꾸지뽕나무는 한국과 중국에서 전통 한방약재로 오랫동안 사용되어 왔다. 본 논문은 꾸지뽕나무의 잎,줄기, 뿌리부분의 에탄올 추출물의 물, 에탄올, 에칠아세테이트 용해성 분획물에 대한 생리활성에 관한 실험결과이다. 이들 분획물들의 다양한 세포들의 성장에 대한 영향을 검토한 결과, 잎, 줄기, 뿌리의 에칠아세테이트 분획물이 macrophage(RAW 264.7 cell), melanoma cell(B16-F10 cell), fibroblast cell(CCD-986sk cell), lung carcinoma cell(A549 cell) 들의 성장을 현저하게 억제시키는 세포독성을 나타내었다. 자유라디칼 DPPH (di(phenyl)- (2,4,6-trinitrophenyl) iminoazanium)를 소거할 수 있는 분획물의 농도를 비교한 결과, 잎과 뿌리의 물분획물 그리고 뿌리의 에탄올분획물이 다른 분획물들에 비해 라디칼을 소거하는 항산화효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
꾸지뽕나무는 한국과 중국에서 전통 한방약재로 오랫동안 사용되어 왔다. 본 논문은 꾸지뽕나무의 잎,줄기, 뿌리부분의 에탄올 추출물의 물, 에탄올, 에칠아세테이트 용해성 분획물에 대한 생리활성에 관한 실험결과이다. 이들 분획물들의 다양한 세포들의 성장에 대한 영향을 검토한 결과, 잎, 줄기, 뿌리의 에칠아세테이트 분획물이 macrophage(RAW 264.7 cell), melanoma cell(B16-F10 cell), fibroblast cell(CCD-986sk cell), lung carcinoma cell(A549 cell) 들의 성장을 현저하게 억제시키는 세포독성을 나타내었다. 자유라디칼 DPPH (di(phenyl)- (2,4,6-trinitrophenyl) iminoazanium)를 소거할 수 있는 분획물의 농도를 비교한 결과, 잎과 뿌리의 물분획물 그리고 뿌리의 에탄올분획물이 다른 분획물들에 비해 라디칼을 소거하는 항산화효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
Cudrania tricuspidata has been used for a long time as a traditional herb medicine in Korea nad China. This paper has shown the experimental results about the physiological activities of water-, ethanol-, ethyl acetate-soluble fractions from ethanolic extracts of leaves, stems and roots of Cudrania ...
Cudrania tricuspidata has been used for a long time as a traditional herb medicine in Korea nad China. This paper has shown the experimental results about the physiological activities of water-, ethanol-, ethyl acetate-soluble fractions from ethanolic extracts of leaves, stems and roots of Cudrania tricuspidata. The effects of these fractions on the growth of various cells have exhibited that the ethyl acetate fractions from leaves, stems and roots inhibited significantly the growths of macrophage(RAW 264.7 cell), melanoma cell(B16-F10 cell), fibroblast cell(CCD-986sk cell), and lung carcinoma cell(A549 cell). The water and ethanol fractions of leaves and ethanol fraction of stems demonstrated better antioxidant activities scavenging radicals than other fractions when compared with the concentrations of different fractions for scavenging free radical DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl) iminoazanium).
Cudrania tricuspidata has been used for a long time as a traditional herb medicine in Korea nad China. This paper has shown the experimental results about the physiological activities of water-, ethanol-, ethyl acetate-soluble fractions from ethanolic extracts of leaves, stems and roots of Cudrania tricuspidata. The effects of these fractions on the growth of various cells have exhibited that the ethyl acetate fractions from leaves, stems and roots inhibited significantly the growths of macrophage(RAW 264.7 cell), melanoma cell(B16-F10 cell), fibroblast cell(CCD-986sk cell), and lung carcinoma cell(A549 cell). The water and ethanol fractions of leaves and ethanol fraction of stems demonstrated better antioxidant activities scavenging radicals than other fractions when compared with the concentrations of different fractions for scavenging free radical DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl) iminoazanium).
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문제 정의
동의보감 과 중약대사전에 기재된 많은 천연약재들이 나타내는 효능과 작용기전을 확인하기 위해 많은 연구가 수행되어 온 것처럼 꾸지뽕나무에 대해서도 항균, 항산화, 항염, 항당뇨, 항고지혈증, 항고혈압, 항바이러스, 항세포독성, 항비만 등의 연구를 통해 꾸지뽕나무의 효능을 확인하기 위한 노력들이 진행되고 있다[7-12]. 본 연구에서는 꾸지뽕나무의 잎, 줄기, 뿌리 부위별로 추출물 및 분획물에 대하여 다양한 세포독성과 항산화 실험을 통해 꾸지뽕나무의 생리활성효과를 확인하고 활용분야 확대를 검토하는 데 도움이 되고자 한다.
제안 방법
Raw 264.7 세포 내에서 reactive oxygen species (ROS)를 측정하기 위하여 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)를 이용하였다.
꾸지뽕나무 각 부위별 에탄올 엑스에 5배 부피의 초산에칠을 가한 후 상온에서 3시간 환류 추출한 후 여과하여 얻은 초산에칠 가용분획을 40 ~ 50℃에서 감압농축하여 각각의 초산에칠 분획물(EA fr.)을 26 g, 3 g, 49 g을 얻었다. 초산에칠에 녹지않는 각각의 잔사에 5배 부피의 에탄올을 가한 후 상온에서 3시간 환류추출한 후 여과하여 얻은 에탄올 가용분획을 40 ~ 50℃에서 감압농축하여 각각의 에탄올 분획물(EtOH fr.
꾸지뽕나무의 잎, 줄기 및 뿌리 각 500 g씩 취하여 5배 부피의 에탄올을 가하고 80℃에서 3시간동안 환류추출한 후 여과지로 여과하였다. 여과액을 40 ~ 50℃에서 감압농축하여 에탄올 엑스를 각각 94 g, 53 g, 131 g을 얻었다.
꾸지뽕나무의 잎, 줄기, 뿌리의 물, 에탄올, 초산에칠 분획물 각각의 100 mg을 DMSO 10 ml에 녹인 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 생리활성 평가시료로 사용하였다.
3과 같은 결과를 나타내었다. 대조군의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, 각각의 추출물은 10-100 ug/ml의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내었는데, 잎, 줄기, 뿌리의 에틸아세테이트 추출물만 100 ug/ml의 농도에서 세포독성이 나타나서 10과 50 ug/ml의 농도로 처리하였다.
4와 같은 결과를 나타내었다. 대조군의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, 각각의 추출물은 10-100 ug/ml의 농도에서 84% 이상의 세포 생존율을 나타내었는데, 줄기의 에틸아세테이트 추출물만 100 ug/ml의 농도에서 세포독성이 나타나서 10과 50 ug/ml의 농도로 처리하였다.
2와 같은 결과를 나타내었다. 대조군의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, 각각의 추출물은 10-100 ug/ml의 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었는데, 잎의 에틸아세테이트 추출물만 100 ug/ml의 농도에서 세포독성이 나타나서 10과 50 ug/ml의 농도로 처리하였다.
7 cells은 96 well plates에 104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, 각각의 추출물을 각각 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10 ul의 WST solution을 첨가한 후 CO2 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 30분 반응 시킨 후, 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
)을 21 g, 18 g, 29 g을 얻었다. 에탄올에 녹지 않는 각각의 잔사에 5배 부피의 증류수를 가하고 상온에서 환류 추출한 후 여과하여 얻은 증류수 가용분획을 40 ~ 50℃에서 감압농축하여 각각의 물 분획물(DW fr.)을 47 g, 32 g, 53 g을 얻었다.
원심분리 후 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 DCF-DA 10 μM이 되도록 첨가하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 염색하였다. 염색 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하고 다시 PBS 400 ㎕를 부유시켜 유세포 분석기 (Flow cytometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ USA)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl) iminoazanium)를 사용하는 방법으로 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 ul와 각각의 추출물 (25, 50, 100, 200 ug/ml) 100 ul 를 각각 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료액 대신 증류수를 넣었으며, DPPH 용액대신 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다.
첫째, 꾸지뽕나무의 잎, 줄기 및 뿌리 각 부위별 에탄올 엑스를 에칠아세테이트, 에탄올, 증류수를 이용하여 용매분획을 수행하여 꾸지뽕의 각부위별 에칠아세테이트, 에탄올, 물분획물을 제조하였다.
본 실험에 사용된 기기는 ELISA reader (Molecular Devices, U.S.A)와 Flow cytometry system(BD Biosciences immunocytometry systems, U.S.A.) 등을 이용하였다.
본 연구에서 사용된 꾸지뽕나무는 고성군 농업기술센터에서 공급받아 줄기, 잎, 뿌리의 부위별로 나누어 분쇄기로 분쇄하여 사용하였다.
데이터처리
세포독성, DPPH 소거능 측정, 세포내 ROS생성 실험 등 모든 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계처리 하였으며 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
Cells were treated with 10-100 ug/ml of each extract for 24 hr. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±SD from three independent experiments.
성능/효과
일반적으로 폴리페놀은 ROS에 전자를 공여함으로써 ROS의 반응성을 감소시켜 ROS에 의한 세포의 산화적 손상을 방지한다[18,19]. ROS의 일종인 DPPH에 전자를 공여하여 non-radical DPPH로 변환시키는 항산화능력은 잎과 줄기부위 추출물이 뿌리부분 추출물보다 높은 것으로 나타났다. 이는 당연히 부위별로 함유된 성분 또는 부위별로 추출된 성분들의 종류 및 양의 차이로 기인한 것으로 판단된다.
여섯째, 항산화 효과의 자유라디칼 DPPH 소거능을 측정한 결과, 잎의 물분획물 200 ug/ml, 뿌리의 물분획물 200 ug/ml에서 40%이상의 소거효과와 뿌리의 에탄올분획물 200 ug/ml 처리에서 50%이상의 소거효과를 나타내었다. 그리고 RAW 264.7 세포주에서의 ROS생성 억제 효과는 분획물들 모두 전체적으로 효과를 나타내지 않았다.
넷째, human skin fibroblast cell인 CCD-986sk cell 에 대한 세포 독성은 각 부위별/용매별 세포생존율이 줄기의 에틸아세테이트 분획물은 50 ug/ml의 농도 이하에서 그리고 나머지는 100 ug/ml 이하에서 세포독성을 나타내지 않았다.
다섯째, human lung carcinoma cell인 A549 cell의 생장 억제 효과를 측정한 결과, 잎의 에틸아세테이트분획물의 모든 농도에서 유의성 있는(***P<0.001) 억제효과를 나타내었고, 줄기의 물분획물 모두와 줄기의 에틸아세테이트분획물에서 유의성 있는(**P<0.01) 억제효과를 나타내었다.
대식세포내에서의 ROS생성에 대한 꾸지뽕나무추출물의 억제효과는 미미한 것으로 나타났다. ROS자체에 대해서는 어느 정도의 항산화효과가 있으나 대식세포의 대사과정에서 항산화성분의 기능이 발현되지 못한 것으로 판단된다.
잎, 줄기, 뿌리의 물, 에탄올, 에틸아세테이트 추출물 25-200 ug/ml의 농도에서 DPPH 소거능에 미치는 영향을 측정한 결과, Table 2와 같은 결과를 나타내었다. 대조군을 0으로 보았을 때, 잎의 물 추출물은 25-200 ug/ml의 농도에서 11%, 15%, 23%, 43%, 에탄올 추출물은 5%, 12%, 20%, 24%, 에틸아세테이트는 10%, 17%, 29%, 37%의 소거능을 보였다. 줄기의 물 추출물은 25-200 ug/ml의 농도에서 1%, 6%, 10%, 15%, 에탄올 추출물은 8%, 13%, 23%, 29%, 에틸아세테이트 추출물은 1%, 3%, 6%, 10%의 소거능을 보였다.
7 세포주에서 잎, 줄기, 뿌리의 물, 에탄올, 에틸아세테이트 추출물이 ROS 생성 억제에 미치는 영향을 측정한 결과, Table 3과 같은 결과를 나타내었다. 대조군을 100으로 보았을 때, 정상군에 비해 3.4배 증가하였고, 잎과 줄기의 물 추출물과 뿌리의 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물은 효과가 거의 없었으나, 잎의 에탄올 추출물은 10과 100 ug/ml의 농도에서 10%와 17%, 에틸아세테이트 추출물 10과 50 ug/ml의 농도에서 각각 7%와 17%, 줄기의 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물 100 ug/ml의 농도에서는 14%와 25%, 뿌리 물 추출물 10 ug/ml의 농도에서는 10%의 생성 억제능을 보였다.
Human lung carcinoma cell인 A549 cells에서 잎, 줄기, 뿌리의 물, 에탄올, 에틸아세테이트 추출물이 암세포에 미치는 영향을 측정한 결과 Table 1과 같은 결과를 나타내었다. 대조군의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, 잎의 물과 에탄올 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 85% 이상의 세포 생존율을 나타내었으나, 에틸아세테이트 추출물만 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 25%, 54%, 76%의 세포독성을 나타냈다. 줄기의 에탄올 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았으나, 물과 에틸아세테이트 추출물은 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 각각 25%, 54%, 76%와 0%, 45%, 89%의 세포독성을 나타냈다.
둘째, murine macrophage인 RAW 264.7 cell 에 대한 세포 독성은 각 부위별/용매별 세포생존율이 잎의 에틸아세테이트 분획물은 50 ug/ml의 농도 이하에서 그리고 나머지는 100 ug/ml 이하에서 세포독성을 나타내지 않았다.
줄기의 물 추출물은 25-200 ug/ml의 농도에서 1%, 6%, 10%, 15%, 에탄올 추출물은 8%, 13%, 23%, 29%, 에틸아세테이트 추출물은 1%, 3%, 6%, 10%의 소거능을 보였다. 또한, 뿌리의 물 추출물은 10%, 13%, 19%, 41%, 에탄올 추출물은 17%, 22%, 25%, 54%, 에틸아세테이트 추출물은 10%, 11%, 12%, 28%의 소거능을 보였다.
줄기의 에탄올 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았으나, 물과 에틸아세테이트 추출물은 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 각각 25%, 54%, 76%와 0%, 45%, 89%의 세포독성을 나타냈다. 뿌리 물 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았으나, 에탄올과 에틸아세테이트 추출물은 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 각각 17%, 17%, 20%와 10%, 15%, 33%의 세포독성을 나타냈다.
셋째, murine melanoma cell인 B16-F10 cell 에 대한 세포 독성은 각 부위별/용매별 세포생존율이 잎, 줄기, 뿌리의 에틸아세테이트 분획물물은 50 ug/ml의 농도 이하에서 그리고 나머지는 100 ug/ml 이하에서 세포독성을 나타내지 않았다.
여섯째, 항산화 효과의 자유라디칼 DPPH 소거능을 측정한 결과, 잎의 물분획물 200 ug/ml, 뿌리의 물분획물 200 ug/ml에서 40%이상의 소거효과와 뿌리의 에탄올분획물 200 ug/ml 처리에서 50%이상의 소거효과를 나타내었다. 그리고 RAW 264.
위 실험결과를 통해 꾸지뽕나무의 잎, 줄기, 뿌리의 에틸아세테이트추출물이 macrophage, melanoma cell, skin fibroblast cell, lung carcinoma cell 등의 성장을 현저하게 억제하는 세포독성을 나타났으며, 꾸지뽕나무의 잎과 뿌리의 물, 에탄올추출물이 라디칼을 소거하는 항산화효과가 나타났다. 본 연구를 토대로 앞으로 지속적인 연구를 통해 꾸지뽕나무의 식품, 의약, 화장품 등 다양한 분야에의 소재의 응용가능성을 높일 수 있을 것으로 판단된다.
대조군을 0으로 보았을 때, 잎의 물 추출물은 25-200 ug/ml의 농도에서 11%, 15%, 23%, 43%, 에탄올 추출물은 5%, 12%, 20%, 24%, 에틸아세테이트는 10%, 17%, 29%, 37%의 소거능을 보였다. 줄기의 물 추출물은 25-200 ug/ml의 농도에서 1%, 6%, 10%, 15%, 에탄올 추출물은 8%, 13%, 23%, 29%, 에틸아세테이트 추출물은 1%, 3%, 6%, 10%의 소거능을 보였다. 또한, 뿌리의 물 추출물은 10%, 13%, 19%, 41%, 에탄올 추출물은 17%, 22%, 25%, 54%, 에틸아세테이트 추출물은 10%, 11%, 12%, 28%의 소거능을 보였다.
대조군의 세포 생존율을 100%로 하였을 때, 잎의 물과 에탄올 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 85% 이상의 세포 생존율을 나타내었으나, 에틸아세테이트 추출물만 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 25%, 54%, 76%의 세포독성을 나타냈다. 줄기의 에탄올 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았으나, 물과 에틸아세테이트 추출물은 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 각각 25%, 54%, 76%와 0%, 45%, 89%의 세포독성을 나타냈다. 뿌리 물 추출물은 200 ug/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았으나, 에탄올과 에틸아세테이트 추출물은 50, 100, 200 ug/ml의 농도에서 각각 17%, 17%, 20%와 10%, 15%, 33%의 세포독성을 나타냈다.
후속연구
위 실험결과를 통해 꾸지뽕나무의 잎, 줄기, 뿌리의 에틸아세테이트추출물이 macrophage, melanoma cell, skin fibroblast cell, lung carcinoma cell 등의 성장을 현저하게 억제하는 세포독성을 나타났으며, 꾸지뽕나무의 잎과 뿌리의 물, 에탄올추출물이 라디칼을 소거하는 항산화효과가 나타났다. 본 연구를 토대로 앞으로 지속적인 연구를 통해 꾸지뽕나무의 식품, 의약, 화장품 등 다양한 분야에의 소재의 응용가능성을 높일 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
꾸지뽕나무의 열매는 어떤 특징이 있는가?
꽃은 암수딴그루이고 5∼6월에 두상꽃차례를 이루며 핀다. 열매는 껍질이 말라서 단단해지고 그 속에 종자를 가지는 수과이고 열매들이 모여 덩어리를 이루는데 지름이 2∼3cm로 둥근 모양이고 육질이며 9월에 붉은 색으로 익는다. 일반적으로 잎은 뽕잎대용으로 누에사료로 쓰고 열매는 먹을 수 있으며 잼이나 술을 담그고, 줄기와 뿌리는 약용이나 종이원료로 쓰인다[1-3].
중약대사전에서 꾸지뽕나무의 각 부위는 어떤 이름으로 기록되어 있는가?
동의보감에서는 자목(柘木) 또는 산뽕나무라고 하는 약재로서 성질이 따뜻하며 맛이 달고 독이 없으며 풍허로 귀먹은 것과 학질을 낫게 하며 삶은 물은 노랗게 물이 든다고 하였다 [4]. 또한 중약대사전에서는 꾸지뽕나무의 뿌리를 '천파석(穿破石)', 나무껍질과 뿌리껍질 '자목백피(柘木白皮)', 잎을 '자수경엽(柘樹莖葉)', 열매를 '자수과실(柘樹果實)' 이라고 하여 부위별로 다양한 효능의 약재로서 기재되어 있다. 뿌리인 천파석은 풍사를 몰아내고 습을 배출시키며 혈을 잘 순환시키고 월경을 통하게 하는 효능이 있으며.
꾸지뽕나무의 뿌리인 천파석은 어떤 효능이 있는가?
또한 중약대사전에서는 꾸지뽕나무의 뿌리를 '천파석(穿破石)', 나무껍질과 뿌리껍질 '자목백피(柘木白皮)', 잎을 '자수경엽(柘樹莖葉)', 열매를 '자수과실(柘樹果實)' 이라고 하여 부위별로 다양한 효능의 약재로서 기재되어 있다. 뿌리인 천파석은 풍사를 몰아내고 습을 배출시키며 혈을 잘 순환시키고 월경을 통하게 하는 효능이 있으며. 풍습에 의한 관절통, 황달, 임탁(임병), 고창(주로 간장병에 복부가 붓는 증상), 폐경, 노상에 의한 해혈, 타박상, 정창, 부스럼을 치료한다. 나무껍질과 뿌리껍질인 자목백피는 신을 보하고 정을 수렴하며 혈을 서늘하게 하고 근육과 힘줄을 푸는 효능이 있으며 요통, 유정, 객혈, 구혈, 외상성 손상을 치료한다.
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