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문제 정의
- 최근 광노화에 대한 우려로 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 제품의 사용이 증가하고 있으나 소비자들은 합성 화장품 성분에 대한 피부 자극을 우려하여 거부반응을 보이는 경향이 있으며 자연적으로 천연에서 유래한 기능성 소재를 발굴하기 위한 연구가 활발하다. 그러므로 본 연구에서는 다양한 해양소재를 선택하여 자외선으로 인한 세포독성 및 산화적 사멸 억제 효능, 세포 내 항노화 효능을 비교하는 생화학적 실험을 통해 천연 항노화 화장품 소재를 발굴하고자 하였다. 우선 인간섬유아세포인 HS68세포를 자외선 B (120 mJ/cm2)에 노출시킨 결과 세포 내 활성산소종이 40 % 이상 증가하였으나 해양 소재 에탄올 추출물을 처리한 경우 미역, 김, 모자반 순으로 현저히 억제되었으며 이들 물질은 특히 대표적인 피부 내 진피층의 콜라겐 합성과 관련되는 type Ⅰ collagen과 type Ⅰ procollagen을 높은 수준으로 발현하였다.
- 화장품 분야에서는 천연소재의 항균, 피부미백, 주름개선, 항노화 효과에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며 실제로 제품화에 활용되고 있다[10]. 이에 본 연구는 UVB를 조사하여 손상을 유도한 섬유아세포에 라디칼 소거능이 뛰어난 해양 추출물을 적용하여 세포독성 및 사멸, 산화적 스트레스를 억제하고 세포 내 항산화 기능을 보호할 수 있는 천연 유래 항산화제의 효능효과를 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 상기 해양 에탄올 추출물의 항노화 효능을 확인하기 위해서 자외선 B를 아래와 같은 조건으로 처리하였다. HS68 세포를 80 % 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 제거하고 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치(BLX-E254, Viber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 각각 120 mJ/cm2의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 다양한 농도의 에탄올 추출물을 처리하여 24 h 배양하였다.
- Invitrogen사의 TRIzol Reagent를 사용하여 명시된 방법에 따라 Total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로 부터 cDNA 합성은 M-MLV Reverse Transcriptase를 사용하여 합성하였으며, 항산화 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 수행하였다.
- TMRE dye를 사용하여 미토콘드리아 막전압을 측정하였다. HS68 세포(6 × 104개/ 500 µL)를 chamber slide에 넣고 자외선 B를 조사한 후 해양 에탄올 추출물을 처리하여 37 ℃ 5 % CO2 incubator에서 24 h 동안 배양하였다.
- PCR 조건은 95 ℃에서 5 min 진행한 후 95 ℃ 30 s, 53 - 61 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min을 40 cycle 수행 후 72 ℃ 5 min 더 반응시켰다. 각 PCR 산물들은 edithium bromide를 처리한 1.5 % agarose gel에서 50 V로 전기영동한 후 Image analysis 장비를 사용하여 노화관련 유전자 발현을 측정하였으며, Quantity One Software를 이용해 정량분석하였다.
- 그중 대표적인 것이 cyrochrome c인데, 이는 다양한 하위 caspase를 활성화시켜 궁극적으로 apoptosis를 매개하게 된다. 그러므로 이후 실험에서는 세포사멸의 지표 중의 하나로 자외선 B로 인하여 손상된 세포내 미토콘드리아 막 전압을 TMRE 형광염색시약을 사용하여 측정하였다. 그 결과 자외선 B를 조사한 경우 MMP가 25 % 정도 감소된 것에 반하여 해양 에탄올 추출물을 처리한 그룹에서는 MMP가 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Figure.
- 그후 PBS 200 µL를 well에 분주 후 자외선 B를 120 mJ/cm2로 조사하였다.
- 다양한 농도의 해양 에탄올 추출물 에탄올 추출물(0, 10, 30, 100 µg/mL)을 HS86 세포주에 24 h 동안 처리하고 MTT reduction assay로 세포생존 정도를 정량하였다.
- 실험을 위하여 4 × 104개/ 300 µL의 세포를 48-well 및 2 × 106개/ 2 mL의 세포를 6-well plate에 접종하여 24 h 뒤 세포가 안정적으로 부착된 후에 에탄올 추출물을 처리하였다.
- 과산화수소는 이후 철 및 구리와 같은 전이금속과 반응하여 팬톤반응(Fenton reaction)을 통해 매우 반응성이 강한 hydroxyl radical을 형성하게 된다. 이러한 이론적 배경을 바탕으로 자외선 B로 유도된 섬유아세포 독성에 실제로 활성산소종이 관여하는지 객관화하기 위하여 세포 내부에 축적된 활성산소종의 양을 DCA-DA 시약을 사용하여 측정하였다. DCF-DA는 세포 밖에서는 형광을 띠고 있지 않지만, 친유성이 매우 높아 세포 내로 쉽게 침투되며, 이후 esterase 또는 산화적 가수분해를 받아 DCFH를 형성하여 세포 내에 축적되게 된다.
- 이후 실험에서는 에탄올 추출물의 자체 독성을 바탕으로 추출물의 농도를 10, 30µg/mL로 고정한 다음 자외선 B를 조사하여 세포독성에 미치는 해양 에탄올 추출물의 보호효과를 검토하였다.
- 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 세포사멸에 대한 상기 해양 에탄올 추출물의 항노화 효능을 확인하기 위해서 자외선 B를 아래와 같은 조건으로 처리하였다. HS68 세포를 80 % 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 제거하고 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치(BLX-E254, Viber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 각각 120 mJ/cm2의 자외선 B를 조사하였다.
- 자외선 B는 피부세포의 면역억제, 염증촉진, 유전자 손상을 통한 피부암 유발을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 특히 이러한 신호전달과정의 시작은 산화적 스트레스가 중요한 역할을 한다. 자외선 B로 손상이 유도된 HS68의 산화적 손상 및 독성에 대한 해양 에탄올 추출물의 보호효과를 평가하기 위하여, 우선 에탄올 추출물들을 단독으로 처리하고 세포생존에 미치는 영향을 살펴보았다. 다양한 농도의 해양 에탄올 추출물 에탄올 추출물(0, 10, 30, 100 µg/mL)을 HS86 세포주에 24 h 동안 처리하고 MTT reduction assay로 세포생존 정도를 정량하였다.
- Invitrogen사의 TRIzol Reagent를 사용하여 명시된 방법에 따라 Total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로 부터 cDNA 합성은 M-MLV Reverse Transcriptase를 사용하여 합성하였으며, 항산화 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5 min 진행한 후 95 ℃ 30 s, 53 - 61 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min을 40 cycle 수행 후 72 ℃ 5 min 더 반응시켰다.
대상 데이터
- 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCF-DA) 및 tetramethylrhodamine ethyl ester(TMRE)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였고, MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]를 포함한 시약은 Sigma-Aldrich 제품(St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.
- 김(Porphyra Thalli; PTE), 다시마(Laminariae japonicae thallus; LJE), 모려(Ostreae Concha; OCE), 모자반(Sargassum Thallus; STE), 미역(Undaria thallus; UTE), 석결명(Haliotidis Concha; HCE), 우뭇가사리(Agar; AgE), 청각(Codium thalli; CTE), 톳(Hizikia fusiforme thalli; HFE), 파래(Thalli; ThE)는 경상북도 포항 죽도시장에서 구입하였고 에탄올 추출하여 획득하였다. 각각의 에탄올 추출물(ethanol extract : E/E)은 100 % 에탄올을 가하여 상온에서 72 h 동안 추출한 후 No.
- 세포 내부에 발생되는 활성산소는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)를 사용하여 측정하였다.
- 인간 섬유아세포주인 HS68 세포는 DMEM에 10 % FBS, 100 U/mL penicillin 및 100 µg/mL streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였고, 37 ℃, 5 % CO2조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
- 인간 피부 섬유아세포주(human skin fibroblast, HS68 세포주)는 ATCC (Rockville, MD, USA)로부터 분양받아 사용했으며, 세포배양을 위한 배지로서 DMEM(Dulbecco’s modified Eagel’s medium), FBS (fetal bovine serum) 및 항생제(penicillin/streptomycin)는 Gibco 사(Grand Island, NY, USA) 제품을 구입하여 세포실험에 사용하였다.
이론/모형
- 세포생존률을 측정하기 위하여 MTT assay를 적용하였다. HS68 세포를 48-well plate에 4 × 104 cells/well로 분주한 다음 24 h 후에 FBS를 포함하지 않는 배지로 교환하여 24 h 동안 배양하였다.
성능/효과
- DCFH는 세포 내 생성된 과산화물(peroxide)와 반응하여 형광 물질인 DCF를 형성하므로 형광측정기(fluorometer)로 쉽게 관찰이 가능하다. HS68 섬유아세포에 자외선 B를 3 h 동안 처리한 결과 세포 내 강한 형광을 나타내는 세포 수가 증가되어 형광강도가 강해진 것을 확인하였다. 이는 세포 내 활성산소종이 40 % 이상 증가된 것으로 평가되며, 이는 해양 에탄올 열수 추출물을 처리함으로써 정상 수준으로 감소되었다.
- 이후 여액을 진공회전농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하고, 동결 건조하였으며 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다. 각 추출물의 최종 수율은 김(PTE/E) 0.58 %, 다시마(LJE/E) 1.19 %, 모려(OCE/E) 0.28 %, 모자반(STE/E) 0.29 %, 미역(UTE/E) 0.32 %, 석결명(HCE/E) 0.06 %, 우뭇가사리(AgE/E) 0.5 %, 청각(CTE/E) 0.73 %, 톳(HFE/E) 2.33 %, 파래(ThWE) 1.45 %이었다.
- 그 결과 100 µg/mL에서는 추출물 자체로 세포독성을 나타내었으며, 특히 모려 및 모자반, 미역에서 두드러지는 것으로 평가되었으며 50 % 이하로 세포 생존율이 감소하였다(Figure. 1).
- 그러므로 이후 실험에서는 세포사멸의 지표 중의 하나로 자외선 B로 인하여 손상된 세포내 미토콘드리아 막 전압을 TMRE 형광염색시약을 사용하여 측정하였다. 그 결과 자외선 B를 조사한 경우 MMP가 25 % 정도 감소된 것에 반하여 해양 에탄올 추출물을 처리한 그룹에서는 MMP가 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Figure. 3). 특히 모자반, 석결명, 우뭇가사리, 청각, 파래 추출물이 MMP 감소를 억제하는 효능이 뛰어났으며 특히 모자반과 우뭇가사리는 85 % 이상 회복되는 것을 확인하였다.
- 즉, 피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기인하며 특히 광노화된 피부의 경우 콜라겐 합성이 감소하고 분해효소의 활성이 증가되어 있는 특성이 나타난다. 본 연구에서 HS68 세포에 자외선 B를 노출시킨 경우 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 현저히 감소되었으나, 해양 에탄올 추출물을 처리하였을 때 특히 석결명과 우뭇가사리의 경우 type Ⅰ collagen이 자외선 단독 처리군보다 증가하였다. Type Ⅰ procollagen 또한 석결명과 우뭇가사리를 처리한 군에서 정상군 수준으로 회복되었으며, 모자반 30 µg/mL 처리군에서도 긍정적인 효능은 관찰 할 수 있었다(Figure 5).
- 우뭇가사리와 파래 에탄올 추출물 10, 30 µg/mL을 처리한 군에서는 오히려 세포생존율이 증가하는 것으로 나타났다.
- 그러므로 본 연구에서는 다양한 해양소재를 선택하여 자외선으로 인한 세포독성 및 산화적 사멸 억제 효능, 세포 내 항노화 효능을 비교하는 생화학적 실험을 통해 천연 항노화 화장품 소재를 발굴하고자 하였다. 우선 인간섬유아세포인 HS68세포를 자외선 B (120 mJ/cm2)에 노출시킨 결과 세포 내 활성산소종이 40 % 이상 증가하였으나 해양 소재 에탄올 추출물을 처리한 경우 미역, 김, 모자반 순으로 현저히 억제되었으며 이들 물질은 특히 대표적인 피부 내 진피층의 콜라겐 합성과 관련되는 type Ⅰ collagen과 type Ⅰ procollagen을 높은 수준으로 발현하였다. 즉 이상의 결과는 해양 소재 추출물이 다양한 항산화 및 항노화 작용을 나타냄으로써 특히 산화적 스트레스가 관여되는 피부손상 및 광노화를 보호하는 독성이 낮은 기능성 화장품 천연소재로 응용될 수 있음을 시사한다.
- 자외선 B를 조사한 경우 세포생존율이 70 % 정도로 감소하였으며, 해양 에탄올 추출물을 함께 처리한 그룹에서 세포생존율이 증가됨을 확인할 수 있었다(Figure. 2). 이는 해양 에탄올 추출물이 섬유아세포에서 자외선 B 조사로 인한 세포독성 및 사멸을 감소시키는 효과가 있다는 것을 나타낸다.
- 3). 특히 모자반, 석결명, 우뭇가사리, 청각, 파래 추출물이 MMP 감소를 억제하는 효능이 뛰어났으며 특히 모자반과 우뭇가사리는 85 % 이상 회복되는 것을 확인하였다.
후속연구
- Type Ⅰ procollagen 또한 석결명과 우뭇가사리를 처리한 군에서 정상군 수준으로 회복되었으며, 모자반 30 µg/mL 처리군에서도 긍정적인 효능은 관찰 할 수 있었다(Figure 5). 이는 해양 추출물이 피부 진피층에 다량 존재하는 콜라겐이 자외선 반응으로 인한 과산화를 억제하는데 효과적으로 활용될 수 있음을 시사한다.
- 우선 인간섬유아세포인 HS68세포를 자외선 B (120 mJ/cm2)에 노출시킨 결과 세포 내 활성산소종이 40 % 이상 증가하였으나 해양 소재 에탄올 추출물을 처리한 경우 미역, 김, 모자반 순으로 현저히 억제되었으며 이들 물질은 특히 대표적인 피부 내 진피층의 콜라겐 합성과 관련되는 type Ⅰ collagen과 type Ⅰ procollagen을 높은 수준으로 발현하였다. 즉 이상의 결과는 해양 소재 추출물이 다양한 항산화 및 항노화 작용을 나타냄으로써 특히 산화적 스트레스가 관여되는 피부손상 및 광노화를 보호하는 독성이 낮은 기능성 화장품 천연소재로 응용될 수 있음을 시사한다.
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