%로 첨가하여 7일간 발효를 실시한 후 총 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과는 Fig.
- 를 이용한 홍삼 extract 발효시 대조구의 폴리페놀 함량이 936.8 μg/mL에서 일부 균주는 941.7~965.3 μg/mL으로 증가하였으나 균주간의 유의적인 차이는 없었으며 다른 균주에 의한 홍삼발효물의 폴리페놀 함량은 대조구보다 감소하였다고 보고하여본 연구의 결과와 일치하는 경향을 보였다.
- 유산균주를 이용하여 인삼 및 홍삼추출물의 발효를 실시한 후 전자공여능을 측정한 결과 인삼 추출물 발효액의 경우 발효전 전자공여능이 35.21%에서 발효 후 균주 종류에 따라 71.58∼79.28%로 증가하는 경향을 보였다.
- 전자공여능은 인삼 추출물 발효액은 발효 후 균주 종류에 따라 증가하는경향을 보였으나, 홍삼 추출액은 발효 후 낮아지는 경향을보였다. 인삼 및 홍삼 추출액을 첨가하여 유산균주별로 발효를 실시한 결과 총당 함량은 발효에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
- 7일간 발효 후 홍삼 액의 총 페놀성 화합물 및 전자공여능은 일부 균주에서는 발효전과 비교하여 감소하다가 다시 증가하는 경향을 나타 내기도 하였으나, 발효가 0~7일차까지 진행됨에 따라 전반적으로 약간 감소되는 경향을 나타내었다. 전자공여능은 인삼 추출물 발효액은 발효 후 균주 종류에 따라 증가하는경향을 보였으나, 홍삼 추출액은 발효 후 낮아지는 경향을보였다. 인삼 및 홍삼 추출액을 첨가하여 유산균주별로 발효를 실시한 결과 총당 함량은 발효에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
- 총당 함량은 발효에 따라 감소하는 것으로 나타났으며, 인삼발 효액의 경우 총당 함량이 초기 13.16 mg/g에서 발효 후유산균주의 종류에 따라 2.62∼11.42 mg/g으로 나타났다.
- 홍삼 발효액은 총당 함량이 초기 31.92 mg/g에서 발효 후유산균주의 종류에 따라 7.68∼18.1 mg/g으로 나타나 총당 함량은 발효에 따라 감소되는 경향을 보였다.
- bifidium Danisco-W) 균주는 72시간 발효 후 652 mg/L 이었으며 나머지 균주의 경우 688∼724 mg/L로 약간 증가하는 경향을 나타내었다.홍삼 발효액의 총 페놀성 화합물 함량을 분석한 결과 8번(B.longum Danisco) 균주는 발효전에 비하여 함량이 감소하였으나 이를 제외한 다른 균주를 이용한 발효에서는 발효전보다 발효후 총 페놀성 화합물 함량이 보다 높게 나타났다.홍삼 발효액의 경우 발효 균주 종류에 따라 72시간 발효후 총 페놀성 화합물을 측정한 결과 균주 종류에 따라 발효 초기보다 증가하거나 또는 감소하는 경향을 나타내어 일관된 경향성은 나타나지 않는 것으로 판단된다.
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