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문제 정의
- 5는 SMO에 직접적으로 작용하는 Hh signaling의 저분자 agonist로서, Hh 재조합 단백질보다 활성이 높은 것으로 알려져 있다(FrankKamenetsky 등, 2002). 따라서 본 연구에서는 돼지 체외 성숙(in vitro maturation, IVM) 및 체외 배양(in vitro culture, IVC) 배양액에 Hh-Ag1.5 첨가가 수정란의 질적 양적 생산 효율에 미치는 영향을 검토하였다.
- 본 연구에서는 SMO에 직접적으로 작용하는 Hh signaling의 저분자 agonist인 Hh-Ag1.5가 돼지 체외성숙 및 체외 배발달에 미치는 영향을 검토하였다. 체외성숙 배양액에 0, 25, 50, 100 nM의 농도로 첨가하였을 때 성숙율(83.
제안 방법
- 5% Triton X-100과 3%(w/v) BSA가 첨가된 PBS로 37℃에서 30분간 처리하였다. Apoptotic cell를 검사하기 위해 TUNEL(In Situ Cell Death Detection Kit; Roche, Penzberg, Germany) 반응을 유도한 후, DAPI로 전체 세포의 핵을 염색하였다. TUNEL 반응이 유도된 배반포를 slide glass로 옮겨 antifluorescence-fade 액으로 피복하고, cover glass로 덮어 표본을 제작하였다.
- 배반포의 경우, FastLane Cell cDNA Kit(Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 제공된 방법에 따라 cDNA를 생산하였다. Real-Time RT-PCR은 Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit(Qiagen, Valencia, USA) 및 7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies, Grand Island, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다.
- 분석에 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다. Real-Time RTPCR의 증폭조건은 95℃에서 1분간 pre-incubation 과정을 거친 후, 95℃에서 15초 동한 denaturation 후 60℃에서 1분간 annealing의 과정을 40 사이클 반복하도록 조작하였다.
- 한편, Zfp42은 다양한 만능세포주(pluripotent cell line)에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 특히 마우스의 내부 세포괴(inner cell mass, ICM)에서도 발현되기 때문에 줄기세포의 만능성을 판단하는 지표로 이용되고 있다(Rogers 등, 1991). 따라서 본 연구에서는 돼지배반포에서 만능성과 관련된 유전자(telomerase reverse transcriptase, Tert; zinc finger protein 42, Zfp42)들의 mRNA 발현 정도를 검토하여 배반포의 질을 판단하는 지표로 활용하였다 (Fig. 4). Tert의 발현량을 분석한 결과, 대조군와 25 nM 처리군에서는 차이가 없었으나, 50 및 100 nM 처리군에서는 유의적으로 낮게 발현되었다(Fig.
- 05). 또한 이러한 결과가 세포사멸 관련 유전자와 연관이 되는지를 확인하기 위하여 Real-time RTPCR을 통한 세포사멸 관련 유전자인 Bax(pro-apoptotic gene) 및 Bcl-XL(anti-apoptotic gene) mRNA 발현 수준을 분석한 결과, Bax의 경우 Hh-Ag1.5 처리군에 비하여 무처리군에서 가장 Fig. 2. Apoptotic cell index in blastocysts derived IVF embryos.
- 배반포의 정상성을 알아보기 위하여 DNA fragmentation을 검사하였다. 배양 6일째에 생산된 배반포를 실온에서 3.
- 원심분리(500 × g) 후 상층액을 제거하고 0.04% BSA가 첨가된 PBS 액으로 3회 세척한 후, mTBM액으로 희석하여 체외수정용 배지에 5 × 105 spermatozoa/ml가 되도록 정자를 주입하여 체외수정을 유도(6시간)하였다.
- 체외에서 성숙된 난자로부터 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 RNA 추출한 후, Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 이용하여 RNA의 integrity를 조정하였다. 이후 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Life Technologies, Grand Island, USA)을 이용하여 제공된 사용법에 따라 cDNA를 생산하였다. 배반포의 경우, FastLane Cell cDNA Kit(Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 제공된 방법에 따라 cDNA를 생산하였다.
- 이후 PZM-3로 옮겨 5% CO2 및 39℃의 조건 하에서 6∼7일간 배양하며, 분할율 및 배반포 형성율을 검사하였다.
- 6 mM cysteine, 10 ng/mL epidermal growth factor(EGF), 10 IU/ml pregnant mare's serum gonadotropin(PMSG), human chorionic gonadotropin(hCG), 10%(v/v) porcine follicular fluid(PFF)가 첨가된 TCM-199 배양액 500 μl의 drop을 만들어 mineral oil로 피복하고, 성숙 배양 2∼3시간 전에 5% CO2, 39℃ 온도 조건 하에서 평형시킨 후, 각 drop당 100개의 난포란을 넣어 22시간 배양하였으며, 이후 호르몬이 첨가되지 않은 배양액으로 옮겨 20시간 동안 배양하였다. 일부 난자는 성숙 배양 전 기간에 걸쳐 각각 25, 50, 100 nM의 Hh-Ag1.5를 첨가하였다.
- TUNEL 반응이 유도된 배반포를 slide glass로 옮겨 antifluorescence-fade 액으로 피복하고, cover glass로 덮어 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 Leica 형광 현미경(Leica Microsystems, Mannheim, Germany)을 이용하여 전체 세포수와 apoptotic cell 수를 판단하였다.
- 체외에서 성숙된 난자로부터 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 RNA 추출한 후, Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 이용하여 RNA의 integrity를 조정하였다. 이후 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Life Technologies, Grand Island, USA)을 이용하여 제공된 사용법에 따라 cDNA를 생산하였다.
대상 데이터
- 도축장에서 도살된 암퇘지의 난소를 회수하여 25∼30℃의 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하여 직경이 3∼6 mm의 난포로부터 18 gauge 주사 바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 채란하고, 채취된 난자를 0.1%(w/v) polyvinylalcohol(PVA)이 첨가된 Tyrode's lactate(TL)-Hepes액으로 3번 세척한 뒤, 실체 현미경 하에서 난구 세포가 균일하고 세포질이 균질한 것만을 선별하여 난자 성숙에 공시하였다.
- 1% hyaluronidase에 넣고 3분간 교반(vortexing)하여 난구세포를 제거한 후, 체외수정에 이용하였다. 체외수정용 정액은 국립축산과학원에서 사육하고 있는 일반 돼지로부터 채취하였으며, BTS 액으로 희석한 신선 정액을 이용하였다. 원심분리(500 × g) 후 상층액을 제거하고 0.
데이터처리
- 모든 처리에 대한 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며, 난자의 fragmentation, 발육율, 세포수 및 mRNA 발현에 대한 결과들은 Statistical Analysis System(SAS Institute, Inc., Cary, USA)의 General Linear Models 절차를 이용한 Duncan's multiple range test로 유의성을 검토하였다.
이론/모형
- 이후 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Life Technologies, Grand Island, USA)을 이용하여 제공된 사용법에 따라 cDNA를 생산하였다. 배반포의 경우, FastLane Cell cDNA Kit(Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 제공된 방법에 따라 cDNA를 생산하였다. Real-Time RT-PCR은 Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit(Qiagen, Valencia, USA) 및 7500 Fast Real-Time PCR System(Life Technologies, Grand Island, USA)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 25 nM 처리구에서 유의적으로 높은 배반포 발육율을 보였으며(P<0.05), 배반포의 세포 수에는 영향이 없는 것으로 나타났다.
- Tert의 발현량을 분석한 결과, 대조군와 25 nM 처리군에서는 차이가 없었으나, 50 및 100 nM 처리군에서는 유의적으로 낮게 발현되었다(Fig. 4A, P<0.05).
- 높게 발현되고 있는 것을 확인하였다(Fig. 3, P<0.05) 한 결과, Bax의 경우 Hh-Ag1.5 처리군에 비하여 무처리군에서 가장 높게 발현되고 있는 것을 확인하였다(Fig. 3, P<0.05).
- 본 연구에서 생산된 배반포의 질적 양상을 평가하기 위하여 TUNEL 분석을 통한 배반포의 apoptotic cell 수를 확인한 결과, 무처리군과 100 nM 첨가군에 비해 25 및 50 nM 첨가군에서 유의적으로 낮은 DNA fragmentation이 나타났다(Fig. 2, P<0.05).
- 본 연구에서는 성숙란에서의 Rnf24발현량을 검토한 결과, 50 nM Hh-Ag1.5 처리군에서 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05, Fig. 1).
- 5%)에는 처리구간 차이가 없었다(미제 시). 성숙된 난자에서 Hh signaling의 억제 유전자로 알려진 Rab23의 발현 정도를 검토한 결과, 50 nM 이상 첨가하였을 경우에 발현이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1). 이는 일정 농도 이상의 Hh-Ag1.
- 한편, BclXL의경우 25 nM 처리군에서 가장 높게 발현되었으며(Fig. 3, P<0.05), 전체적으로 Hh-Ag1.5 처리에 의해 배반포 내 Bax/Bcl-XL 비율이 감소되는 경향을 보였다.
후속연구
- Ring-finger protein 24(Rnf24)는 수정되지 않은 성숙 난자에서 높은 수준으로 발현되며(Bobe 등, 2006), 수정 후 초기 분할 단계에서 급격히 저하되었다가 배반포 단계에서 최고 수준으로 발현된다(Malcuit 등, 2009). 따라서 Rnf24는 만능성(pluripotency)과 관련이 있을 것으로 사료되며, 성숙란 및 배반포에서의 발현 정도는 초기배 발달 능력을 평가하는 지표로 이용될 수 있을 것이다. 본 연구에서는 성숙란에서의 Rnf24발현량을 검토한 결과, 50 nM Hh-Ag1.
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