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문제 정의
- 하부 경로 유도제인 m-toluate에 의한 기작이 상부 경로 유도제 톨루엔 발광 기작보다는 높은 억제 영향을 받는 것으로 조사되었다. 따라서 유도제 오염물과 중금속이 복합적으로 오염된 지역의 모니터링을 위해 혼합 중금속이 발광 활성에 미치는 영향에 대한 정보가 필요함을 확인하였다.
- 본 연구에서는 석유계 탄화수소의 구성분인 톨루엔계열 화합물에 발광 활성을 나타내는 Pseudomonas putida mt-2 KG1206을 생물학적 모니터링에 이용할 경우에 단일 및 혼합 중금속(Cu, Cd, As(III), As(V), Cr(VI)) 오염물이 균주의 발광에 미칠 수 있는 영향에 대해 조사한 후, 복합 중금속 오염지 토양 시료에 대한 생물학적 모니터링에서 유도제 오염물에 의한 영향을 분석하였다.
- , 2008). 생물 발광의 유도제 역할을 하는 오염물에 대한 생물모니터링에서 단일 중금속이 발광 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 상이한 5종의 유도제(0.
- 모든 토양은 공기 건조 후 저온실에 밀봉 보관하였다. 중금속 오염 토양이 균주의 발광에 미치는 영향을 조사하기 위하여 토양 추출액에 대한 균주의 발광활성을 조사하였다. 추출액은 토양 10 g과 멸균수 30 mL를 250 rpm, 6 hr 동안 노출 후 상등액을 원심분리 하여 실험에 사용하였다.
가설 설정
- Effects of arsenite on the bioluminescence activity of KG1206 in the presence of different inducers : a) 0.5 mM toluene, b) 0.5 mM m-toluate.
제안 방법
- KG1206의 생물발광에 대한 단일 중금속의 영향을 알아보기 위하여 발광유도제 별 각 중금속에 대한 EC50을 구하였다. 균주 9.
- 개별 시료 특성에 근거한 평가의 한계성때문에 그룹 별 (높은 비소 오염과 낮은 비소 오염 그룹) 영향에 대해 평가를 조사하였다. 높은 비소농도 그룹(#1~#6)에서는 모든 유도제에 대해서 발광 활성이 69~98%(평균 87 ± 10.
- 을 구하였다. 균주 9.8 mL, 시료(중금속 용액 혹은 멸균수) 0.1 mL와 각 발광유도제 화합물(toluene, m-toluate, xylenes) 0.1 mL(최종농도 0.5 mM)를 혼합하여 조사하였다. 최종 중금속 농도는 1~100 mg/L 범위에서 조사하였으며 0.
- 추출액은 토양 10 g과 멸균수 30 mL를 250 rpm, 6 hr 동안 노출 후 상등액을 원심분리 하여 실험에 사용하였다. 균주는 MSM으로 희석(O.D600= 0.3) 후 균주 4.9 mL에 시료(대조군은 MSM용액) 5 mL와 0.1 mL 톨루엔(최종농도 0.5 mM)을 노출 후 일정 시간 간격으로 발광을 측정하였다.
- 혼합(binary mixture) 중금속 오염이 생물발광 활성을 이용한 모니터링에 미치는 영향을 조사하였다. 금속의 혼합은 단일 금속(Cu, Cd, As(III), As(V), Cr(VI))의 EC50 실험 결과를 1 TU(toxic unit)로 기준하여 각 중금속 0.25(1/4 EC50), 0.5(1/2 EC50), 1.0(EC50) TU 농도의 혼합에 대한 영향을 관찰하였다(Table 1). 실험은 단일 중금속 방법과 동일하게 3회 반복 실시하였다.
- 5 hr 동안 400 µL씩 분취하여 Luminometer로 발광 활성을 측정하였다. 노출평가모델링에 사용하기 위해 미국 환경청에서 제공하는 SPEARMAN 프로그램을 이용하여 half maximal effective concentration (EC50)을 계산하였다(Hadjispyrou and Kungolos., 2001). 실험에 사용한 중금속은 다음과 같다: CuCl2·2H2O (Yakuri Chemical Co.
- 단일 중금속이 유도제 오염물에 의한 발광 활성에 미치는 영향을 EC50(50% 영향을 주는 오염원 농도)에 근거하여 비교 분석하였다(Table 2). 상이한 유도제에 의한 발광 활성은 동일한 중금속에 대해서 비슷한 EC50을 나타내었다.
- , 2007). 본 실험에서는 2종의 중금속을 각 3 조합 농도 비율로 혼합하여 영향을 평가하였다(Table 1). 평가 결과에 대한 분석은 많은 가정 및 이론들에 근거하고 있지만, 본 실험에서는 확률이론을 기반으로 한 단순한 수학적 모델을 평가하는 방식을 사용하였다(Kungolos et al.
- 생물 발광의 유도제 역할을 하는 오염물에 대한 생물모니터링에서 단일 중금속이 발광 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 상이한 5종의 유도제(0.5 mM) 노출 조건에서 단일 중금속(1~50 mg/L)이 미치는 영향을 조사하였다. 단일 중금속 영향 중에서 톨루엔과 m-toluate 유도제 오염물 노출 조건에서 As(III)가 발광 활성에 미치는 영향을 대표적으로 나타내었다(Fig.
- 생물 발광을 이용한 토양 시료 생물모니터링에 중금속이 미칠 수 있는 영향을 토양 추출 용액을 이용하여 조사하였다. 임의 노출한 오염물(= 유도제)의 동일한 농도(0.
- 언급한 바와 같이 단일 금속 a1과 a2의 각각의 영향 정도가 P1과 P2라고 할때 이론적으로 예상 영향 정도는 P(E) = P1+ P2− (P1*P2)/100 방정식으로 정의된 이론에 근거하여 분석하였다.
- 중금속 함유 토양 생물모니터링에 대한 발광 균주 활성 영향을 평가하였다. 유도제 오염물은 임의로 첨가하였으며 토양 추출액이 발광 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 토양시료는 대용량 지하수 확보 가능 예정지 주변의 지하 수계에 영향을 줄 수 있는 11 지역의 표층토를 이용하였다.
- 유전자 재조합 발광 균주를 이용하여 석유계탄화수소에 오염된 토양을 모니터링할 경우에 중금속 오염이 생물 발광에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결론을 유도하였다.
- , 1999). 이론적으로 예상되는 독성, P(E)(E = expected)와 실제 관찰 독성, P(O)(O = observed)을 식(1)에 근거하여 예상 독성 P(E)를 구하고 혼합 중금속 노출 결과, P(O)와 비교하였다.
- 중금속 함유 토양 생물모니터링에 대한 발광 균주 활성 영향을 평가하였다. 유도제 오염물은 임의로 첨가하였으며 토양 추출액이 발광 활성에 미치는 영향을 조사하였다.
- 토양시료는 대용량 지하수 확보 가능 예정지 주변의 지하 수계에 영향을 줄 수 있는 11 지역의 표층토를 이용하였다. 지역별로 10 m 반경의 구간에서 5~6개의 토양시료채취지점을 결정하였다. 낙엽이나 뿌리와 같은 이물질이 있을 경우 이들을 제거하고 표층토양을 체질하여 2 mm 미만의 토양입자를 현장에서 채취 하였다.
- 최종 중금속 농도는 1~100 mg/L 범위에서 조사하였으며 0.5 hr 간격으로 2.5 hr 동안 400 µL씩 분취하여 Luminometer로 발광 활성을 측정하였다.
- , 2009; Hadjispyrou and Kungolos, 2001). 혼합 2종 중금속에 의해 이론적 영향 P(E)와 실제 관찰 영향 P(O)을 비교, 분석 하였다. 언급한 바와 같이 단일 금속 a1과 a2의 각각의 영향 정도가 P1과 P2라고 할때 이론적으로 예상 영향 정도는 P(E) = P1+ P2− (P1*P2)/100 방정식으로 정의된 이론에 근거하여 분석하였다.
- 혼합(binary mixture) 중금속 오염이 생물발광 활성을 이용한 모니터링에 미치는 영향을 조사하였다. 금속의 혼합은 단일 금속(Cu, Cd, As(III), As(V), Cr(VI))의 EC50 실험 결과를 1 TU(toxic unit)로 기준하여 각 중금속 0.
대상 데이터
- , Model DF9007)에 보관된 KG1206을 필요시 Luria Broth-kanamycin (LBka)고형배지에 계대 배양하여 사용하였다. 계대 배양한 균주는 LBka 액체배지에 27oC, 130 rpm 조건으로 12 hr 이상 배양 후 1 : 40로 희석 배양하고(O.D600 = 0.6), minimal salt medium(MSM)로 1 : 1 희석하여 O.D600= 0.3으로 조정하여 실험에 사용하였다. KG1206은 kanamycin저항 유전자(Kmr)를 보유하고 있으므로 LB배지에 kanamycin을 50 mg/L로 첨가하여 사용하였다(Ko and Kong, 2008).
- 지역별로 10 m 반경의 구간에서 5~6개의 토양시료채취지점을 결정하였다. 낙엽이나 뿌리와 같은 이물질이 있을 경우 이들을 제거하고 표층토양을 체질하여 2 mm 미만의 토양입자를 현장에서 채취 하였다. 모든 토양은 공기 건조 후 저온실에 밀봉 보관하였다.
- 본 연구에 사용된 유전자재조합균주는 Pseudomonas putida mt-2 KG1206(이하 KG1206)으로 균주 내에 TOL-plasmid와 재조합 플라즈미드를 동시에 보유하고 있다. 재조합 플라즈미드는 TOL-plasmid xyl-gene 하부 promoter인 Pm가 벡터 pUCD615 플라즈미드의 lux-gene 상부에 조합된 플라즈미드로 유도제(inducer)로 작용하는 화합물에 의해 생성되는 조절 인자(regulatory factor)가 Pm을 양성적으로 조절하여 발광유전자가 활동하는 특징을 지닌다(Kong et al.
- 본 연구에서는 초저온고(−70oC; Ilshin Lab Tech. Co., Model DF9007)에 보관된 KG1206을 필요시 Luria Broth-kanamycin (LBka)고형배지에 계대 배양하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 중금속은 다음과 같다: CuCl2·2H2O (Yakuri Chemical Co., Ltd., Japan), CdCl2·H2O(Junsei Chemical Co., Ltd., Japan), Na2HAsO2(Sigma, USA), Na2HAsO4(Wako, Japan), K2CrO4(Kanto Chemical Co. Inc).
- 유도제 오염물은 임의로 첨가하였으며 토양 추출액이 발광 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 토양시료는 대용량 지하수 확보 가능 예정지 주변의 지하 수계에 영향을 줄 수 있는 11 지역의 표층토를 이용하였다. 지역별로 10 m 반경의 구간에서 5~6개의 토양시료채취지점을 결정하였다.
이론/모형
- 본 실험에서는 2종의 중금속을 각 3 조합 농도 비율로 혼합하여 영향을 평가하였다(Table 1). 평가 결과에 대한 분석은 많은 가정 및 이론들에 근거하고 있지만, 본 실험에서는 확률이론을 기반으로 한 단순한 수학적 모델을 평가하는 방식을 사용하였다(Kungolos et al., 2009; Hadjispyrou and Kungolos, 2001). 혼합 2종 중금속에 의해 이론적 영향 P(E)와 실제 관찰 영향 P(O)을 비교, 분석 하였다.
- 혼합 중금속의 영향평가는 확률(probability; P) 이론을 기반으로 하는 간단한 수학적 모델을 이용하였다 (Hadjispyrou and Kungolos., 2001; Kungolos et al., 1999). 이론적으로 예상되는 독성, P(E)(E = expected)와 실제 관찰 독성, P(O)(O = observed)을 식(1)에 근거하여 예상 독성 P(E)를 구하고 혼합 중금속 노출 결과, P(O)와 비교하였다.
성능/효과
- (2) 발광유도제 오염물에 대한 중금속 독성(EC50에 근거) 은 As(III) > Cd, As(V) > Cu, Cr(VI) 순서로 조사되었으며 As(III)가 가장 높은 독성 영향을 나타내었다.
- (3) 혼합 중금속의 영향에 대한 일정한 경향은 관찰할 수 없었지만, 대부분 첨가 작용을 나타내었으나 일부 상승과 길항 현상을 관찰할 수 있었다.
- (4) 토양 시료의 총중금속 농도와 생물발광간의 상관성을 평가하기는 어려웠으나, 특정 오염원에 근거한 그룹에 대한 상관성 평가는 매우 통계적 유의한 결과를 나타내었다.
- 1~10 mg/L 노출에서는 억제 후 발광 활성 회복을 보였으며 대체적으로 1.5~2.5 hr 부터는 대조군과 동일한 발광(>9,999 RLU)을 나타내었다.
- 3). 높은 표준편차 값에 근거할 때 시료 집단 간의 흐트러짐 정도, 즉 발광 활성 영향에 시료 간 뚜렷한 차이가 있다고 판단할 수 있었다. 대조군에 대한 오염원, 즉 유도제별 상대 발광 범위는 가장 높은 toluene 102 ± 13.
- 대조군에 대한 오염원, 즉 유도제별 상대 발광 범위는 가장 높은 toluene 102 ± 13.4%부터 가장 낮은 o-xylene 80 ± 30.7%(두 그룹 간 통계치 p = 0.0543)으로 조사되어 오염물 별 영향에 통계적 유의성이 있음을 확인하였다.
- 따라서 유전자 재조합균주를 이용하여 석유계탄화수소와 중금속으로 오염된 토양을 모니터링 할 경우에는 단일 및 혼합 중금속이 미칠 수 있는 정확한 영향에 대한 고려와 단일 시료 특성에 대한 평가보다 특성별 그룹화에 대한 접근 평가가 효율적인 방법임을 확인하였다.
- 그러나 반대로 일부 시료는 중금속 오염 농도와는 상관성이 없이 높은 오염에 높은 발광(낮은 독성)(시료 #4 총중금속 739 mg/kg, 비소 433 mg/kg, m-xylene 발광 141%, p-xylene 발광 127%), 낮은 오염에 낮은 발광(높은 독성)(시료 #7과 8, 총중금속각 206, 210 mg/kg, 비소 < 1 mg/kg, o-xylene 64%) 현상을 나타내었다. 따라서 토양 시료의 경우에는 각 시료별 총 오염원 농도와 활성 간의 상관성 평가가 복합적 오염 특성으로 인하여 용이하지 않았으며 총중금속 농도와 각 시료 용출액에 대한 생물발광 강도 간에는 거의 상관성이 없는 것으로 조사되었다.
- 또한 반대로 Cu 혼합 실험조건에서는 24 조건 중 16 조건에서 P(O) > P(E)로 나타나 상승작용을 유발하였다. 따라서 혼합 중금속에 의한 영향은 매우 복잡한 경향을 나타내고 있음을 확인하였다. 상호작용은 생물 종과 오염물 종류 뿐 아니라 상대적인 농도에 따라 다양한 결과를 나타낼 수 있음이 다양한 연구 결과에 의해 보고되어 있다 (Koutsaftis and Aoyama.
- 또한 대조군(100%)에 대한 전체 토양 시료의 상대적 생물발광 범위는 18~162%(평균 98 ± 29.8)로서 시료별 매우 상이한 영향을 나타내었다(Fig. 3).
- 0543)으로 조사되어 오염물 별 영향에 통계적 유의성이 있음을 확인하였다. 일부 높은 총중금속 함유 시료와 낮은 총중금속(As, Cu, Cr, Pb, Zn, Cd) 함유 일부 시료 간에 뚜렷한 생물발광 차이를 관찰할 수 있었다. 예를 들면 시료 #1(총중금속 920 mg/kg, 비소 627 mg/kg)과 #2(총중금속 822 mg/kg, 비소 566 mg/kg) 는 각 44%(m-xylene) 및 48%(p-xylene)독성을 나타내었다.
- 5 hr 부터는 대조군과 동일한 발광(>9,999 RLU)을 나타내었다. 하부 경로 유도제인 m-toluate에 의한 기작이 상부 경로 유도제 톨루엔 발광 기작보다는 높은 억제 영향을 받는 것으로 조사되었다. 따라서 유도제 오염물과 중금속이 복합적으로 오염된 지역의 모니터링을 위해 혼합 중금속이 발광 활성에 미치는 영향에 대한 정보가 필요함을 확인하였다.
후속연구
- , 1990). 따라서 향후 적절한 영향 평가를 위해서는 다양한 생물 및 측정 종말점과 혼합 오염물에 의한 영향을 고려한 통합 결과를 이용하는 것이 더욱 적절한 평가법이 될 것이다.
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