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문제 정의
- 본 연구에서 사용한 小烏沈湯加減方은 스트레스와 우울증 등에서 빈발하는 증세 중 하나인 心胸痛9)에 활용할 목적으로《東醫寶鑑·內景編》8) 用藥法에서 제시한 上焦 氣滯에 桔梗, 枳殼를 가한다는 점에 착안하여, 小烏沈湯 처방에서 沈香 대신 木香을 사용하고 桔梗, 枳殼을 가한 것이다.
- 이에 저자는 小烏沈湯이 우울증 치료에 활용될 수 있으리라 사료되어 이를 실험적으로 규명하고자, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 및 Super Oxide Dismutase (SOD) 활성과 P815 세포내의 serotonin 함량 및 5-hydroxytryptamine transporter (5-HTT), TPH-1 mRNA의 발현을 관찰한바 약간의 지견을 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 본 실험에서는 小烏沈湯加減方의 항산화 작용을 알아보고자 DPPH 소거능과 SOD 활성을 측정하였다.
- 본 실험에서는 小烏沈湯加減方이 serotonin 대사과정에 미치는 영향을 알아보고자 P815 세포내의 serotonin 함량 및 5-HTT, TPH-1 mRNA의 발현을 측정하였다.
제안 방법
- 열탕추출기(대웅, Korea), rotary vaccum evaporator (Büchi B-480, Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU‐540, Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., USA), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo, Japan), micro-pipet (Gilson, France), water bath (Vision scientific Co., Korea), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue, Japan), centrifuge (Sigma, USA), deep freezer (Sanyo, Japan), thermocycler system (MWG Biotech., Germany), ice maker (Vision scientific Co., Korea), homogenizer (OMNI, USA), plate shaker (Lab‐Line, USA) 및 ELISA reader (Molecular Devices, USA), C18역상 HPLC columne (Hypersil, USA), HPLC (Shimazu, Japan) 등을 사용하였다.
- 小烏沈湯加減方 처방 33.0 g을 증류수 1,000 ㎖에 넣고 2시간 동안 가열한 후 여과하여 얻은 액체성분을 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 약리성분을 추출하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 2.
- 세포는 FBS가 들어있는 DMEM 배양액에서 小烏沈湯加減方을 50 µg/㎖, 100 µg/㎖, 200 µg/㎖, 400 µg/㎖ 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
- 대조 유전자로 β actin mRNA을 control로 이용하여 target mRNA를 정량하고 유전자 발현을 비교하였다(Table 2).
- 100 µg/㎖ 小烏沈湯加減方 sample의 추출된 RNA에 2X SYBR Green Master Mix 25 ㎕와 각각의 유전자들과 10pM forward and reverse primers를 1 ㎕씩 첨가하여 각각 50 ㎕ 반응이 이루어졌으며 95℃에서 10분 후 30초간 40 cycle을 돌린 다음 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응을 일으켰다.
- P815 세포 내부의 serotonin 농도를 분석하기 위하여, 각각 50µg/㎖, 100 µg/㎖ 농도의 小烏沈湯加減方 약물을 처리한 세포의 배지를 제거한 후, 1×PBS pH 7.2의 완충액을 이용하여 세포를 2번 세척하였다.
- 시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로, 농축한 시료를 각각 ethanol로 희석하여 IC50 값을 나타낼 수 있는 농도가 포함되도록 小烏沈湯加減方을 10 µg/㎖, 100 µg/㎖, 200 µg/㎖, 400 µg/㎖ 농도로 제조하였다.
- 517 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 각 시료의 농도 별 free radical scavenging activity 곡선을 그린 뒤, 50%의 DPPH free radical scavenging activity (DPPH IC50)20)를 나타내는 값을 구하였다.
- 상층액을 C18 column에 시료용액(150 ㎕)을 trichloroacetic acid (1M, 150 ㎕), HIAA (10μM, 50 ㎕; 내부표준)를 가한 다음 10,000 rpm으로 원심 분리하였다. 상층액을 Millex-GV (0.22 ㎛)로 여과한 후 HPLC에 주입하여 serotonin 함량을 측정하였다.
- 분리한 RNA에 해당 유전자들의 oligo dT primer와 DEPC water를 넣고 65℃에서 10분 동안 반응시킨 후 실온에서 3분 동안 방치한 다음 10×buf er, 10 mM dNTP, AMV reverse transcriptase, 50 mM MgCl2 및 DEPC treated water를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 reverse transcriptase (RT) product를 만든다. 만들어진 RT product (template cDNA)를 사용하여 real-time PCR을 사용하여 측정한다.
- 이처럼 小烏沈湯은 氣實로 인한 心腹刺痛에 활용되는 처방인데, 본 연구에서는 香附子, 烏藥, 沈香, 甘草로 구성된 《太平惠民和劑局方》7) 小烏沈湯 처방에서 진품을 구하기 어려운 沈香 대신 木香을 사용하고22) 《東醫寶鑑·內景編·氣》 用藥法2) 부분의 上焦 氣滯에 桔梗, 枳殼를 가한다는 구문을 참고하여, 桔梗, 枳殼을 가한 小烏沈湯加減方을 사용하였다.
- 이에 저자는 心腹刺痛을 가지고 있는 우울증 환자에게 小烏沈湯加減方을 활용할 수 있으리라 사료되어, 우울증 발병에 연관이 있는 것으로 알려진 산화 스트레스와 우울증 주요 지표인 serotonin에 대한 小烏沈湯加減方의 효과를 실험적으로 규명하고자, DPPH 및 SOD 활성과 P815 세포내의 serotonin 함량 및 5-HTT, TPH-1 mRNA의 발현을 측정하였다.
- 小烏沈湯加減方의 항산화 작용을 알아보기 위하여 DPPH의 소거능과 SOD 활성도를 관찰하고, P815세포 내에서 serotonin 대사과정에 미치는 영향을 알아보기 위하여 serotonin 농도, 5-HTT, TPH-1의 mRNA 발현을 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 小烏沈湯加減方은 DPPH radical 소거능을 증가시켰다. 小烏沈湯加減方은 SOD 활성도를 증가시켰다. 小烏沈湯加減方은 P815 세포내의 serotonin 농도를 감소시켰다.
대상 데이터
- Cell culture용 FBS, DMEM, 10 mM HEPES, fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, D-PBS dulbecco's phosphate buffered saline, potassium phosphate dibasic, potassium phosphate monobasic, Trypsin-EDTA는 Gibco-BRL사(USA) 제품을 사용하였고, isopropanol, NaOH, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride, coralyne hydrochloride, L-tryptophan, 5-hydroxytryptophan, catalase, DL-6-methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin (4H-PT), serotonin (5-HT), 5-hydroxytryptamine transporter (5-HTT), 5-hydroxyindoleacetic acid (HIAA), dithiothreitol는 Sigma사(USA) 제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 小烏沈湯加減方의 처방구성은 《太平惠民和劑局方》1)의 小烏沈湯에서 沈香 대신 木香을 사용하고 桔梗, 枳殼을 2.0 g씩 첨가한 것으로, 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 처방 1첩의 내용과 용량은 다음과 같다(Table 1).
- Cell culture용 FBS, DMEM, 10 mM HEPES, fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, D-PBS dulbecco's phosphate buffered saline, potassium phosphate dibasic, potassium phosphate monobasic, Trypsin-EDTA는 Gibco-BRL사(USA) 제품을 사용하였고, isopropanol, NaOH, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride, coralyne hydrochloride, L-tryptophan, 5-hydroxytryptophan, catalase, DL-6-methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin (4H-PT), serotonin (5-HT), 5-hydroxytryptamine transporter (5-HTT), 5-hydroxyindoleacetic acid (HIAA), dithiothreitol는 Sigma사(USA) 제품을 사용하였다. Trizol, Superscript II reverse transcriptase는 Life Technologies사(USA) 제품을, iQ SYBR green supermix는 Bio-Rad Laboratories사(USA) 제품을, ethanol, methalnol은 Samchun Pure Chemical사(Korea), Ez-cytox assay kit는 Itsbio사(Korea) 제품을, SOD assay kit는 Dojindo사(Japan)제품을 사용하였으며, 그 밖의 시약은 특급 및 일급을 사용하였다.
- P815 세포는 동아대학교 의과대학(해부학 교실)에서 분양받았으며, 배양은 10% fetal calf serum, 100 unit/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin을 포함한 DMEM 배지, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate를 사용하여, cell culture용 dish에서 37℃, 5% CO2 상에서 배양하였다.
- 여기에 2,2'-diphenyl-2-picrylhydrazyl을 methanol에 녹여 0.1 mM DPPH 용액을 제조하였다.
데이터처리
- 유의성 검증은 Student's t-test를 이용하여 분석하였으며 P<0.05에서 유의한 것으로 판정하였다.
- 실험결과는 mean±standard error로 기록하였다.
이론/모형
- 각각의 시료중의 단백질 함량을 측정하여 보정하였으며, 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 하고 Bradford's method21)를 이용하여 측정하였다.
- 이후 세포 생존을 Ez-cytox 분석법에 의해서 분석하였다. Ez-cytox 분석법은 배양이 완료된 세포에 50 µg/㎖ Ez-cytox를 희석 처리하여 반응시킨 다음 microplate reader로 570 nm에서 측정하였다.
- Serotonin 함량은 HPLC‐형광광도계법으로 측정하였다. P815 세포 내부의 serotonin 농도를 분석하기 위하여, 각각 50µg/㎖, 100 µg/㎖ 농도의 小烏沈湯加減方 약물을 처리한 세포의 배지를 제거한 후, 1×PBS pH 7.
- 각 유전자 발현 정도를 real-time PCR을 이용해 측정하였다. 100 µg/㎖ 小烏沈湯加減方 sample의 추출된 RNA에 2X SYBR Green Master Mix 25 ㎕와 각각의 유전자들과 10pM forward and reverse primers를 1 ㎕씩 첨가하여 각각 50 ㎕ 반응이 이루어졌으며 95℃에서 10분 후 30초간 40 cycle을 돌린 다음 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응을 일으켰다.
성능/효과
- P815 세포주에 小烏沈湯加減方을 50 µg/㎖, 100 µg/㎖, 200µg/㎖, 400 µg/㎖ 농도로 처리하여 세포 생존을 측정한 결과, 50µg/㎖ 농도에서 108.0 ± 3.67로, 100 µg/㎖ 농도에서 100.4 ±3.70로, 200 µg/㎖ 농도에서는 99.9 ± 6.40로, 400 µg/㎖ 농도에서는 92.5 ± 2.94로 세포 생존에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 1).
- DPPH를 이용한 free radical 소거능을 측정한 결과, 10 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서 9.0 ± 0.77, 100 μg/㎖군에서 10.7 ±1.03, 200 μg/㎖군에서 19.9 ± 2.28, 400 μg/㎖군에서 21.4 ± 2.43의 DPPH radical 소거작용을 나타났다(Table 3).
- SOD 활성 측정 결과, 50 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서는 74.0 ± 2.2 U/㎖, 100 μg/㎖군에서는 94.5 ± 7.0 U/㎖로 SOD 활성이 증가하여 50 μg/㎖군, 100 μg/㎖군 모두 유의한 결과를 얻었다(Fig. 2).
- P815 세포내의 serotonin 함량 측정 결과, 小烏沈湯加減方을 처리하지 않은 대조군에서 124.4 ± 9.9 ng/㎖ protein (100%) 인 것에 비해 50 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서 108.7 ± 14.1 ng/㎖ protein (87.4%), 100 μg/㎖군에서 79.1 ± 5.0 ng/㎖ protein (63.6%)으로 100 μg/㎖ 처리군에서 유의미한 감소를 보였다(Fig. 3).
- P815 세포내의 5-HTT, TPH-1 mRNA 발현을 측정한 결과, 小烏沈湯加減方을 처리하지 않은 대조군에서 5-HTT는 0.996 ±0.005 (100%), TPH-1은 0.996 ± 0.005 (100%)의 mRNA 발현을 보인것에 비해 100 μg/㎖ 小烏沈湯加減方 처리군에서 5-HTT는 0.823 ± 0.067 (82.6%), TPH-1은 0.792 ± 0.097 (79.5%)의 mRNA 발현이 나타나 유의미한 감소를 보였다(Fig. 4, 5).
- SOD 활성 측정 실험 결과, 50 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서는 74.0 ± 2.2 U/㎖, 100 μg/㎖군에서는 94.5 ± 7.0 U/㎖로 농도에 따라 SOD 활성이 증가하였다(Fig. 2).
- DPPH 소거능 측정 결과, 10 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서 9.0 ± 0.77, 100 μg/㎖군에서 10.7 ± 1.03, 200 μg/㎖군에서 19.9± 2.28, 400 μg/㎖군에서 21.4 ± 2.43의 DPPH radical 소거작용을 나타내, 농도 의존적으로 항산화 작용이 증가하였다(Table 3).
- P815 세포내의 serotonin 함량 측정 결과, 50 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서 108.7 ± 14.1 ng/㎖ protein (87.4%), 100 μg/㎖군에서 79.1 ± 5.0 ng/㎖ protein (63.6%)으로 P815 세포내 serotonin 함량이 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 3).
- P815 세포내의 5-HTT, TPH-1 mRNA 발현을 측정한 결과, 100 μg/㎖ 小烏沈湯加減方군에서 5-HTT는 0.823 ± 0.067 (82.6%), TPH-1은 0.792 ± 0.097 (79.5%)로 5-HTT와 TPH-1의 mRNA 발현이 감소하였다(Fig. 4, 5).
후속연구
- 위의 DPPH 소거능, SOD 활성 측정 실험을 통하여 小烏沈湯加減方이 항산화 작용에 유효한 것으로 판단되며, 우울증뿐 아니라 노화억제 등에 폭 넓게 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 의 다른 연구에서는 동물실험에서 ethaverine이 항우울 효과를 보였으나, 뇌에서 serotonin의 변화는 관찰되지 않았다고 보고하였다. 이는 小烏沈湯加減方도 P815 세포 내에서는 serotonin 함량과 5-HTT, TPH-1의 mRNA 발현을 감소시켰으나, 동물실험을 한다면 항우울 효과가 나타날 가능성을 시사하며 그 확인을 위하여 추가실험을 요한다.
- 의 연구에 의하면 SSRI는 serotonin 생성을 증가시킴으로써 작용하지만 5-HT1A 수용체가 과다한 경우에는 negative feedback을 통해 serotonin 생성이 오히려 감소하며, 항우울제에 치료저항성이 있는 환자의 경우 5-HT1A 수용체를 먼저 감소시킴으로써 효능을 향상시킬 수 있다고 보고하였다. 본 실험에서도 P815 세포내에 5-HT1A 수용체의 양이 과다하여 小烏沈湯加減方을 투여하였지만 negative feedback 기전을 나타냈을 가능성이 있으나, P815 세포내의 5-HT1A 수용체 양에 대한 측정 자료가 없기 때문에 판단할 수 없으며 이에 대해서 향후 더 정밀한 추가실험이 필요하다.
- 본 연구에서는 serotonin 신경전달계만 관찰하고 norepinephrine과 dopamine 신경전달계에 대해서는 확인하지 않아, 小烏沈湯加減方이 norepinephrine이나 dopamine 신경전달계에 작용할 가능성이 있으며, 향후 이에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
- 이상으로 小烏沈湯加減方의 항산화와 serotonin 대사 과정에 미치는 영향을 알아본 결과 小烏沈湯加減方이 우울증 치료에 활용될 가능성이 검토되었다. 저자는 본 연구 결과가 향후 小烏沈湯의 약리작용을 규명하기 위한 보다 정밀한 연구계획을 수립하는데 있어 기초 자료를 제공할 것으로 기대한다.
- 이상으로 小烏沈湯加減方의 항산화와 serotonin 대사 과정에 미치는 영향을 알아본 결과 小烏沈湯加減方이 우울증 치료에 활용될 가능성이 검토되었다. 저자는 본 연구 결과가 향후 小烏沈湯의 약리작용을 규명하기 위한 보다 정밀한 연구계획을 수립하는데 있어 기초 자료를 제공할 것으로 기대한다.
- 이상의 연구결과로 보아 小烏沈湯加減方은 우울증 치료에 활용도 가치가 있을 것으로 판단되나 심도 있는 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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