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문제 정의
- TCME가 안드로젠 의존적인 전립선암세포인 LNCaP과 다른 세포주에서 보이는 암세포 성장 억제효과를 비교하기 위하여 실시하였다. 실험에 사용된 세포주는 유방암세포주인 MCF-7, 안드로젠 비의존적 전립선암세포주인 DU145 및 이 실험에서 사용된 LNCaP 등으로 TCME 0~200 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리하여 MTT assay를 실시하였다.
- 가자의 성분으로는 chebulic acid, chebulagic acid, gallic acid, tannin 등이 있다고 알려져 있으며(8), 항균(9), 항암(10), 항염 및 항산화 활성(11), 항당뇨활성(12)이 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는 가자 메탄올추출물이 HAT 활성을 억제하고 AR의 아세틸화를 감소시킴으로써 전립선암세포의 성장을 저해하는 것을 밝히고, 전립선암 예방 치료의 소재 개발의 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 150 μg의 NE를 상기의 antibody 및 protein A/GPLUS agarose bead와 함께 4℃에서 18시간 반응시킨 후, HAT buffer(50 mM pH8.0 tris, 10% glycerol, 0.1 mMEDTA)로 2회 세척하고 HAT 활성을 측정하였다.
- 48시간 후, 합성 androgen인 R1881을 50 nM을 첨가하고, 다시 6시간 후 가자 메탄올 추출액 TCME 0, 25, 50 100 μg/mL의 농도로 함께 첨가하였다. 16시간 후, 세포를 수집하고 total RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다.
- 48시간 후, 합성 androgen인 R1881을 50 nM을 첨가하고, 다시 6시간 후 가자 메탄올 추출액 TCME 0, 25, 50 100 μg/mL의 농도로 함께 첨가하였다.
- 2 mg/mL의 농도로 처리하여 배양하였다. 48시간이 지난 후, 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, SigmaAldrich Co.)를 배지에 첨가하여 2시간 동안 배양하고 형성된 blue formazan을 DMSO에 녹여 570 nm와 630 nm에서 microplate reader를 사용하여 세포생존률을 측정하였다.
- Androgen첨가에 따른 세포 내 전사반응을 보기 위하여 10% charcoal-stripped FBS를 첨가한 RPMI1640 배지로 교환한 뒤 48시간 동안 배양을 지속한 후, 합성 androgen인 50 nM R1881(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 가자메탄올 추출액 TCME 0, 50, 100 μg/mL와 함께 첨가하였다.
- HeLa 세포로부터 얻은 nuclear extract(NE)로(13) HAT활성을 측정하였다. HAT 활성의 측정 중 HAT activity kit를 이용한 활성의 측정은 Biovision의 protocol을 따랐다.
- LNCaP 세포는 48시간 동안 charcoal stripped배지를 처리한 후 합성 androgen인 R1881을 18시간 동안 처리하였으며, TCME 처리군은 R1881 처리 시, 50 및 100μg/mL의 농도로 TCME를 처리하였다.
- LNCap 세포주를 6 well plate에 500,000 cells/well의 밀도로 분주하고, 16시간이 지난 후 reporter assay를 위하여 transfection을 시행하였다. Transfection을 위하여 6well plate 당 pGL3-PSA 0.
- TCME 처리가 AR 아세틸화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 48시간 동안 charcoal stripped 배지에 배양된 LNCaP 세포에 R1881과 농도별 TCME를 처리하고 18시간동안 다시 배양하고 회수된 세포를 lysis 시켜 사용하였다. Lysate는 특이적인 lysine residue에 아세틸화 된 정도를 측정하기 위하여 anti-acetyl lysine으로 immunoprecipitation을 시행하고, anti-AR로 western blot을 시행하였다. Fig.
- 특이적인 HAT 단백질인 p300과 CBP 단백질 활성 측정을위한 전처리 과정은 다음과 같다. NE는 anti-p300(Upstate Biotechnology)와 anti-CBP(Santa Cruz Biotechnology)polyclonal antibody를 사용하여 immunoprecipitation을 하였다. 150 μg의 NE를 상기의 antibody 및 protein A/GPLUS agarose bead와 함께 4℃에서 18시간 반응시킨 후, HAT buffer(50 mM pH8.
- NE를 HAT buffer와 함께 30℃에서 60분간 1 μL의 4.7 Ci/mmol[3H]acetyl coenzymeA와 함께 반응시키고 SDS/PAGE(15% gel)에서 분리시킨 후 autoradiography로 분석하였다.
- Real time PCR 분석은 SYBR Green PCR Master mixreagent를 이용하여(ABI Prism 7700 sequence detection system, Applied Biosystem, Foster city, CA, USA) 다음과 같은 조건으로 시행하였다. 모든 결과는 GAPDH에 따라 상대적으로 표현하였다.
- TCME 처리가 AR 아세틸화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 48시간 동안 charcoal stripped 배지에 배양된 LNCaP 세포에 R1881과 농도별 TCME를 처리하고 18시간동안 다시 배양하고 회수된 세포를 lysis 시켜 사용하였다. Lysate는 특이적인 lysine residue에 아세틸화 된 정도를 측정하기 위하여 anti-acetyl lysine으로 immunoprecipitation을 시행하고, anti-AR로 western blot을 시행하였다.
- TCME 추출물이 androgen 의존적인 전립선암세포인 LNCaP에서 AR 매개 전사활성조절에 미치는 영향을 증명하기 위하여, ARE(androgen responsive element) 부분을 가지고 있는 androgen dependent reporter construct를 세포에 transfection 시킨 후 luciferase 활성을 측정하였다(Fig. 2A). LNCaP 세포는 48시간 동안 charcoal stripped배지를 처리한 후 합성 androgen인 R1881을 18시간 동안 처리하였으며, TCME 처리군은 R1881 처리 시, 50 및 100μg/mL의 농도로 TCME를 처리하였다.
- Lysate는 1μL의 monoclonal anti-Ac lysine(Santa cruz Biotechnology)에 protein A/G PLUS agarose bead에 4℃에서 overnight 처리하였다. 결과물을 10% SDS gel에 전기영동을 시행하고, AR antibody로 반응하고 enhanced chemiluminescence kit(ECL kit, Pierce Antibodies, Rockford, IL, USA)를 이용하여 확인하였다.
- Louis, MO, USA)을 가자메탄올 추출액 TCME 0, 50, 100 μg/mL와 함께 첨가하였다. 다시 16시간 후, 세포를 수집하여 파쇄하고 dual luciferase assay(Promega Co., Madison, WI, USA)를 시행하였다.
- 다음으로 endogenous AR target gene인 PSA 및 NKX3.1의 mRNA 발현에 미치는 영향을 real time PCR로 확인하였다(Fig. 2B). 역시 상기와 같은 조건에서 실험을 시행한결과, R1881 처리군에서는 PSA 및 NKX3.
- Real time PCR 분석은 SYBR Green PCR Master mixreagent를 이용하여(ABI Prism 7700 sequence detection system, Applied Biosystem, Foster city, CA, USA) 다음과 같은 조건으로 시행하였다. 모든 결과는 GAPDH에 따라 상대적으로 표현하였다. PCR은 94℃에서 2분, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초, 그리고 72℃에서 다시 10분간 27 cycle로 시행되었다.
- 실험에 사용된 세포주는 유방암세포주인 MCF-7, 안드로젠 비의존적 전립선암세포주인 DU145 및 이 실험에서 사용된 LNCaP 등으로 TCME 0~200 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리하여 MTT assay를 실시하였다.
- 본 연구에서는 Terminalia chebula Retz.의 성숙열매인 가자 메탄올 추출물(TCME)을 이용하여 HAT 활성을 억제함으로써 AR의 아세틸화 감소를 유도하여 전립선암세포의 성장을 억제하였다. TCME의 처리는 HAT 활성을 100 μg/mL의 농도에서 50% 이상 저해하였으며, p300과 CBP 등의 특이적 HAT 단백질에서도 유의적인 저해활성을 보였다.
대상 데이터
- LNCaP, DU145는 RPMI1640 배지에서, MCF-7 세포주는 DMEM에서 10% fetal bovine serum(FBS), 1% antibiotics/antimycotics를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건의 습윤한 incubator에서 배양되었다.
- HAT activity colorimetric assay kit는 Biovision(Mountain View, CA,USA)에서 구입하였으며, Easy-spin total RNA extraction kit는 Intron(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Lipofectamine 2000 transfection reagent는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 항체는 Upstate Biotechnology(Charlottesville, VA, USA)와 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 pGL3-PSA construct는 연세대학교 의과대학 김경섭 교수님이 제공하였으며, androgen responsive element(ARE)를 포함하고 있는 androgen dependent reporter construct이며, pGL5SV40은 control vector로 사용되었다.
- PSA는 5'-AGTCTGAGGAGGTGTTCTGGTG-3'과 5'-GAGGTCGTGGCTGGAGTCATCA-3', NKX 3.1은 5'–CTGTCAGCCCCTGAACGG-3' 및 5'–AACCATAT CTTCACTTGGGTCTCC-3'이 사용되었으며, GAPDH는 5'-CGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCC-3'과 5'-CTCCGACGCC TGCTTCACCACCTTCTT–3'이 사용되었다.
- 두 종류의 전립선암세포인 LNCaP과 DU145를 96 well plate에 10,000 cells/well로 분주하고 유방암세포주인 MCF-7은 5,000 cells/well로 분주하여 배양하였다. 배양 24시간 후, PBS로 2회 세척을 하고 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체한 후 TCME를 0~0.
- Lipofectamine 2000 transfection reagent는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 항체는 Upstate Biotechnology(Charlottesville, VA, USA)와 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 pGL3-PSA construct는 연세대학교 의과대학 김경섭 교수님이 제공하였으며, androgen responsive element(ARE)를 포함하고 있는 androgen dependent reporter construct이며, pGL5SV40은 control vector로 사용되었다.
- 본 연구에서 사용한 가자(Terminalia chebula Retz.)의 열매 추출물은 2007년 한국추출물은행(Daejeon, Korea)으로부터 구매하였으며 4°C에 보관하며 시료로 사용하였다.
- )의 열매 추출물은 2007년 한국추출물은행(Daejeon, Korea)으로부터 구매하였으며 4°C에 보관하며 시료로 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지, 혈청, 항생제 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. HAT activity colorimetric assay kit는 Biovision(Mountain View, CA,USA)에서 구입하였으며, Easy-spin total RNA extraction kit는 Intron(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험군간의 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 검정하였다.
- 본 연구에서는 최소 3반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 실험군간의 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 검정하였다.
- 각 실험군간의 통계적 유의성은 Student's t-test를 사용하여 검정하였다. 통계검정은 SigmaStat(version 3.5, Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- HeLa 세포로부터 얻은 nuclear extract(NE)로(13) HAT활성을 측정하였다. HAT 활성의 측정 중 HAT activity kit를 이용한 활성의 측정은 Biovision의 protocol을 따랐다.특이적인 HAT 단백질인 p300과 CBP 단백질 활성 측정을위한 전처리 과정은 다음과 같다.
- 1은 5'–CTGTCAGCCCCTGAACGG-3' 및 5'–AACCATAT CTTCACTTGGGTCTCC-3'이 사용되었으며, GAPDH는 5'-CGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCC-3'과 5'-CTCCGACGCC TGCTTCACCACCTTCTT–3'이 사용되었다. 모든 반응은 삼 반복으로 시행되었으며, relative expression 및 SD value는 comparative method를 사용하여 계산하였다.
성능/효과
- (b) Real time PCRanalysis of PSA and NKX3.1 were performed 16 h after treatments with TCME (0, 25, 50,100 μg/mL), with or without R1881.
- LNCaP의 경우 농도별로 억제효과를 볼 수 있었으며, 100 μg/mL의 농도에서 40% 정도 cell viability가 억제되는 결과를 얻을 수 있었으며, MCF-7과 DU145의 경우 동일 농도 구간에서는 TCME 처리에 따른 차이를 보이지 않았다.
- TCME를 0~100 μg/mL로 안드로젠 수용체 의존적 전립선암세포인 LNCaP에 처리한 결과, reporter assay에서 AR매개 전사를 억제하고 AR target gene의 mRNA 발현을 억제하였다.
- TCME의 처리는 HAT 활성을 100 μg/mL의 농도에서 50% 이상 저해하였으며, p300과 CBP 등의 특이적 HAT 단백질에서도 유의적인 저해활성을 보였다.
- 그 결과 R1881만 처리한 군과 비교할 때, TCME의 각 처리 농도에서 유의적으로 낮은 활성을 보였으며, 특히 100 μg/ mL의 농도에서는 40% 이상의 저해율을 보였다.
- TCME를 0~100 μg/mL로 안드로젠 수용체 의존적 전립선암세포인 LNCaP에 처리한 결과, reporter assay에서 AR매개 전사를 억제하고 AR target gene의 mRNA 발현을 억제하였다. 동일 농도에서 AR의 아세틸화가 감소한 결과를 보였으며, 결국 전립선암세포주의 성장억제를 유도하였다. 이같은 결과에서 가자 메탄올 추출물은 HAT 활성을 억제하며, AR의 아세틸화를 감소시킴으로써 효과적인 전립선암치료소재로 개발될 수 있는 가능성이 있음을 제안한다.
- 역시 상기와 같은 조건에서 실험을 시행한결과, R1881 처리군에서는 PSA 및 NKX3.1 양쪽 모두 높은 mRNA 발현을 보였으며, TCME가 농도의존적으로 발현을 저해했고 100 μg/mL의 처리군에서는 아무것도 처리하지 않은 정상군과 유사한 수준을 보임을 확인할 수 있었다.
- 추출물을 처리하지 않은 정상군과 비교하였을 때, 25 μg/mL부터 100 μg/mL까지 농도의존적으로 저해하였으며, 모든 농도는 정상군에 대하여 유의적으로 저해활성을 보이는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 특이적인 HAT 단백질에 관한 저해효과는 Fig. 1B와 C의 결과에서 볼 수 있듯이, 높은 효과를 보인 50과 100 μg/mL를 대상으로 TCME를 처리하였을 때 CBP와 p300에서 유의적인 저해효과를 보였다.
후속연구
- p300, p/CAF, TIP60 등의 HAT 단백질은 AR을 직접적으로 아세틸화하고, 이는 coactivator binding을 강화하여(7), 결국 AR을 핵으로 translocation 함으로써 전립선암세포의 성장을 촉진시킨다고(4) 보고되었다. 그러므로 HAT 활성의 억제를 이용한 AR 아세틸화 조절은 새로운 전립선암 치료제 개발에서 중요한 기작이 될 수 있으며, 이러한 활성을 지닌 천연물의 발굴이 기존의 호르몬 치료와 병행할 수 있는 보완적인 치료제 개발의 기반이 될 수 있다.
- 동일 농도에서 AR의 아세틸화가 감소한 결과를 보였으며, 결국 전립선암세포주의 성장억제를 유도하였다. 이같은 결과에서 가자 메탄올 추출물은 HAT 활성을 억제하며, AR의 아세틸화를 감소시킴으로써 효과적인 전립선암치료소재로 개발될 수 있는 가능성이 있음을 제안한다.
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