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문제 정의
- 00으로 나타나 처리효소와 조건에 따라 단백질 분해 및 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드 분획의 수율이 달라짐을 나타내었다. 본 연구에서는 multifect PR 6L 효소처리가 가장 높은 수율을 얻을 수 있는 것으로 판단된다. 제주산 마(한라마) 사골 추출물과 분자크기에 따른 효소 분해물의 단백질함량은 Table 2에 나타내었다.
- 이렇듯 말뼈와 관련된 연구는 주로 골다공증, 뼈 성장 등에 관한 것이고 말뼈추출물과 저분자의 효소분해물의 항산화 기능에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 시중 유통되는 제주산 마(한라마) 사골 열수 추출물을 식품 효소를 이용하여 저분자화하였고 저분자 추출물의 항산화 기능을 확인하기 위해 실시하였다.
제안 방법
- ABTS 라디칼 소거능은 Re 등[26]의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.
- DPPH 라디칼 소거능은 Blois [5] 방법을 변형하여 측정하였다. 농도를 제주산 마(한라마) 사골추출분말 20 mg/ml로 조정한 각 시료 1 ml와 0.
- ORAC assay는 기존 여러 항산화 활성 측정방법에 비해 반응 감도가 예민하여 정확도가 높은 것으로 알려져 있다[23,24]. ORAC의 측정 결과는 Fig. 6에 나타내었으며, 표준시약으로 비타민 E 수용성 유도체인 trolox를 사용하여 그 효과를 비교하였다. 각 효소분해물은 분자량이 작을수록 더 강한 ORAC값을 나타내었다.
- 3에 나타내었다. 소거능은 trolox의 표준물질로 하여 trolox의 항산화효과를 나타내는 농도(mM)와 비교하여 표시하였다. 제주산 마(한라마) 사골추출물 자체는 PS 처리군의 3 kDa 이상의 분획과 함께 가장 낮은 DPPH 소거능을 보였다(p<0.
- 시료 또는 표준 시약인 trolox 25 μl와 미리 만들어놓은 반응용액 175 μl를 혼합하여 암실에서 30분간 방치한 후, 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 0에서 2시간 정치)으로 보정하였고 각각 60℃, 50℃, 50℃에서 4시간 동안 분해 하였다. 이를 3 kDa의 크기를 기준으로 분리하기 위해 멤브레인 여과 장치(3 kDa, Millipore, Ireland)를 이용하여 3 kDa 이상의 고분자 분해물과 3 kDa 이하의 저분자 분해물로 분리하였으며, 각각 MP, PS, PSPC로 표기한 후 동결건조하여 -20℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다.
- Prosi prestained protein marker (GenDEPOT, USA)를 사용하여, 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 사용하였으며 시료는 제주산 마(한라마) 사골 추출물을 분말화하여 단백질 함량 정량 후, 2X sample buffer와 1:1로 혼합한 후 100℃에서 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치 (PageRun, AE-6531, ATTO, Japan)를 이용하여 100 V로 전기 영동 하였으며, 0.25% Coomassie brilliant blue R-250, 5% methanol와 7.5% acetic acid으로 제조한 염색액을 이용하여 젤을 염색하였고, 7.5% acetic acid와 25% methanol로 만든 탈색액으로 탈색하여 분리된 단백질 밴드를 확인하였다.
- 제주산 마(한라마) 사골 추출물을 효소분해하여 3 kDa 보다 큰 분획과 작은 분획을 회수하였으며 각각의 수율을 Table 1에 나타내었다. 제주산 마(한라마) 사골 추출물 분말의 수율을 100으로 하였을 때 효소분해 후 3 kDa 이상의 크기의 분획 수율은 PS와 PSPC 처리군에서 각각 89.
- 여과액은 동결 건조(EYELA, FDU-1200, Japan)한 후 Folch 용액(Chloroform: Methanol, 2:1, v/v)을 첨가하여 지방제거 하였고 40℃의 drying oven에서 건조하여 사용하였다. 제주산 마(한라마) 사골 추출분말에 8배의 물을 가한 후 80℃에서 1시간 수화 시킨 후, multifect PR 6L, pepsin, pepsin과 pancreatin 혼합효소(1:1)을 사골 추출물 중량당 각각 0.2%씩 첨가하여 각각 pH 8.0, 3.0, 3.0~8.0 (pH 3.0에서 2시간 정치 후 pH 8.0에서 2시간 정치)으로 보정하였고 각각 60℃, 50℃, 50℃에서 4시간 동안 분해 하였다. 이를 3 kDa의 크기를 기준으로 분리하기 위해 멤브레인 여과 장치(3 kDa, Millipore, Ireland)를 이용하여 3 kDa 이상의 고분자 분해물과 3 kDa 이하의 저분자 분해물로 분리하였으며, 각각 MP, PS, PSPC로 표기한 후 동결건조하여 -20℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다.
- 이 후 25 μl AAPH (150 mM)을 넣고 완전하게 혼합한 뒤 fluorescent microplate reader (SpectraMax M2e, Molecular Devices, USA)를 사용하여 37℃에서 excitation wavelength 485 nm 그리고 emission wavelength 520 nm에서 60분 동안 1분 간격으로 측정하였다. 표준시약(trolox)과 시료의 area under the curve(AUC)를 측정하였으며, 표준시약 농도와 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 mM trolox equivalent으로 나타내었다.
- 사골 중량의 10배 물을 넣고, 30분간 끓인 후 찬물로 씻어 이물질을 제거하였다. 핏물과 이물질을 제거한 말 사골 중량의 4배의 물을 다시 가한 후 8시간씩 3회 추출하여 거즈로 여과하였다. 여과액은 동결 건조(EYELA, FDU-1200, Japan)한 후 Folch 용액(Chloroform: Methanol, 2:1, v/v)을 첨가하여 지방제거 하였고 40℃의 drying oven에서 건조하여 사용하였다.
대상 데이터
- 말뼈는 제주 재래마와 더러브렛(Thoroughbred)종 사이의 교잡종인 제주산 마(한라마)의 뒷 다리뼈를 (주)청정해에서 구입하여 이용하였다. 1,1-diphenyl-2picryl-hydrazyl(DPPH),2,2-azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium persulfate, 2,4,6- tris(2- pyridyl)-s-triazine (TPTZ), iron (III) chloride hexahydrate, fluorescein sodium salt, 2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), 6- hydroxy- 2,5,7,8- tetramethylchromane- 2-carboxylic acid (trolox)는 Sigma Chemical Co. (USA) 제품을 구입 하여 사용하였다. 사용 효소인 Multifect PR 6L, pepsin, pancreatin은 ㈜ 비전바이오캠(Sungnam, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- SDS-PAGE는 Laemmli [17]의 방법을 일부 변형하여 이용하였다. Prosi prestained protein marker (GenDEPOT, USA)를 사용하여, 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 사용하였으며 시료는 제주산 마(한라마) 사골 추출물을 분말화하여 단백질 함량 정량 후, 2X sample buffer와 1:1로 혼합한 후 100℃에서 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치 (PageRun, AE-6531, ATTO, Japan)를 이용하여 100 V로 전기 영동 하였으며, 0.
- 단백질 농도는 Kim 등[12]이 제시한 대로 bovine serum albumin (BSA)를 표준용액으로 사용하였고, bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 kit (Sigma Chemical Co., USA)를 이용하여 측정하였다.
- 말뼈는 제주 재래마와 더러브렛(Thoroughbred)종 사이의 교잡종인 제주산 마(한라마)의 뒷 다리뼈를 (주)청정해에서 구입하여 이용하였다. 1,1-diphenyl-2picryl-hydrazyl(DPPH),2,2-azino-bis(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium persulfate, 2,4,6- tris(2- pyridyl)-s-triazine (TPTZ), iron (III) chloride hexahydrate, fluorescein sodium salt, 2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), 6- hydroxy- 2,5,7,8- tetramethylchromane- 2-carboxylic acid (trolox)는 Sigma Chemical Co.
- 본 실험에서 사용된 제주산 마(한라마) 사골 추출과정은 Fig. 1에 나타내었다. 말 사골의 핏물을 제거하기 위해 4℃ 물에서 12시간 침수시켜 핏물을 제거하였다.
- (USA) 제품을 구입 하여 사용하였다. 사용 효소인 Multifect PR 6L, pepsin, pancreatin은 ㈜ 비전바이오캠(Sungnam, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- 제주산 마(한라마) 사골 추출물을 식품효소인 multifect, pepsin, pepsin과 pancreatin (1:1) 혼합물을 이용하여 분해한 분해물인 MP, PS, PSPC의 SDS-PAGE profile을 Fig. 2에 나타내었다. 효소분해전의 사골 추출물 자체와 3 kDa 이상의 크기의 효소분해물의 SDS-PAGE profile에서 보여주는 바와 같이 효소분해 전 사골 추출물은 정확한 크기의 단백질 밴드가 나타나지는 않았으나 34 kDa 이상의 거대 단백질로 이루어져 있음을 알 수 있다.
데이터처리
- 본 실험의 모든 결과는 SAS 프로그램(ver. 9.2 Statistics Analytical System)의 General Linear Model을 이용하여 분산 분석하였다. 처리군의 평균값 간의 비교를 위해 Duncan’s multiple range test를 이용하여 5% 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
- 처리군의 평균값 간의 비교를 위해 Duncan’s multiple range test를 이용하여 5% 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- FRAP 활성은 시료 중의 항산화 물질에 의해 Fe(Ⅲ)-TPTZ가 Fe(Ⅱ)-TPTZ 혼합물로 환원되는 원리에 의한 Benzie와 Strain [4]의 방법으로 측정하였다. 반응용액은 300 mM acetate buffer (pH 3.
- ORAC 분석은 hydroxyl기나 peroxyl기와 같이 짧은 시간동안 존재하는 라디칼에 대한 항산화 반응을 검정할 수 있는 방법이다[10]. ORAC은 Gillespie 등[7]의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. Black 96 well plate에 25 μl 표준시약(trolox) 또는 시료를 넣고, 150 μl fluorescein (80 nM)을 넣어 혼합한 뒤 37℃ incubate에서 15분 동안 방치하였다.
성능/효과
- 5에 나타내었다. DPPH 소거능과 매우 유사한 결과를 나타내었으며 pepsin을 이용하여 분리한 3 kDa 이하의 분획에서 유의적으로 높은 항산화 활성을 나타내었다. 반면에 3 kDa 이상의 분획에서는 효소분해전의 사골 추출물보다도 낮은 FRAP값을 나타내었다(p<0.
- 그러나 사골 추출물을 multifect PR 6L, pepsin, pepsin과 pancreatin 혼합효소(1:1)를 이용 하여 분해한 후 분리한 3 kDa이하의 펩타이드는 0.14 mM trolox equivalent에 해당하는 효과를 나타내어 분자 크기가 3 kDa 이상 되는 분획보다 강한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다(p<0.05).
- 53 uM trolox equivalent을 보였음을 확인하였다[12]. 반면에 본 연구결과 제주산 마(한라마) 사골 효소분해물을 1 mg/ml의 농도로 처리시 MP 처리군에서 0.20 mM trolox와 같은 항산화 효과를 보여 돼지껍질과 당나귀 사골 추출물보다 말 사골 추출물의 ORAC 활성이 우수한 것으로 판단된다.
- 제주산 마(한라마) 사골 추출물과 분자크기에 따른 효소 분해물의 단백질함량은 Table 2에 나타내었다. 사골 추출물의 단백질 함량은 0.6 mg/ml로 가장 높았으며 모든 효소 처리군에서 3 kDa 이상의 분획이 3 kDa 이하의 저분자 분획보다는 유의적으로 높은 단백질 함량을 나타내었다. 특히 PSPC 처리군의 3kDa 이하의 분획은 0.
- 81%을 나타내었다. 저분자인 3 kDa 이하의 분획에서는 각 효소분해에 의한 수율이 각각 3.26과 8.00%으로 나타나 크게 감소함을 보였다. 반면에 MP 처리군에서는 저분자 분획의 수율이 가장 높음을 나타내었다.
- 제주산 마(한라마) 사골 추출물을 효소분해하여 3 kDa 보다 큰 분획과 작은 분획을 회수하였으며 각각의 수율을 Table 1에 나타내었다. 제주산 마(한라마) 사골 추출물 분말의 수율을 100으로 하였을 때 효소분해 후 3 kDa 이상의 크기의 분획 수율은 PS와 PSPC 처리군에서 각각 89.63과 80.87%을 보였으나 MP 처리군에서는 70.81%을 나타내었다. 저분자인 3 kDa 이하의 분획에서는 각 효소분해에 의한 수율이 각각 3.
- 제주산 마(한라마) 사골추출물 자체는 PS 처리군의 3 kDa 이상의 분획과 함께 가장 낮은 DPPH 소거능을 보였다(p<0.05).
- 각 효소분해물은 분자량이 작을수록 더 강한 ORAC값을 나타내었다. 특히 3 kDa 이하의 크기의 분획이 분해 전 제주산 마(한라마) 사골 추출물보다 유의적으로 높은 ORAC효과를 보였으나 pepsin 분해물(0.12 mM trolox equivalent)은 저분자 크기에서도 MP (0.20 mM trolox equivalent)와 PSPC (0.17 mM trolox equivalent)처리군 보다 유의적으로 가장 낮은 활성을 나타내었다. Kim 등[13]은 돼지껍질 추출물을 flavorzyme으로 분해하여 얻는 3 kDa 이하의 분획물의 ORAC 활성을 측정한 결과 1 mg/ml의 농도에서 140 uM trolox equivalent의 활성을 나타내었음을 보였다.
- 효소분해 하지 않은 말 사골 추출물은 0.30 mM trolox에 해당하는 ABTS 라디칼 소거능을 보였으나 MP와 PSPC처리군의 저분자 분획에서 유의적으로 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다(p<0.05).
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