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문제 정의
- 본 연구에서는 LPS로 활성화된 Raw 264.7 cells에서 HCE의 NO 및 iNOS에 대한 억제를 평가하기 위하여 HCE를 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO양 및 iNOS의 발현을 관찰하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량 및 iNOS의 발현양이 증가하였으며, HCE를 처리한 군에서는 농도의존적으로 감소하였다.
- 본 연구에서는 석결명 추출물이 Raw 264.7 세포에 미치는 항염증 효과를 관찰하였다. 염증은 각종 유해한 자극에 반응하여, 유해물질에 의해서 유발되는 상해를 제거하고, 원래의 상태로 회복하려는 생체 조직의 방어 기작이다.
- 본 연구에서는 석결명에탄올추출물 (Haliotidis Concha ethanol extract, HCE)이 NO의 생성, iNOS, COX-2의 발현및 NF-κB 활성에 미치는 영향을 살펴보고자 본 연구를 실시하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 석결명추출물 (HCE)의 항염증효능을 평가하기 위하여, Raw 264.7 세포를 LPS로 활성화시킨 후 NO의 생성량과 iNOS, COX-2, IκBα, p-IκBα, NF-κB, MAPKs의 발현 및 PGE2, TNF-α 등에 미치는 HCE의 영향을 살펴본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 1). HCE가 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, HCE의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여, HCE를 3, 10, 30 ㎍/㎖로 처리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다. 실험결과 HCE의 3, 10, 30 ㎍/㎖농도에서 세포독성을 나타내지 않았다(data not shown).
- 7 세포를 24 well plate에 5×104 cell/well로 분주한 다음 24시간 후에 serum이 없는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. HCE를 농도별로 처리하고 1시간 후에 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양 후 540 ㎚에서 Titeritek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다17).
- 7 세포를 6 well plate에 1×106 cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 serum이 없는 배지로 교환하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. HCE를 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다. 시간별로 배양한 후, Immunoblot analysis를 실시하였다17).
- 세포질에 존재하다가, LPS 등의 신호자극에 의해 인산화되어 핵으로 들어가서 NF-kB 등의 전사인자들을 활성화하고, 관련 단백질을 유도한다21). HCE에 의한 MAPK 활성변화를 측정하기 위하여 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 관찰하였다. LPS에 의해 증가된 3종의 MAPK 인산화는 HCE에 의해 억제되었는데, 그중 ERK가 가장 강력한 억제효과가 나타났다(Fig.
- NO 생성 억제에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현량을 조사하였다. HCE을 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다. LPS 처리시에는 iNOS 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 HCE를 처리 시에는 iNOS 단백질 발현이 농도의존적으로 감소하였다(Fig.
- HCE의 PGE2의 억제 효과를 확인하기 위해 Raw 264.7 세포에서 HCE (30 ㎍/㎖)를 처리한 다음, 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하고 12시간 동안 배양하여 PGE2의 효과를 ELISA kit로 평가하였다. LPS처리군은 control군에 비해 높은 증가를 나타내었으며, 이러한 증가는 HCE에 의해 억제되었다(Fig.
- HCE의 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의한 TNF-α 억제 효과를 확인하기 위해 HCE (30 ㎍/㎖)를 처리한 다음, 1시간후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하고 12시간 동안 배양하여 TNF-α의 효과를 ELISA kit를 이용하여 확인하였다.
- HCE를 농도 별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다. LPS 처리 후 12시간에 배지를 수거하여 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. TNF-α 생성률은 control cell에 대한 백분율로 나타내었다.
- NO 생성 억제에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현량을 조사하였다. HCE을 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다.
- Raw 264.7 cell에서 HCE의 NO 생성억제 정도를 관찰하기 위하여 HCE를 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 후 생성되는 NO양을 측정하였다. HCE는 LPS에 의해 유도된 NO의 양을 유의성있게 억제하였다(Fig.
- 시간별로 배양한 후, Immunoblot analysis를 실시하였다17). 발색후 각 단백질의 발현량을 평가하기 위하여 Image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)을 이용하여 Densitometric analysis를 실시하였다.
- 본 실험에서는 I κBα의 전체 단백질 양과 p-IκBα의 양을 측정하였다.
- 본 연구에서는 IκBα의 phosphorylated form을 측정하였다.
- HCE를 농도별로 처리하고 1시간 후에 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 생존세포에 MTT (0.1 ㎍/㎖)를 넣고 4시간 배양 후 assay를 실시하였다17). 세포생존율은 control cell에 대한 백분율로 나타내었다.
- HCE를 농도별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다. 시간별로 배양한 후, Immunoblot analysis를 실시하였다17). 발색후 각 단백질의 발현량을 평가하기 위하여 Image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd.
- 염증반응 또는 발암과정에서 중요한 역할을 하는 COX-2에 대한 HCE의 억제 효과를 확인하기 위해 HCE을 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다. LPS 처리시에는 COX-2 단백질의 발현이 유의하게 증가되었으나, HCE의 전 처리는 COX-2 단백질의 발현을 유의하게 억제하였다 (Fig.
- 이러한 IκBα 인산화의 억제가 NF-κB 활성을 저해 시키는지 확인하기 위해 HCE을 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다.
대상 데이터
- Inhibitor kappa B (IκB)α와 NF-κB 및 actin antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Inc, CA, USA)에서 구입하였고 phosphorylated IκBα (p-IκBα), phosphorylated p44/42 MAPK (p-ERK), phosphorylated p38 MAPK (p-p38), phosphorylated SARK/JNK (p-SARK/JNK)와 lamin A/C antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- LPS (Escherichia coli 055:B5)와 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoleu m)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Fetal bovine serum과 antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였다. iNOS antibody는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하였고 COX-2 antibody는 Cayman (Ann Arbor, Mi, USA)에서 구입하였다.
- Murin macrophage cell line인 Raw 264.7 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium에 10% fetal bovine serum, 100 U/㎖ penicillin 및 100 ㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- NC paper는 Schleicher & Schuell (Dassel, Germany)사의 것을 사용하였다.
- TNF-α ELISA Kits는 Thermo (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였고 PGE2 Assay Kits는 R&D Systems (USA)를 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Fetal bovine serum과 antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였다. iNOS antibody는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하였고 COX-2 antibody는 Cayman (Ann Arbor, Mi, USA)에서 구입하였다. Inhibitor kappa B (IκB)α와 NF-κB 및 actin antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Inc, CA, USA)에서 구입하였고 phosphorylated IκBα (p-IκBα), phosphorylated p44/42 MAPK (p-ERK), phosphorylated p38 MAPK (p-p38), phosphorylated SARK/JNK (p-SARK/JNK)와 lamin A/C antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 石決明 (Haliotidis Concha)은 대원약업사 (Daegu, Korea)에서 구입하여 평가를 거친 후 사용하였다. 石決明 600g을 에탄올 (EtOH)에 침지하여 실온에서 72시간 동안 추출하였고 여과는 0.
데이터처리
- The significances of the difference between the treated groups was evaluated using the t-test (significant as compared with vehicle-treated control, **p<0.01; significant as compared with LPS alone, ##p<0.01).
- 실험 결과는 mean ± S.D. 로 나타내었으며, t-test의 통계처리방법으로 통계적 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 1. HCE는 LPS에 의해 증가한 NO 생성을 유의하게 억제하였으며, NO를 억제한 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한 LPS에 의해 증가된 iNOS의 발현을 감소시켰다.
- 2. HCE는 LPS로 증가된 IκBα의 인산화를 감소시켰으며, 핵으로의 NF-κB 전위를 억제하였다.
- 3. HCE은 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 분비되는 TNF-α의 생성량을 감소시켰으며, LPS에 의해 발현이 증가된 COX-2와 PGE2를 감소시켰다.
- 4. HCE는 LPS에 의해 증가된 MAPKs의 인산화를 억제하였다.
- 염증반응 또는 발암과정에서 중요한 역할을 하는 COX-2에 대한 HCE의 억제 효과를 확인하기 위해 HCE을 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하였다. LPS 처리시에는 COX-2 단백질의 발현이 유의하게 증가되었으나, HCE의 전 처리는 COX-2 단백질의 발현을 유의하게 억제하였다 (Fig. 3).
- LPS 처리시에는 NF-κB (p65) 단백질의 핵내 발현이 유의하게 증가되었으나, HCE의 전처리는 NF-κB의 핵내 발현을 유의성있게 억제하였다(Fig. 4B).
- LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량 및 iNOS의 발현양이 증가하였으며, HCE를 처리한 군에서는 농도의존적으로 감소하였다. LPS로 유도된 NO 및 iNOS의 생성을 감소시킨 것이 HCE의 세포독성으로 인한 세포수의 저하에서 기인하였는지 관찰하기 위해 MTT assay를 실시하여 cell viability를 측정하여 확인해본 결과 HCE 3, 10, 30 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. HCE는 오히려 LPS에 의한 세포독성을 억제하였다 (data not shown).
- 그 중, COX-2에 의해 생성되는 PGE2는 세포자멸사의 억제, 세포분열 및 암세포 전이, 혈관신생을 유도하여 종양의 형성에 기여하는 것으로 알려져 있다30). LPS로 활성화된 Raw 264.7 cells에서 HCE이 COX-2 단백질 발현을 억제하는지 평가해 본 결과 HCE은 LPS에 의해 증가된 COX-2 단백질 발현을 농도의존적으로 감소 시켰으며 PGE2의 생성 또한 유의성 있게 억제하였다. 이 결과는 HCE이 COX-2 단백질의 발현을 억제하며, 이를 통하여 PGE2의 생성 억제가 나타나는 것을 의미한다.
- HCE에 의한 MAPK 활성변화를 측정하기 위하여 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 관찰하였다. LPS에 의해 증가된 3종의 MAPK 인산화는 HCE에 의해 억제되었는데, 그중 ERK가 가장 강력한 억제효과가 나타났다(Fig. 5B).
- 7 세포에서 HCE (30 ㎍/㎖)를 처리한 다음, 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하고 12시간 동안 배양하여 PGE2의 효과를 ELISA kit로 평가하였다. LPS처리군은 control군에 비해 높은 증가를 나타내었으며, 이러한 증가는 HCE에 의해 억제되었다(Fig. 5A, left). 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 TNF-α 는 LPS반응의 주요 매개체로서 내재면역에 있어서도 중요한 역할을 한다.
- 본 연구에서 LPS는 Raw 264.7 cell에서 TNF-α의 분비를 유의하게 촉진시켰으며, HCE는 TNF-α의 생성량을 유의하게 감소시켰다.
- 7 cell에서 TNF-α의 분비를 유의하게 촉진시켰으며, HCE는 TNF-α의 생성량을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 HCE가 여러 종류의 면역게재 염증성 질환을 유의하게 개선시킬 수 있음을 의미한다.
- HCE는 오히려 LPS에 의한 세포독성을 억제하였다 (data not shown). 이러한 결과로 볼 때 LPS에 의한 과량의 NO가 Raw 264.7 cells의 세포생존율을 저하시켰으며, HCE는 NO의 생성을 억제함으로서 세포생존율을 증가시킨 것으로 판단된다.
후속연구
- 이러한 석결명의 효능은 인체의 熱을 낮추어 통증을 제거하는 의미라고 해석할 수 있는데, 이는 현대의학적으로 염증반응의 개선효과를 통해서도 드러날 수 있다. 그러므로, 전통한의학적 지식과 본 연구 결과를 바탕으로 석결명이 가지는 항염증, 항산화 효능에 대한 보다 다각도의 연구가 필요하다고 하겠다.
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