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문제 정의
- Zhu 등은 luxS 유전자를 이용하여 Serratia에 대한 genus- specific PCR 기법을 보고한 바 있다[23]. 본 실험에서는 Serratia marcescens에 대한 species-specific PCR을 개발하기 위하여 quorum-sensing gene으로 알려진 luxS 유전자를 대상으로 primers를 제작하였으며, 그 염기서열은 Table 2에 나타난 바와 같다.
- 본 연구에서는 돼지정액에 빈번히 오염되지만 PCR진단법이 확립되어 있지 않은 S. marcescens에 대한 PCR 진단법을 개발하였고, 돼지정액 희석제에 활용도를 높이기 위하여 항생제 감수성, MIC 및 MBC실험을 통하여 유효 항생제 농도를 알아보고자 하였다.
- 이러한 내용을 배경으로, 본 연구에서는 S. marcescens에 특이적인 PCR기법을 개발하고, 아울러 국내 돼지정액 유래주의 항생제 감수성 양상, 최소생육억제농도, 최소살균농도 등을 조사하여 정액 희석제에 활용될 수 있도록 유효 항생제를 선발하고자 하였다.
제안 방법
- 9되도록 조절하여 Mueller Hinton Agar (Difco, USA)에 도말하였다. 15분 이내에 항생제 디스크를 배지 위에 배치한 후 37℃, 24시간 배양하여 억제환을 측정하였다. 사용된 항생제(농도)는 총 12종으로서 ampicillin (10 μg), bacitracin (10 μg), colistin (10 μg), gentamicin (10 μg), neomycin (30 μg), penicillin (10 μg)(이상 6종; BD, USA)과 apramycin (15 μg), ceftiofur (30 μg), enrofloxacin (5 μg), florfenicol (30 μg), oxytetracycline (30 μg), spectinomycin (100 μg)(이상 6종; Oxoid, UK)을 사용하였다.
- 반응조건은 initial denaturation (94℃, 5 ) 후, denaturation (94℃, 30 초), annealing (56℃, 30 초), extension (72℃, 30 초)을 30회 반복하고, final extension (72℃, 5 분)을 실시하였다. PCR 증폭산물은 1.5% agarose gel, 145 V, 45분 전기영동하여 특이 유전자 증폭유무를 관찰하였다.
- PCR은 Maxime PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 사용하였으며, 10 pmoles/μl로 희석된 forward, reverse primers (Table 2) 각각 1 μl와 template DNA 용액 1 μl를 첨가한 후 멸균증류수로 최종 20 μl 되도록 조정하여 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다.
- 사용된 항생제(농도)는 총 12종으로서 ampicillin (10 μg), bacitracin (10 μg), colistin (10 μg), gentamicin (10 μg), neomycin (30 μg), penicillin (10 μg)(이상 6종; BD, USA)과 apramycin (15 μg), ceftiofur (30 μg), enrofloxacin (5 μg), florfenicol (30 μg), oxytetracycline (30 μg), spectinomycin (100 μg)(이상 6종; Oxoid, UK)을 사용하였다. 감수성 유무는 제조사의 판독 기준에 따라 판정하였다.
- 를 사용하여 종간 교차 반응 유무를 조사하였다. 또한 개발 PCR기법이 국내 돼지정액에서 분리된 S. marcescens에 적용이 가능한 지 알아보기 위하여 돼지정액 유래의 S. marcescens 분리균주 6주를 PCR에 적용하였다.
- marcescens ATCC 13880을 포함하여 돼지정액에서 분리 보고된 19종의 표준균주를 개발된 PCR기법에 적용하여 특이도를 관찰하였으며, 5종의 Serratia spp.를 사용하여 종간 교차 반응 유무를 조사하였다. 또한 개발 PCR기법이 국내 돼지정액에서 분리된 S.
- 민감도 측정은 순수 배양된 S. marcescens ATCC 13880을 QIAamp DNA Mini Kit로 DNA를 추출하여 50 ng/μl로 조정한 후 이를 멸균 증류수로 5 fg/μl까지 10진 단계희석하여 개발 PCR기법의 검출민감도를 조사하였다.
- PCR은 Maxime PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 사용하였으며, 10 pmoles/μl로 희석된 forward, reverse primers (Table 2) 각각 1 μl와 template DNA 용액 1 μl를 첨가한 후 멸균증류수로 최종 20 μl 되도록 조정하여 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 반응조건은 initial denaturation (94℃, 5 ) 후, denaturation (94℃, 30 초), annealing (56℃, 30 초), extension (72℃, 30 초)을 30회 반복하고, final extension (72℃, 5 분)을 실시하였다. PCR 증폭산물은 1.
- 비용혈성이며 lactose 음성인 유사 집락을 순수분리하여 VITEK 2 Compact (bioMérieux, France)로 분리 균주의 동정을 실시하였다.
- 항생제는 다양한 작용기전으로 세균의 증식을 억제시키지만 과용량 사용 시에는 오히려 숙주세포변성을 초래할 수 있다. 자료로 제시되지 않았지만, 본 연구에서는 동물세포주 (vero cell)를 이용하여 사용한 항생제의 세포변성 유무를 조사 하였는데, 검사한 항생제 12종(Table 4)을 최고농도로 동물세포주 적용하여도 세포변성효과는 나타나지 않았다.
- 03∼32 µg/ml)이었다. 항생제가 첨가되지 않은 growth control을 설정하였으며, MIC 판독은 배양액이 생육하지 않은 농도 중 항생제가 최소 첨가된 농도로 결정하였으며, 대조균주로 E. coli ATCC 25922를 사용하였다.
대상 데이터
- 국내 인공수정센터에서 생산된 돼지 원정액 100 μl를 5% sheep blood agar plate (Asan pharmaceutical, Korea)와 MacConkey agar (Difco, USA)에 접종하여 37℃, 18∼24시간, 호기 배양하였다.
- 면양혈액배지에서 24∼48시간 배양된 균을 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, USA)로 DNA를 추출하여 template DNA 용액으로 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균주는 돼지정액에서 분리빈도가 높다고 보고된 균종과(Table 1) 국내 돼지정액에서 분리된 S. marcescens를 사용하였다. Zhu 등은 luxS 유전자를 이용하여 Serratia에 대한 genus- specific PCR 기법을 보고한 바 있다[23].
- 사용된 항생제(농도)는 총 12종으로서 ampicillin (10 μg), bacitracin (10 μg), colistin (10 μg), gentamicin (10 μg), neomycin (30 μg), penicillin (10 μg)(이상 6종; BD, USA)과 apramycin (15 μg), ceftiofur (30 μg), enrofloxacin (5 μg), florfenicol (30 μg), oxytetracycline (30 μg), spectinomycin (100 μg)(이상 6종; Oxoid, UK)을 사용하였다.
이론/모형
- 국내 돼지정액에서 분리된 S. marcescens의 항생제 감수성 검사는 Bauer 등의 방법에 따라 실시하였다[4]. 간략히 설명하면, 신선하게 배양된 S.
- 항생제에 대한 MIC 측정은 CLSI guideline에 따라 microbroth dilution방법으로 다음과 같이 실시하였다[6]. 배양균액을 McFarland No.
성능/효과
- 또한 검사한 Serratia spp. 5종에 대해서도 S. marcescens를 제외한 나머지 4종(S. liquefaciens, S. odorifera, S. plymuthica, S. rubidaea)에서는 음성으로 확인되었다(Fig. 2). 한편 국내 돼지정액에서 분리된 6주의 S.
- luxS유전자를 이용한 개발 PCR 기법은 돼지정액 내 오염빈도가 높은 균종들에 대해서 유전자 증폭산물을 형성하지 않았으며 S. marcescens만 특이적으로 검출할 수 있었다. 한편 개발 PCR 기법은 S.
- 개발 PCR 기법의 민감도를 확인한 결과, S. marcescens에서 추출한 DNA 용액 50 pg/μl까지 검출이 가능하였다(Fig. 4)
- 검사한 대부분의 항생제에서 MIC와 MBC의 결과가 유사하였으며, bacitracin, colistin, florfenicol, oxytetracycline, penicillin, spectinomycin의 경우에는 사용한 최고 농도의 항생제에서도 분리주가 살균되지 않았다. 한편 gentamicin, neomycin, spectinomycin의 MBC90은 MIC90보다 2~3단계 높은 항생제 농도에서 분리주가 살균되었다.
- 국내 돼지정액에서 분리된 S. marcescens를 대상으로 항생제 디스크로 감수성 시험을 실시한 결과, gentamicin (100%), ceftiofur (83.3%), florfenicol (83.3%), neomycin (83.3%)에서는 높은 감수성을 나타냈으며, apramycin (66.7%), enrofloxacin (66.7%), oxytetracycline (50.0%), spectinomycin (50.0%), colistin (33.3%) 순으로 감수성이 나타났다. 하지만 ampicillin, bacitracin, penicillin에서는 모든 분리균주가 100% 내성율을 나타내었다(Table 3).
- 돼지정액 유래 S. marcescens의 항생제 MIC를 조사한 결과, bacitracin, colistin, oxytetracycline, penicillin의 경우 사용된 항생제 농도범위 중 최고농도에서도 균이 생육하였으며, florfenicol과 spectinomycin의 MIC50은 각각 64 µg/ml와 16µg/ml로 나타났다.
- marcescens를 특이적으로 검출할 수 있는 기법은 아직 개발되지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서 개발된 PCR기법은 돼지정액의 주요 오염세균 중 하나인 S. marcescens를 특이적으로 검출할 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 개발된 PCR 기법의 특이도를 확인한 결과, S. marcescens ATCC 13880에서만 306 bp의 특이 유전자 증폭산물이 확인되었으며, 그 외 돼지정액에서 많이 분리되는 Pseudomonas spp.를 비롯한 18균종에서는 전혀 유전자 증폭산물이 관찰되지 않았다(Fig.
- 본 연구에서 개발된 PCR기법을 사용하면 돼지정액에 빈번히 오염되는 S. marcescens를 효율적으로 검출할 수 있을 것으로 판단되었다. 한편, MIC 시험으로 선발된 ceftiofur, enrofloxacin, gentamicin은 희석액 ml당 8 µg을 첨가하여 사용하는 것이 권장되며, neomycin은 희석액 ml당 16 µg이 권장되었다.
- marcescens는 cephalothin, sulfamethoxazole, ampicillin, tetracycline에서 90% 이상의 내성율을 보고하였다[13]. 본 연구에서는 국내 돼지정액에서 분리된 S. marcescens를 대상으로 12종의 수용성 항생제로 감수성 시험을 실시한 결과, gentamicin, ceftiofur, florfenicol, neomycin에서 80% 이상의 높은 감수성을 나타내었으며(Table 3), 이러한 결과는 gentamicin에 감수성이 높다는 Cooksey 등의 결과와 유사하였다[7].
- 검사한 대부분의 항생제에서 MIC와 MBC의 결과가 유사하였으며, bacitracin, colistin, florfenicol, oxytetracycline, penicillin, spectinomycin의 경우에는 사용한 최고 농도의 항생제에서도 분리주가 살균되지 않았다. 한편 gentamicin, neomycin, spectinomycin의 MBC90은 MIC90보다 2~3단계 높은 항생제 농도에서 분리주가 살균되었다.
- 2). 한편 국내 돼지정액에서 분리된 6주의 S. marcescens에서 특이 유전자 증폭산물이 확인되어(Fig. 3), 본 연구에서 개발한 PCR 기법이 S. marcescens를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이러한 차이는 검사 균주의 분리재료, 축종, 국가별 항생제 사용현황 등에 따라내성률의 차이가 나타난 것으로 추정되었다. 따라서 돼지 정액제품에서 분리된 세균의 항생제 내성율 변화를 주기적으로 조사하여 국내 돼지 정액 희석제용으로 적합한 항생제 선발이 필요할 것으로 판단된다.
- 한편, MIC 시험으로 선발된 ceftiofur, enrofloxacin, gentamicin은 희석액 ml당 8 µg을 첨가하여 사용하는 것이 권장되며, neomycin은 희석액 ml당 16 µg이 권장되었다. 이러한 항생제는 국내 돼지정액의 주요 오염세균인 S. marcescens 관리에 적합한 희석제용 항생제로 판단되며, 위생적인 정액 공급으로 돼지 번식효율 상승 및 생산성 향상에 이바지할 것으로 기대된다.
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