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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 오가피속 식물 중 탐라오가피를 건강기능식품 원료로 개발 시 원료의 표준화를 위하여 eleutheroside B, E 및 β-glucan의 분석방법 및 분석법 검증에 대한 연구를 실시하였다.
제안 방법
- β-Glucan 분석방법은 정제하여 β- glucan 함량이 표기된 yeast β-glucan(58.5%)을 분석하여 회수율을 측정하였다.
- Eleutheroside B 표준용액은 각각 0, 15.625, 31.25, 62.5, 125 μg/mL의 단계적으로 희석하였고 eleutheroside E 표준용액은 0, 43.75, 87.5, 175, 350 μg/mL로 희석하여 HPLC로 분석한 값으로 검량선을 작성하였다(Fig. 5).
- 추출방법에 따른 수율은 뿌리와 줄기 각각 12%와 14%를 나타내었다. Eleutheroside B와 E의 HPLC 분석은 Choi 등(17)의 방법을 변형하여 실시하였으며 서로 다른 두 개의 표준물질을 동시분석하기 위해 spectrophotometer(Optizen POP, Mecasys Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 사용하여 190 nm부터 400 nm까지 흡광도를 측정하여 동시분석이 가능한 최대흡수파장을 분석하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co.
- HPLC를 이용한 분석방법은 개별인정형 건강기능식품 기능성원료로 등록하기 위한 지표성분으로서 의약품 등 분석법 검증에 대한 가이드라인(18)을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limit of detection, LOD, S/N=3) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ, S/N=10)를 사용하였으며, β-glucan 분석방법은 검증을 바탕으로 정밀성과 정확성을 이용하여 과학적으로 분석법의 유효성을 확인하였다.
- HPLC를 이용한 분석방법은 추출방법에 따라 추출한 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물을 일간(inter-day)과 일내(intra-day)로 나누어 정밀도 실험을 실시하였다. 일간 정밀도는 1일 1구간(16:00)으로 3일간 진행하였고 일내 정밀도는 1일 3구간(00:00, 08:00, 16:00)으로 나누어 진행하였다.
- 농도를 알고 있는 탐라오가피 뿌리 추출물에 표준용액 eleutheroside B 31.25, 62.5, 125 μg/mL와 eleutheroside E 87.5, 175, 350 μg/mL의 세가지 농도를 각각 첨가하여 HPLC로 분석하였다.
- 정확성은 회수율을 측정하여 그 결과로 나타내었다. 농도를 알고 있는 탐라오가피 뿌리 추출물에 표준용액을 각각 3가지 농도로 첨가한 뒤 HPLC로 분석하여 검출되는 농도를 측정하였다. Table 4과 같이 eleutheroside B는 첨가된 농도 31.
- 141 min으로 일치하였다. 또한 표준용액과 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물의 PDA spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다 (Fig. 4).
- 5, 175, 350 μg/mL의 세가지 농도를 각각 첨가하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 결과를 아래 식을 이용하여 회수율(recovery)로 나타내어 HPLC 분석방법의 정확성을 확인하였다. β-Glucan 분석방법은 정제하여 β- glucan 함량이 표기된 yeast β-glucan(58.
- 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 β-glucan 분석방법의 정밀도 실험 또한 동일하게 일간 정밀도는 1일 1구간(15:00)으로 3일간 진행하였고 일내 정밀도는 1일 3구간(01:00, 08:00, 15:00)으로 나누어 진행하여 분석하였다.
- 이 방법은 β-glucanase 역가를 갖는 효소를 사용하여 β-glucan만을 특이적으로 가수분해 한 후 유리된 포도당 함량을 측정하는 방법으로 total-glucan과 α-glucan 함량의 차에 의해 구하였다.
- 이외에 탐라오가피에 함유된 다양한 생리활성 물질들 중 면역증진과 연관된 β-glucan 성분을 분석하여 eleutheroside B, E 지표성분과 함께 이용하고자 한다.
- HPLC를 이용한 분석방법은 추출방법에 따라 추출한 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물을 일간(inter-day)과 일내(intra-day)로 나누어 정밀도 실험을 실시하였다. 일간 정밀도는 1일 1구간(16:00)으로 3일간 진행하였고 일내 정밀도는 1일 3구간(00:00, 08:00, 16:00)으로 나누어 진행하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 β-glucan 분석방법의 정밀도 실험 또한 동일하게 일간 정밀도는 1일 1구간(15:00)으로 3일간 진행하였고 일내 정밀도는 1일 3구간(01:00, 08:00, 15:00)으로 나누어 진행하여 분석하였다.
- 탐라오가피 뿌리 및 줄기에 함유된 eleutheroside B 및 E를 분석하기 위해 Lee 등(16)의 방법을 변형하여 Fig. 1과 같이 각 부위별 시료 10 g을 추출용기에 넣고 50% MeOH 250 mL를 사용하여 70°C 조건에서 4시간씩 2회 반복 환류 추출 하였다.
- 탐라오가피를 이용하여 건강기능식품 개발 시 원료의 표준화를 위한 eleutheroside B, E 및 β-glucan의 함량 및 분석법 검증을 실시하였다.
- 표준물질 eleutheroside B는 0, 15.625, 31.25, 62.5, 125 μg/mL로 eleutheroside E는 0, 43.75, 87.5, 175, 350 μg/mL로 제조하여 HPLC를 이용, 3회 반복 측정하였으며 chromatogram에 대한 면적과 표준용액의 농도를 변수로 하여 검량선을 작성하고 작성한 검량선의 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
- 표준물질 eleutheroside B와 E 그리고 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물을 HPLC로 분석한 뒤 chromatogram을 비교하여 eleutheroside B와 E가 선택적으로 분리가 되는지 확인하였으며, PDA(photo diode array) spectrum을 이용하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 β-glucan 분석에 사용된 enzyme assay kit는 Megazyme Ltd.(Bray, Wicklow, Ireland)에서 구입하여 사용하였다.
- 1과 같이 각 부위별 시료 10 g을 추출용기에 넣고 50% MeOH 250 mL를 사용하여 70°C 조건에서 4시간씩 2회 반복 환류 추출 하였다. Filter paper(No. 3, Whatman, Maidstone, Kent, UK)로 여과한 추출물은 회전식 진공 농축기(Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 농축 후에 동결건조(Ilshinbiobase Co., Ltd., Gyeonggi, Korea) 하여 실험에 사용하였다. 추출방법에 따른 수율은 뿌리와 줄기 각각 12%와 14%를 나타내었다.
- 본 실험에서 사용한 탐라오가피(A. koreanum)는 제주도에서 2012년에 재배한 것으로 뿌리 및 줄기 부위를 구입하여 선별한 후, 동결건조 하여 분말화 한 것으로 분석실험에 사용하였다. Eleutheroside B와 E 표준물질(purity≥98.
- 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co., Milford, MA, USA)로 조건은 Table 1과 같으며 분석용 column은 Sunfire™ C18(4.6 mm×250 mm, 5.0 μm, Waters Co.)을 사용하였다.
데이터처리
- 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 β-glucan 분석방법의 정밀도 실험 또한 동일하게 일간 정밀도는 1일 1구간(15:00)으로 3일간 진행하였고 일내 정밀도는 1일 3구간(01:00, 08:00, 15:00)으로 나누어 진행하여 분석하였다. 각각의 정량한 값은 표준편차를 평균으로 나누어 백분율로 나타내었다.
성능/효과
- β-Glucan 분석법 검증 결과, 100.03%의 회수율을 보였으며 분석오차는 2.33%로 높은 정확도를 보여주었고, 일간(inter-day) 정밀도는 1.32~5.67%이었으며 일내(intra-day) 정밀도는 8.01~11.76%의 정밀성을 나타내었다.
- β-Glucan 분석법의 정확성은 β-glucan이 58.5%(w/w) 함유되어 있는 효모를 이용하여 확인하였으며 회수율을 측정한 결과, Table 5와 같이 100.03%의 높은 회수율을 보였으며 분석오차는 2.34%로 5% 이내의 값을 나타내었다.
- 분석법 검증결과, HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 피크유지시간과 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물의 피크유지시간이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Eleutheroside B와 E의 검량선은 각각 0.9997, 0.9999로 1에 가까운 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Eleutheroside B와 E의 검출한계는 각각 0.
- Eleutheroside B의 함량은 탐라오가피 뿌리 및 줄기에서 각각 525.7±16.8, 525.1±21.1 μg/g으로 큰 차이가 없었으며 eleutheroside E의 함량은 뿌리 및 줄기에서 각각 1,315.3±22.7, 1,037.5±22.2 μg/g으로 뿌리에 더 많은 eleutheroside E가 함유되어 있었다.
- Eleutheroside B의 함량은 탐라오가피 뿌리 및 줄기에서 각각 525.7±16.8, 525.1±21.1 μg/g이었으며 eleutheroside E의 함량은 뿌리 및 줄기에서 각각 1,315.3±22.7, 1,037.5±22.2 μg/g의 함량을 가지고 있는 것으로 분석되었다.
- Spectrophotometer를 사용하여 190 nm부터 400 nm까지의 흡수파장을 분석한 결과(Fig. 2), eleutheroside B는 220 nm에서 eleutheroside E는 210 nm에서 각각 최대흡수파장을 나타냈다. Feng 등(19)에 의하면 eleutheroside B와 E를 각각 206 nm와 220 nm에서 분석하였다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
- 검출한계와 정량한계는 신호 대 잡음비(signal-to-noise)에 근거하여 분석한 결과 eleutheroside B와 E의 검출한계는 각각 0.050 μg/mL, 0.025 μg/mL로 측정되었으며 정량한계는 eleutheroside B와 E에서 모두 0.250 μg/mL로 나타났다.
- 2에서 보는 바와 같이 eleutheroside E의 경우 최대흡수파장을 220 nm로 하여 eleutheroside B와 함께 동시분석 할 경우 최대흡수파장 영역을 벗어나 peak의 감도가 매우 낮아지게 된다. 따라서 탐라오가피에 함유된 eleutheroside을 동시에 분석하기 위해서는 최대흡수파장을 210 nm로 하여 분석하는 것이 적합한 것으로 나타났다.
- 1%로 일간 정밀도보다 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 eleutheroside B는 100.66~110.04%, eleutheroside E는 94.26~111.62% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. β-Glucan 분석법 검증 결과, 100.
- 22%(w/w)로 줄기에 가장 많은 β-glucan이 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과, 지표성분인 eleutheroside B와 E의 HPLC를 이용한 동시분석 방법과 β-glucan 분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
- 탐라오가피를 이용하여 건강기능식품 개발 시 원료의 표준화를 위한 eleutheroside B, E 및 β-glucan의 함량 및 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증결과, HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 피크유지시간과 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물의 피크유지시간이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Eleutheroside B와 E의 검량선은 각각 0.
- 이상의 결과를 볼 때, 오가피 속 식물들의 건강기능식품 원료로 이용 시 eleutheroside B와 E는 HPLC를 이용하여 동시분석이 가능하며, β-glucan은 효소적 방법에 의하여 정량분석이 가능한 것으로 나타났다.
- 2 μg/g으로 뿌리에 더 많은 eleutheroside E가 함유되어 있었다. 정밀도(RSD) 측정 결과, eleutheroside B와 E는 일간 정밀도에서 각각 1.4~5.0, 1.1~2.5%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 각각 2.8~2.9, 0.4~1.1%로 일간 정밀도보다 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 eleutheroside B는 100.
- 탐라오가피 줄기, 잎 및 열매의 β-glucan 함량은 각각 5.32±0.38, 4.34±0.32, 3.71±0.22%(w/w)로 줄기에 가장 많은 β-glucan이 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
- 특이성은 불순물, 분해물, 추출물 등이 혼합된 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로 다른 물질의 간섭 없이 분리될 수 있는 것으로 특이성을 확인하게 된다. 표준용액과 탐라오가피로 뿌리 및 줄기로부터 추출한 용액의 chromatogram을 비교하여 eleutheroside B와 E peak가 분리됨을 확인한 결과 Fig. 3과 같이 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며 표준용액의 peak 유지 시간(retention time, RT)과 추출물의 peak 유지시간이 평균 eleutheroside B는 5.254 min, eleutheroside E는 11.141 min으로 일치하였다. 또한 표준용액과 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물의 PDA spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다 (Fig.
- 한편 탐라오가피 줄기, 잎 및 열매의 β-glucan 분석방법의 정밀도 측정 결과, 일간 정밀도와 일내 정밀도는 각각 1.32~5.67%, 8.01~11.76% 이었으며 β-glucan 함량은 각각 5.32±0.38, 4.34±0.32, 3.71±0.22%(w/w)이었다(Tabel 3).
후속연구
- 이상의 결과를 볼 때, 오가피 속 식물들의 건강기능식품 원료로 이용 시 eleutheroside B와 E는 HPLC를 이용하여 동시분석이 가능하며, β-glucan은 효소적 방법에 의하여 정량분석이 가능한 것으로 나타났다. 이들 성분들을 오가피속 식물들의 유용성분 및 지표성분으로 선정 시 분석법 검증을 통하여 이들 원료의 표준화가 가능할 것으로 사료된다.
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