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문제 정의
- 그러나 소 정액의 동결 시 항산화제의 첨가(Foote 등, 2002), 동결속도 및 삼투압의 변화(Woelders 등, 1997) 및 동해 보호제의 첨가(De Leeuw 등, 1993)와 같은 방법을 이용하여 동결의 효율을 높이는 연구가 진행되어지고 있지만, 정액 채취 후 운송하는 방법 및 냉각하는 시스템에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구는 한우 정액의 동결 및 융해 후 수정능력 향상을 위해 신선 정액의 운반법 개선에 관하여 새로운 방향을 제시하고자 수행되 었다.
- 그러나 정액 냉각용기에 대한 개선, 장거리를 이동할 때의 운송방법에 대한 연구는 저조한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 정액의 온도가 하강할 때 발생하는 충격을 최소화하는 방식을 개선하고자 하였다. 일반적으로 37℃의 물 500 ml는 0.
- 또한, 희석하지 않은 원정액 상태로 본 연구방법을 이용하여 운송하게 되면 모두 사멸하는 것을 실험을 통해 확인하였다. 이와 같이 소 정액은 온도에 매우 민감하기 때문에 적절한 운송방식 및 냉각용기가 필요하다고 판단되며, 소 정액의 채취 후 운반하는 방법을 연구를 통하여 개선하였다.
제안 방법
- 미토콘드리아 기능검사는 정자의 에너지 생산에 관련된 항목이기 때문에, 운동성이 있는 정자에 있어 매우 중요한 지표로 작용하게 된다. Fig. 4는 운반 방식에 따른 동결-융해된 한우 정액의 첨체 손상율에 대한 결과로써, 첨체 손상율 평가와 마찬가지로 PI가 염색된 기준으로 살아있는(Live, PI-) 정자(Fig. 4A)와 전체적인(All, PI+/PI-) 정자(Fig. 4B)의 부분을 나누어 미토콘드리아 온전성을 평가하였다. 그 결과, 동결-융해 후 살아있는 정자 중 미토콘드리가 온전한 정자의 비율은 Fig.
- 각각의 시약으로 염색된 정자는 flow cytometry(FACS caliber, Becton Dickinson, USA)에서 형광의 발현차를 이용하여 총 10,000개의 정자를 분석하였다. 분석된 정자는 CELLQuest version 6.
- 정자의 미토콘드리아를 검증하는 방법에는 미토콘드리아 내막 보존능력 및 미토콘드리아에서 생성되는 ATP의 양을 측정하는 방법 등이 이용되고 있다(Silva와 Gadella, 2006). 본 연구에서는 Rhodamine123을 이용하여 미토콘드리아 내막의 온전 성을 flow cytometry 분석을 통해 분석하였다. 그 결과, 미토콘드리아 온전성 역시 Air 처리구가 다른 처리구에 비하여 유의적으로 높게 나타났고, 살아있는 정자 및 모든 정자에서도 같은 경향이 나타났다.
- 각각의 시약으로 염색된 정자는 flow cytometry(FACS caliber, Becton Dickinson, USA)에서 형광의 발현차를 이용하여 총 10,000개의 정자를 분석하였다. 분석된 정자는 CELLQuest version 6.0(Becton Dickinson, USA)을 이용하여 Fig. 1과 같이 정자의 생존율, 첨체 손상율 및 미토콘드리아 보존율을 분석하였다.
- 3℃의 환경에서 2시간 동안에 4℃로 떨어지게 된다. 이러한 방식을 이용하여 37℃의 희석액으로 희석된 정액을 물 500 ml 내에 침지하여 온도를 하강시키는 방식을 이용하였다. 또한, 물과 희석된 정액튜브 사이에 발생하는 직접적인 온도 충격을 감소시키기 위하여 튜브를 이용하여 정액과 물 사이에 공기층을 만들어 실험에 이용하였으며, 이러한 방식으로 운반된 정액은 동결-융해 후 생존율, 첨체 손상율 및 미토콘드리아 보존율이 유의적(p<0.
- 3에 나타내었다. 첨체 손상율을 평가하기 위하여 Flow cytometry로 분석된 부분 중 PI가 염색된 부분을 기준으로 살아있는(Live, PI-) 정자 (Fig. 3A)와 전체적인(All, PI+/PI-) 정자(Fig. 3B)의 부분을 나누어 비율로 계산하였다. 실제로 수정에 관여하는 정자는 살아있는 정자(Live)이기 때문에 다음과 같은 실험을 실시하였으며, 그 결과 살아있는 정자 중 첨체 손상이 일어난 정자는 Fig.
- 채취된 정액은 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl에 1:1로 희석되었다. 희석된 정액의 운반법에 따른 효능을 비교하기 위하여 정액 튜브는 휴지로 감싸기(Tissue), 30℃로 가온된 물에 침지(Water) 및 가온된 물과 희석된 정액 튜브 사이에 공기층을 생성(Air)하는 방식을 이용하여 채취된 장소로부터 2시간 동안 0.3℃ 환경 하에서 실험실로 운반되었다. 실험에 이용된 한우 정액은 총 16두에서 채취하여 이용하였으며, 총 20회의 반복실험을 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 소 정액은 국립축산과학원 대관령 한우시험장에서 사육되고 있는 20두의 종모우의 정액을 인공질법을 이용하여 채취하였다. 채취된 정액은 37℃에서 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl(Triladyl®, Minitube, tiefen- bach, Germany)에 희석하였다.
- 3℃ 환경 하에서 실험실로 운반되었다. 실험에 이용된 한우 정액은 총 16두에서 채취하여 이용하였으며, 총 20회의 반복실험을 실시하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과는 SAS 9.3을 이용하여 General linear mode(GLM)을 적용하여 Duncan 다중검정에 의하여 p<0.05 수준에서 유의차를 검정하였다.
이론/모형
- 미토콘드리아 온정성 검사는 Rhodamine123(Sigma, Saint Louis, USA)과 PI 이중염색 방법을 이용하여 실시하였으며, 미토콘드리아 내막의 활성 정도를 판단하여 미토콘드리아 온전성을 검사하였다(Fraser 등, 2002). 정액은 1×106개/ml 농도에 Rhodamine123 시약의 최종농도를 2.
- 생존율 검사는 SYBR14(Live/Dead sperm viability kit, Molecular probes, USA)와 propidium idodide(PI, Sig- ma, Spruce, USA) 이중염색 방법을 이용하여 실시하였으며, 정자 두부의 원형질막 손상 유무를 판단하여 생존율을 판단하였다(Silva와 Gadella, 2006). 정액은 1×106개/ml농도에 SYBR-14 시약의 최종농도를 2.
- 첨체막 손상 검사는 peanut agglutinin conjugated with phycoerythrin(PNA-FITC, Sigma, Saint Louis, USA)와 PI 이중염색 방법을 이용하여 실시하였으며, 첨체 내막의 손상 유무를 판단하여 첨체 손상율을 측정하였다(Papaioannou 등, 1997). 정액은 1×106개/ml 농도에 PNAFITC 시약의 최종농도를 2.
성능/효과
- 그 결과, 동결-융해 후 살아있는 정자 중 미토콘드리가 온전한 정자의 비율은 Fig. 4A에서 보는 바와 같이 15% 이하였으며, Air 처리구(97.1±0.4%)가 다른 처리구(Tissue: 85.2±3.3% 및 Water: 87.8±2.9%)에 비하여 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
- 본 연구에서는 Rhodamine123을 이용하여 미토콘드리아 내막의 온전 성을 flow cytometry 분석을 통해 분석하였다. 그 결과, 미토콘드리아 온전성 역시 Air 처리구가 다른 처리구에 비하여 유의적으로 높게 나타났고, 살아있는 정자 및 모든 정자에서도 같은 경향이 나타났다.
- 또한, Fig. 4B에서 보는 바와같이 전체 정자 중 미토콘드리아 온전성이 Air 처리구(61.9±3.3%)에서 유의적으로 증가한 것을 관찰하였다(p<0.05).
- 또한, 물과 희석된 정액튜브 사이에 발생하는 직접적인 온도 충격을 감소시키기 위하여 튜브를 이용하여 정액과 물 사이에 공기층을 만들어 실험에 이용하였으며, 이러한 방식으로 운반된 정액은 동결-융해 후 생존율, 첨체 손상율 및 미토콘드리아 보존율이 유의적(p<0.05)으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2～4).
- 이러한 결과는 수정에 직접적으로 관련이 있는 살아있는 정자가 첨체 손상율이 낮아진 결과이며, 동결-융해 된 소 정액의 수정능력을 향상시킬 수 있을 것이라 판단된다. 또한, 생존 유무에 관계 없이 Air 처리구의 첨체 손상율이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 16마리의 개체 중 3마리의 개체(개체번호 247, 257 및 303번)에서 본 연구방법을 이용하였을 경우 다른 경향을 보였으며, 이러한 결과는 개체마다 동결-융해 후 첨체 손상에 대한 개체 차이가 존재하는 것으로 판단된다.
- 또한, 전체 정자를 분석한 경우에도 Fig. 3B에서 보는 바와 같이 Air 처리구(28.6±2.8%)가 다른 처리구(Tissue: 44.2±1.8% 및 Water: 36.2±2.0%)에 비하여 첨체 손상율이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(p<0.05).
- 또한, 죽어가는 정자(Dying, SYBR+/PI+)의 정자 비율은 Fig. 2B에서 보는 바와 같이 Tissue(77.6±3.2%)와 Water(67.6±3.3%) 처리구 간에 유의적인 차이는 나타나지 않았지만, Air 처리구(55.6±4.7%)에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- 실제로 희석 후 37℃의 환경에 장시간 노출되면 DNA frag- ment가 증가하고, caspase-9 단백질이 증가한다는 보고가 있다(Hendricks와 Hansen, 2009). 또한, 희석하지 않은 원정액 상태로 본 연구방법을 이용하여 운송하게 되면 모두 사멸하는 것을 실험을 통해 확인하였다. 이와 같이 소 정액은 온도에 매우 민감하기 때문에 적절한 운송방식 및 냉각용기가 필요하다고 판단되며, 소 정액의 채취 후 운반하는 방법을 연구를 통하여 개선하였다.
- 하지만 동결액 자체에 물질들을 첨가하여 동결의 효율성을 높이는 연구가 진행되어 왔지만, 냉각하는 시스템에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구의 결과, 신선 및 동결-융해 후 PI를 기준으로 나누어 살아있는 정자에서의 첨체 손상율을 분석한 결과, 모두 1% 이하로 나타났으며, 처리구의 첨체 손상율이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 수정에 직접적으로 관련이 있는 살아있는 정자가 첨체 손상율이 낮아진 결과이며, 동결-융해 된 소 정액의 수정능력을 향상시킬 수 있을 것이라 판단된다.
- 실제로 수정에 관여하는 정자는 살아있는 정자(Live)이기 때문에 다음과 같은 실험을 실시하였으며, 그 결과 살아있는 정자 중 첨체 손상이 일어난 정자는 Fig. 3A에서 보는 바와 같이 1% 이하였으며, 이 중 Air 처리구(0.2±0.1%)가 다른 처리구(Tissue: 0.7±0.2% 및 Water: 0.5±0.1%)에 비하여 첨체 손상율이 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- 이러한 결과를 종합하면 소 정액을 채취한 후 동결보존 하기 위하여 운송하는데 있어 가온된 물에 직접적으로 침지시켜 온도를 냉각시키는 방법보다는 물과 희석된 정액 튜브 사이에 공기층을 두어 정액을 냉각시켜 동결- 융해하였을 때 정자의 생존율, 첨체 손상율 및 미토콘드리아 온전성에 있어 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 현장에서 정액 채취 후 바로 본 연구 방법의 이용이 가능하며, cold shock 및 직접적인 온도 충격을 최소화하여 정액 운반 시 발생하는 온동충격을 최소화 할 수 있을 것이다.
- 05). 종합적인 결과를 보았을 때 운송방식에 있어 정액의 운반 시 공기층을 생성하여 운반하는 방식이 정자의 생존율에 효과적인 영향을 미쳤다.
후속연구
- 이러한 결과를 종합하면 소 정액을 채취한 후 동결보존 하기 위하여 운송하는데 있어 가온된 물에 직접적으로 침지시켜 온도를 냉각시키는 방법보다는 물과 희석된 정액 튜브 사이에 공기층을 두어 정액을 냉각시켜 동결- 융해하였을 때 정자의 생존율, 첨체 손상율 및 미토콘드리아 온전성에 있어 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 현장에서 정액 채취 후 바로 본 연구 방법의 이용이 가능하며, cold shock 및 직접적인 온도 충격을 최소화하여 정액 운반 시 발생하는 온동충격을 최소화 할 수 있을 것이다.
- 본 연구의 결과, 신선 및 동결-융해 후 PI를 기준으로 나누어 살아있는 정자에서의 첨체 손상율을 분석한 결과, 모두 1% 이하로 나타났으며, 처리구의 첨체 손상율이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 수정에 직접적으로 관련이 있는 살아있는 정자가 첨체 손상율이 낮아진 결과이며, 동결-융해 된 소 정액의 수정능력을 향상시킬 수 있을 것이라 판단된다. 또한, 생존 유무에 관계 없이 Air 처리구의 첨체 손상율이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
- 2～4). 이러한 기술은 모든 농가가 동결 정액으로 인공수정을 하는 국내의 현황으로 비추어 볼 때 정액을 채취하여 동결 정액을 제조하는 기관 또는 업체에 도움이 될 것으로 기대된다.
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