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문제 정의
- 본 연구에서 indigo를 화학적으로 대량 환원시킴으로써 발생하는 환경오염이나 질환 유발 문제를 해결하기 위해, indigo의 환원과정에 미생물을 이용할 수 있는 가능성을 제시하고자 한다. 이를 위해 metagenomics의 전형적인 접근법으로 쪽 식물을 발효시킨 발효액에 존재하는 균총을 분석한 후, 분리 배양될 수 있는 균주의 특성 규명을 시도하였다.
- 이를 위해 metagenomics의 전형적인 접근법으로 쪽 식물을 발효시킨 발효액에 존재하는 균총을 분석한 후, 분리 배양될 수 있는 균주의 특성 규명을 시도하였다. 이들의 indigo 환원능은 확인함으로써 전통적인 인디고 발효과정에 규격 혹은 표준화 요소로서 미생물의 이용가능성을 알아보았다.
제안 방법
- 2차 선별된 clone을 LB 액체 배지에 배양하여 DNA purification system (Promega, USA)을 사용하여 plasmid을 정제하였다. 정제된 plasmid는 삽입된 각각의 16S rRNA 유전자를 PCR로 재증폭하기 위한 주형으로 이용하였다.
- 균의 성장에 따라 액화가 진행되는 정도를 측정해 젤라틴 분해능을 확인하였다. Catalase test는 3% 과산화수소를 균배양액의 10배가 되도록 혼합하여 기포의 생성 여부를 확인하거나, 30℃에서 배양한 평판배지 콜로니 위에 과산화수소액 (3%, 5 uL)을 첨가해 기포 생성 여부로 확인하였다. Cytochrome oxidase의 활성 유무는 nutrient 평판배지에 접종한 균을 30℃에서 배양한 후, α-naphtol/95% ethanol : 1% dimethyl-p-phenylenediamine oxalate solution 용액을 1:1로 첨가해 색변화로 결정하였다.
- 또한 정확한 동정을 위해 생리·생화학적 특성분석을 위한 하기 실험을 진행하였다. Gram-staining과 KOH test를 통해 균주의 표현형질을 판별하였다. 단백질 가수분해능을 조사하기 위해 nutrient 평판배지 (0.
- Indican에 대해 활성이 있는 균주로 선별된 4가지 균주에 대한 정확한 동정을 위해 배양 특성과 생리/생화학적 특성을 분석하였다 (Table 1). 우선, Gram-staining 결과 모두 양성균임이 확인되었다.
- Indican으로부터 indigo의 생산이 가능하고, 발효액의 염기조건에서 생존하는 것으로 확인된 균주들을 이용해 염액의 생성과정에서 중요한 환원력 (indigo의 leuco-indigo로의 전환)을 제공하는지를 시험하였다. 이를 위해 최종선별된 4종의 균주와 대조군으로 대장균 (E.
- PCR 반응은 Taq polymerase (1 U)를 이용하여 주형 DNA 0.3 ng를 첨가하고, 10x Taq polymerase buffer 1 µL, 10 mM dNTP 1 µL, 그리고 각각의 primer를 5 pmol 첨가하여 전체 양이 25 µL되게 수행하였다.
- 25℃에서 반응시키며 시간에 따라 세포를 회수 (13,000 rpm, 10 min)하고 생성된 formazan은 95% ethanol에 녹였다[20,21]. UV-Visible Spectrophotometer (UV-1700, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 흡광도 (485 nm) 값을 측정해 환원력을 분석하였고, 대조군으로 대장균 XL1-Blue와 화학 환원제인 sodium dithionite (Na2S2O4)를 이용하였다.
- 3 mM indigo-carmine이 포함된 배지를 제작하였다 [22]. 각 균을 30℃ 혐기조건에서 3일간 배양하며 배지의 색상 변화를 통해 환원력 여부를 확인하였다.
- 모든 균의 경우, 회수량을 배양액 기준으로 30, 60, 90, 150 mL (dry weight 20, 40, 60, 100 mg)로 나누어 환원여부를 확인하였다. 각 반응액은 하루에 한번씩 inverting을 통해 섞일 수 있도록 하였고, 반응개시 날을 0일로 하여 매일 염색을 시도하였다. 염색은 경과일에 따라 0.
- 따라서 추출된 핵산을 주형으로 16S rRNA gene을 증폭하기 위해, 시료를 희석 (1/10~1/100)해 PCR을 수행하였다. 각각 (염색이 잘 된 것과 그렇지 않은 것)의 발효액에서 얻은 16S rRNA 유전자들은 클로닝이 용이한 commercialized TA cloning vector를 사용하여 library를 구축하였다. 재조합 유전자 pool은 X-gal을 이용하여 약 2900개의 positive clone을 1차적으로 확보하였고, insert의 제한효소 (Sau3AI) 처리에 따른 절편의 크기와 패턴에 따라 총 40개의 subfamily로 분류해 균총분석에 이용하였다.
- 이들 균주를 포함하여 복합적인 균총 가운데 분리 배양이 가능한 균주를 선별하기 위해, 천연 발효액의 물리화학적인 특성과 메타지놈 분석 결과를 바탕으로 영양배지를 변형시켜 농화배양을 통한 균주 선별과정에 이용하였다. 경우에 따라, 농화배양 배지의 선택성을 강화할 목적으로 인디칸을 배지에 추가로 첨가하였다. 준비된 배양액에 발효액을 희석배율에 따라 도말하고 30℃에서 4일간 배양하였을 때, 정상적으로 염색이 진행된 발효액에서 5개의 균주 (TPL19, Tibet-IBa2, AC84, W5044, 110-8)를 얻을 수 있었다.
- API ZYM kit (BioMerieux, France)는 미생물의 효소활성(19가지)을 검사하기 위해 주로 사용되는 도구로서 거의 모든 종류의 균에 적용할 수 있다. 균의 성장 조건에 따라 나타나는 효소활성의 차이를 확인하기 위해 Rich 평판배지 (1% tryptone, 0.5% NaCl, 0.5% yeast extract, 0.3% beef extract, 1% agar, pH10)와 YPD 평판배지 (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1% agar, pH 10)에서 배양한 균을 멸균증류수 혹은 0.85% NaCl 용액에 부유시켰다 (OD550 nm=1~1.5). Kit의 각 큐플에 150 mL의 균액을 접종하고 30℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다.
- 백금을 이용하여 젤라틴 배지 가운데 균을 접종하고 배양 (20~23℃)하였다. 균의 성장에 따라 액화가 진행되는 정도를 측정해 젤라틴 분해능을 확인하였다. Catalase test는 3% 과산화수소를 균배양액의 10배가 되도록 혼합하여 기포의 생성 여부를 확인하거나, 30℃에서 배양한 평판배지 콜로니 위에 과산화수소액 (3%, 5 uL)을 첨가해 기포 생성 여부로 확인하였다.
- 5%가 되도록 첨가하여 균을 배양하였다. 균의 성장으로 형성된 투명한 환에 10% HgCl2/20% HCl 용액을 가하여 카제인에 대한 분해능을 확인하였다. 전분 분해능을 확인하기 위해 nutrient 평판배지에 0.
- 농축된 sample 1 mL로부터 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
- Gram-staining과 KOH test를 통해 균주의 표현형질을 판별하였다. 단백질 가수분해능을 조사하기 위해 nutrient 평판배지 (0.3% yeast extract, 0.8% peptone, 1% agar)에 skim milk를 0.5%가 되도록 첨가하여 균을 배양하였다. 균의 성장으로 형성된 투명한 환에 10% HgCl2/20% HCl 용액을 가하여 카제인에 대한 분해능을 확인하였다.
- 대표적인 universal primer인 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하여 각 발효액으로부터 획득한 genomic DNA를 주형으로 PCR를 이용해 16S rRNA 유전자를 증폭하였다.
- 균의 동정과정은 표현형뿐만 아니라 생리활성의 특성을 확인함으로써 보다 정확한 계통을 확인할 수 있다. 따라서 pH 9 이상의 알칼리에서 자라는 특성을 바탕으로 각 균이 특정 시약에 반응하는지 여부를 확인할 수 있는 API ZYM kit를 이용하여 생리활성을 분석하였다. API ZYM kit 결과, 110-8, W5044, AC84는 비슷한 특성을 보이지만, TPL19는 세 가지 균주와는 다른 특성을 보였다 (Table 2).
- 이는 천연 인디고 제작과정에서 첨가된 소석회나 멸균되지 않은 잔존 미생물에 의한 효과일 수 있다. 따라서 본 연구에서는 보다 분명한 선별균의 환원력을 평가하기 위해 시판중인 합성 인디고를 이용하였다. 대조군으로 이용한 균이 포함되지 않은 합성인디고는 환원이 이루어지지 않아 염색이 되지 않았다.
- 핵산의 분리과정에서 회수율 감소의 주원인으로 분석된 protein precipitation solution을 처리하지 않았기 때문에 추출된 핵산에는 단백질을 포함한 불순물이 포함되어 있다. 따라서 추출된 핵산을 주형으로 16S rRNA gene을 증폭하기 위해, 시료를 희석 (1/10~1/100)해 PCR을 수행하였다. 각각 (염색이 잘 된 것과 그렇지 않은 것)의 발효액에서 얻은 16S rRNA 유전자들은 클로닝이 용이한 commercialized TA cloning vector를 사용하여 library를 구축하였다.
- 발효액을 희석 배율에 따라 영양배지에 도말하고, 30℃에서 4일간 배양하였다. 또한 인디고 염료의 전구물질인 indican 배당체(indoxyl-glucose)를 탄소원으로 사용하여 생장 가능한 균주를 선별하기 위해 M9 최소영양배지에서 같은 조건으로 배양하였다. 배양된 균주는 일반적인 표현형질 차이에 따라 최종분석 대상 균주로 선별하였다.
- 또한 정확한 동정을 위해 생리·생화학적 특성분석을 위한 하기 실험을 진행하였다.
- 1 도달한 시점에서 원심분리 (10,000 rpm, 4℃ 10 min)로 회수하였다. 모든 균의 경우, 회수량을 배양액 기준으로 30, 60, 90, 150 mL (dry weight 20, 40, 60, 100 mg)로 나누어 환원여부를 확인하였다. 각 반응액은 하루에 한번씩 inverting을 통해 섞일 수 있도록 하였고, 반응개시 날을 0일로 하여 매일 염색을 시도하였다.
- 배양 후, kit 에 포함된 ZYM A와 B용액을 각각 첨가해 5분간 반응시킨 후 결과를 분석하였다. 반응 경과에 따라 1, 3, 12시간 동안 상온에서 반응시키면서 발색여부를 확인하였다.
- 발효 염액으로부터 배양된 4종의 균주는 colony PCR을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하여 서열을 분석한 후, 동정에 이용하였다. 또한 정확한 동정을 위해 생리·생화학적 특성분석을 위한 하기 실험을 진행하였다.
- 발효 염액의 복합적인 균총 가운데 분리가 가능한 균주를 배양하기 위해, 16S rRNA 서열을 이용한 균주 동정 결과를 바탕으로 영양배지 (1% Trypton, 0.5% Yeast extract, 0.3 g Beef Extract, 5% NaCl and pH 10)를 변형해 이용하였다. 발효액을 희석 배율에 따라 영양배지에 도말하고, 30℃에서 4일간 배양하였다.
- Kit의 각 큐플에 150 mL의 균액을 접종하고 30℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, kit 에 포함된 ZYM A와 B용액을 각각 첨가해 5분간 반응시킨 후 결과를 분석하였다. 반응 경과에 따라 1, 3, 12시간 동안 상온에서 반응시키면서 발색여부를 확인하였다.
- 보다 유의한 방법으로 indigo와 유사한 구조를 가지며, 환원여부를 확인할 수 있는 지시약인 indigo-carmine을 이용하여 4개 균주의 환원력을 확인하였다. 4.
- 상기 과정에서 최종 선별된 40개의 클론은 제한효소 절단 절편 패턴이 같은 각각의 subfamily를 대표할 수 있는지를 임의로 선정된 subfamily 하나의 특성분석으로 확인한 후, 서열 분석을 진행하였다. 얻어진 염기서열은 BLAST N (NCBI) 프로그램을 이용해 database (GenBank) 상의 관련 균주들과 consensus sequence를 비교하는 방법으로 동정에 이용하였다.
- 서열 분석에는 pGEM®-T와 T-Blunt vector의 M13 primer (F5’-GTAAAACGACGGCCA GT-3’, R5’-GCGGATAACAATTTCACACAGG–3’)를 이용하였다.
- 서열 분석에는 pGEM®-T와 T-Blunt vector의 M13 primer (F5’-GTAAAACGACGGCCA GT-3’, R5’-GCGGATAACAATTTCACACAGG–3’)를 이용하였다. 얻어진 sequence는 BlastN (NCBI)을 이용해 관련 균주들과 비교하여 동정에 이용하였다.
- 1% 아세트산 수용액으로 10분 중화 후 건조하였다. 염색한 직물은 색차계 (Color-Eye 3100, Macbeth, USA)를 이용하여 최대 흡수파장에서의 K/S 값으로 표면염착을 평가하였다.
- 전라남도 나주의 쪽 천연염색 장인이 쪽 (Polygonum tinctorium)의 전통발효를 통해 만든 염액 중 염색이 잘 되는 2008년, 2010년 염액과 염색이 잘 되지 않는 2009년 염액을 -70℃에 보관된 상태로 시료로 사용하였다. 영양배지 (1% Trypton, 0.5% Yeast extract, 0.3 g Beef Extract, 5% NaCl and pH 10)는 2 N NaOH를 이용하여 pH를 조절하였고, YPA 배지 (0.8% peptone, 0.3% yeast extract, 1% agar and pH 10) 와 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1% agar, pH 10)는 100 mM NaHCO와 100 mM Na2CO를 이용하여 pH를 조절하였다. 모든 배지는 121℃에서 15분간 멸균 후 사용하였다.
- 메타지놈 분석 결과 일부 균주는 배양 가능한 균주로 조사되었다. 이들 균주를 포함하여 복합적인 균총 가운데 분리 배양이 가능한 균주를 선별하기 위해, 천연 발효액의 물리화학적인 특성과 메타지놈 분석 결과를 바탕으로 영양배지를 변형시켜 농화배양을 통한 균주 선별과정에 이용하였다. 경우에 따라, 농화배양 배지의 선택성을 강화할 목적으로 인디칸을 배지에 추가로 첨가하였다.
- 따라서 본 연구에서 제안된 선택배지에서는 동일한 종만이 농화배양되는 것을 확인하였다. 이때 박테리아에 대한 선택성의 증가를 위해 진핵미생물의 성장을 제한하는 항생제의 사용도 병행하였다. 염색이 되지 않는 발효액에서도 6개의 균주가 농화배양되었으나, 본 연구의 목적과 달라 후속 연구를 진행하지 않았다 (data not shown).
- 염기성의 indigo-carmine은 물에 용해되면 보라색을 띤 청색을 나타내며, 환원되면 노란색으로 변하는 특성을 이용해 환원력을 검출하는데 사용된다. 이를 위해 YPA media (100 mM NaHCO2/Na2CO, 0.8% peptone, 0.3% yeast extract, 1% agar and pH 10)에 4.3 mM indigo-carmine이 포함된 배지를 제작하였다 [22]. 각 균을 30℃ 혐기조건에서 3일간 배양하며 배지의 색상 변화를 통해 환원력 여부를 확인하였다.
- 본 연구에서 indigo를 화학적으로 대량 환원시킴으로써 발생하는 환경오염이나 질환 유발 문제를 해결하기 위해, indigo의 환원과정에 미생물을 이용할 수 있는 가능성을 제시하고자 한다. 이를 위해 metagenomics의 전형적인 접근법으로 쪽 식물을 발효시킨 발효액에 존재하는 균총을 분석한 후, 분리 배양될 수 있는 균주의 특성 규명을 시도하였다. 이들의 indigo 환원능은 확인함으로써 전통적인 인디고 발효과정에 규격 혹은 표준화 요소로서 미생물의 이용가능성을 알아보았다.
- 따라서 이러한 오류를 보안하기 위해 KOH test를 수행하였다. 이를 위해 네 가지 균을 3% KOH 용액과 혼합하여 점성이 나타나는 시간과 정도를 확인하였다. KOH test에서 15초 내외에 강한 점성이 나타나는 결과를 그람음성균으로 판독하고 있는데, 실험에 이용된 균들은 모두 점성이 나타나지 않았다.
- 이를 위해 배당체인 indican을 포함한 M9 최소 배지에서 성장한 균주 4종을 OD600=2.5±0.2의 흡광도를 보일 때까지 배양한 후, 균체 일부 (0.1~0.2 g)를 회수하였다.
- Indican으로부터 indigo의 생산이 가능하고, 발효액의 염기조건에서 생존하는 것으로 확인된 균주들을 이용해 염액의 생성과정에서 중요한 환원력 (indigo의 leuco-indigo로의 전환)을 제공하는지를 시험하였다. 이를 위해 최종선별된 4종의 균주와 대조군으로 대장균 (E. coli strain XL1-Blue)을 배양하여 0.1~0.2 g의 cell을 획득하고, 50 mM potassium phosphate (pH 7.0)에 재 부유시킨 후, 15 mM 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride를 처리하였다. 결과적으로 현재 일반적으로 쓰이는 화학 환원제 (45 mM Na2S2O4)와 흡광도로 비교했을 때, 4개의 균주를 혼합한 샘플에서 최대 10배 높은 환원력이 나타남을 확인하였다.
- 각각 (염색이 잘 된 것과 그렇지 않은 것)의 발효액에서 얻은 16S rRNA 유전자들은 클로닝이 용이한 commercialized TA cloning vector를 사용하여 library를 구축하였다. 재조합 유전자 pool은 X-gal을 이용하여 약 2900개의 positive clone을 1차적으로 확보하였고, insert의 제한효소 (Sau3AI) 처리에 따른 절편의 크기와 패턴에 따라 총 40개의 subfamily로 분류해 균총분석에 이용하였다.
- 균의 성장으로 형성된 투명한 환에 10% HgCl2/20% HCl 용액을 가하여 카제인에 대한 분해능을 확인하였다. 전분 분해능을 확인하기 위해 nutrient 평판배지에 0.15% soluble starch를 첨가하여 테스트 배지를 제작하였다. 제작한 배지에 균을 접종하고 배양한 후, iodine 용액을 콜로니 주변에 떨어뜨려 투명한 환이 형성되는지를 확인하였다.
- 2차 선별된 clone을 LB 액체 배지에 배양하여 DNA purification system (Promega, USA)을 사용하여 plasmid을 정제하였다. 정제된 plasmid는 삽입된 각각의 16S rRNA 유전자를 PCR로 재증폭하기 위한 주형으로 이용하였다. 증폭된 유전자는 Sau3AⅠ제한효소를 처리한 후, gel 상에서 절편의 크기나 성분비가 다른 것을 최종 선별해 염기서열 분석에 이용하였다.
- 15% soluble starch를 첨가하여 테스트 배지를 제작하였다. 제작한 배지에 균을 접종하고 배양한 후, iodine 용액을 콜로니 주변에 떨어뜨려 투명한 환이 형성되는지를 확인하였다. 각 균의 젤라틴에 대한 분해능은 다음과 같이 확인하였다.
- 준비된 시료 (발효액 40.5 ml)를 원심분리 했을 때, 대략 0.1~0.2 g 정도의 세포를 포함한 고형분을 회수할 수 있었으며, 재료 및 방법에서 서술한 방법으로 핵산을 분리하였을 때 1.25~1.5 ng/µL (total volume 100 µL) genomic DNA를 추출하였다.
- 증폭된 16S rRNA 유전자는 PCR Clean-Up Kit로 회수한 후, pGEM®-T vector(Promega)와 T-Blunt vector system (Solgent, Korea)에 클로닝하였다.
- 정제된 plasmid는 삽입된 각각의 16S rRNA 유전자를 PCR로 재증폭하기 위한 주형으로 이용하였다. 증폭된 유전자는 Sau3AⅠ제한효소를 처리한 후, gel 상에서 절편의 크기나 성분비가 다른 것을 최종 선별해 염기서열 분석에 이용하였다. 서열 분석에는 pGEM®-T와 T-Blunt vector의 M13 primer (F5’-GTAAAACGACGGCCA GT-3’, R5’-GCGGATAACAATTTCACACAGG–3’)를 이용하였다.
- 이때 대장균 숙주로는 XL1-blue를 이용하였다. 형질전환체는 2% X-gal agar 배지에 도말하여 흰색 콜로니를 선별한 후, 신선한 배지로 옮겨 같은 과정으로 검증하였다.
- 대조군으로 이용한 균이 포함되지 않은 합성인디고는 환원이 이루어지지 않아 염색이 되지 않았다. 환원력은 경과일에 따른 염착량을 평가하였으며, 균주양에 따른 최대염착량을 평가제시하였다(Fig. 4).
- 환원력이 확인된 균주들을 이용해 leuco-indigo를 생산한 후, 직물을 염색하는 방법으로 실 적용 가능성 여부를 확인하였다. 이를 위해 0.
- 환원력이 확인된 분리 균주를 이용해 실제로 indigo 환원과 염색과정에 적용하기 위한 laboratory scale의 염액 제조를 시도하였다. 천연인디고의 경우는 균주의 첨가가 없어도 어느 정도의 자연적인 환원이 이루어졌다.
대상 데이터
- KDB3 (KC433536), Nesterenkonia sp. KDB4(KC433537)로 명명하였다.
- 또한 인디고 염료의 전구물질인 indican 배당체(indoxyl-glucose)를 탄소원으로 사용하여 생장 가능한 균주를 선별하기 위해 M9 최소영양배지에서 같은 조건으로 배양하였다. 배양된 균주는 일반적인 표현형질 차이에 따라 최종분석 대상 균주로 선별하였다.
- 비교연구를 위해 전라남도 나주에서 염색 장인이 Polygonum tinctorium을 전통적인 방법으로 발효시켜 염색이 정상적으로 이루어진 것과 동일한 발효과정을 거쳤으나 염색이 되지 않은 발효액을 각각 이용하였다. 모든 발효액은 -70℃에 보관된 상태로 실험을 진행하였다.
- 25 g을 첨가하고 배양된 균을 첨가하여 32℃에서 반응시켰다. 이때 사용한 합성 인디고는 시판중인 제품 (Indigo, Vat Blue 1, Aldrich, Germany)을 구입하여 사용하였다. 각 균은 YPD (pH 10) 액체배지에 배양하며 OD600=2.
- 전라남도 나주의 쪽 천연염색 장인이 쪽 (Polygonum tinctorium)의 전통발효를 통해 만든 염액 중 염색이 잘 되는 2008년, 2010년 염액과 염색이 잘 되지 않는 2009년 염액을 -70℃에 보관된 상태로 시료로 사용하였다. 영양배지 (1% Trypton, 0.
- 이때 co-precipitation에 의해 DNA 손실을 유발하는 protein precipitation solution은 처리하지 않았다. 추출한 DNA는 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 주형 DNA로 사용하였다.
이론/모형
- 특히 혐기성 균에서 이런 현상이 빈번하며 경우에 따라 배양 기간에 의해서도 음성으로 탈색되는 경우가 있어 정확한 판독이 어렵다. 따라서 이러한 오류를 보안하기 위해 KOH test를 수행하였다. 이를 위해 네 가지 균을 3% KOH 용액과 혼합하여 점성이 나타나는 시간과 정도를 확인하였다.
- 상기 과정에서 최종 선별된 40개의 클론은 제한효소 절단 절편 패턴이 같은 각각의 subfamily를 대표할 수 있는지를 임의로 선정된 subfamily 하나의 특성분석으로 확인한 후, 서열 분석을 진행하였다. 얻어진 염기서열은 BLAST N (NCBI) 프로그램을 이용해 database (GenBank) 상의 관련 균주들과 consensus sequence를 비교하는 방법으로 동정에 이용하였다. 분석결과, 천연 발효액 중 염색이 가능했던 발효액에서는 Alkalibacterium이 우점하고 있었다.
- 자연환원이 일어나는 천연발효 염액에서 순수분리한 균주의 환원력을 확인하기 위한 방법으로, TTC reduction assay 법을 활용하였다. 이를 위해 배당체인 indican을 포함한 M9 최소 배지에서 성장한 균주 4종을 OD600=2.
성능/효과
- 보다 유의한 방법으로 indigo와 유사한 구조를 가지며, 환원여부를 확인할 수 있는 지시약인 indigo-carmine을 이용하여 4개 균주의 환원력을 확인하였다. 4.3 mM의 indigo-carmine이 포함된 YPA media를 배양한 결과, 4개의 균주가 성장함에 따라 푸른빛의 배지에 노란색의 환이 생성되었다. 각 균주의 환원력에 따라 환의 크기는 다르지만 4개 균 모두 indigo-carmine에 대한 환원력을 지니고 있음을 확인하였다(data not shown).
- 따라서 pH 9 이상의 알칼리에서 자라는 특성을 바탕으로 각 균이 특정 시약에 반응하는지 여부를 확인할 수 있는 API ZYM kit를 이용하여 생리활성을 분석하였다. API ZYM kit 결과, 110-8, W5044, AC84는 비슷한 특성을 보이지만, TPL19는 세 가지 균주와는 다른 특성을 보였다 (Table 2). TPL19에서 뚜렷한 β-glucosidase 활성을 보였고, 네 균주 모두 α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-fucosidase에 대한 활성은 측정되지 않았다.
- Nesterenkonia sp. KDB4는 20 mg 첨가 시 최대염착량이 2.75로 가장 높게 나왔고, 이후 균주 첨가양이 증가하여도 최대염착량은 감소한 결과를 나타내어 다른 균주에 비해 환원력이 낮음을 알 수 있었다.
- TPL19에서 뚜렷한 β-glucosidase 활성을 보였고, 네 균주 모두 α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-fucosidase에 대한 활성은 측정되지 않았다.
- 3 mM의 indigo-carmine이 포함된 YPA media를 배양한 결과, 4개의 균주가 성장함에 따라 푸른빛의 배지에 노란색의 환이 생성되었다. 각 균주의 환원력에 따라 환의 크기는 다르지만 4개 균 모두 indigo-carmine에 대한 환원력을 지니고 있음을 확인하였다(data not shown).
- 결과적으로 선별된 4개 균주 모두 합성인디고에 대한 환원력을 가지고 있으며, 전반적으로 경과일에 따른 환원력이 다르게 나타남을 알 수 있었다. 선별된 4개 균주의 적정 배합을 통해 인디고의 환원개시일을 앞당기고, 높은 염착량을 나타낼 수 있는 환경을 유지하는 방법을 고안해야 할 것이다.
- 결과적으로 인디칸을 가수분해할 수 있는 β-glucosidase를 지니고 있음이 확인되었으며, 균주 110-8의 경우는 X-gal을 가수분해 할 수 있는 glycosyl hydrolase를 생산함이 확인되었다.
- 0)에 재 부유시킨 후, 15 mM 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride를 처리하였다. 결과적으로 현재 일반적으로 쓰이는 화학 환원제 (45 mM Na2S2O4)와 흡광도로 비교했을 때, 4개의 균주를 혼합한 샘플에서 최대 10배 높은 환원력이 나타남을 확인하였다. 대조군으로 이용된 대장균을 같은 조건에서 비교하였을 때, 각각의 균주의 15~43% 정도의 환원력만 측정되었다.
- 39)을 나타내었다. 균주 40 mg과 60 mg을 첨가한 경우에는 모두 하루 만에 염색이 개시되었으며, 균주량이 많을수록 더 높은 환원력을 보이는 것을 확인하고 그 이상의 균주양에서는 실험을 하지 않았다. Nesterenkonia sp.
- 결과적으로 현재 일반적으로 쓰이는 화학 환원제 (45 mM Na2S2O4)와 흡광도로 비교했을 때, 4개의 균주를 혼합한 샘플에서 최대 10배 높은 환원력이 나타남을 확인하였다. 대조군으로 이용된 대장균을 같은 조건에서 비교하였을 때, 각각의 균주의 15~43% 정도의 환원력만 측정되었다.
- 복합균총 내에서의 미생물 상호작용이나 고체 배지의 특성으로 인해 제한된 균주만이 선별되었을 수도 있는 가능성을 고려해, 염료 발효액을 액체 배지에 희석하여 다시 액체 배지에 접종하고 균체의 성장이 확인되면 새로운 배지에 재희석해 종류가 다른 균주의 농화배양이 유도되는지를 확인하였으나, 종이 다른 새로운 균주는 선별되지 않았다. 따라서 본 연구에서 제안된 선택배지에서는 동일한 종만이 농화배양되는 것을 확인하였다. 이때 박테리아에 대한 선택성의 증가를 위해 진핵미생물의 성장을 제한하는 항생제의 사용도 병행하였다.
- 9%의 높은 상동성을 확인하여 분석을 신뢰성을 확보할 수 있었다. 또한 원 발효액의 환경 (알칼리성)에 적합한 균주들이 주로 존재하는 것을 확인함으로써 균총 분석의 신뢰성을 담보할 수 있었다.
- 메타지놈 분석 결과 일부 균주는 배양 가능한 균주로 조사되었다. 이들 균주를 포함하여 복합적인 균총 가운데 분리 배양이 가능한 균주를 선별하기 위해, 천연 발효액의 물리화학적인 특성과 메타지놈 분석 결과를 바탕으로 영양배지를 변형시켜 농화배양을 통한 균주 선별과정에 이용하였다.
- 미생물 균총 분석을 위해 메타지놈을 추출하기 위한 인디고 천연 발효액은 염색 의 성패에 상관없이 모두 알칼리 조건(pH 9.11~9.6)의 특성을 지니고 있음이 확인되었다. 준비된 시료 (발효액 40.
- 준비된 배양액에 발효액을 희석배율에 따라 도말하고 30℃에서 4일간 배양하였을 때, 정상적으로 염색이 진행된 발효액에서 5개의 균주 (TPL19, Tibet-IBa2, AC84, W5044, 110-8)를 얻을 수 있었다. 복합균총 내에서의 미생물 상호작용이나 고체 배지의 특성으로 인해 제한된 균주만이 선별되었을 수도 있는 가능성을 고려해, 염료 발효액을 액체 배지에 희석하여 다시 액체 배지에 접종하고 균체의 성장이 확인되면 새로운 배지에 재희석해 종류가 다른 균주의 농화배양이 유도되는지를 확인하였으나, 종이 다른 새로운 균주는 선별되지 않았다. 따라서 본 연구에서 제안된 선택배지에서는 동일한 종만이 농화배양되는 것을 확인하였다.
- 얻어진 염기서열은 BLAST N (NCBI) 프로그램을 이용해 database (GenBank) 상의 관련 균주들과 consensus sequence를 비교하는 방법으로 동정에 이용하였다. 분석결과, 천연 발효액 중 염색이 가능했던 발효액에서는 Alkalibacterium이 우점하고 있었다. 전체적인 균총의 비율을 분석하면 71% Alkalibacteriums과 14% uncultured bacterium clone ambient alkaline (clone NN2-1), 그리고 나머지 균총의 주된 종으로는 Bacillus가 검출되었으나 이외에도 다양한 비배양종이나 미규명 종들이 확인되었다 (Fig.
- 분석된 서열은 GenBank에 등록된 관련 균주의 16S rRNA 서열과 의미 있는 유사성 (> 90%)을 보였고, subfamily 내의 균주 간에는 모두 99.0~99.9%의 높은 상동성을 확인하여 분석을 신뢰성을 확보할 수 있었다.
- 액체 배양된 세포 (OD600=2.7±0.2)를 반응액 (50 mM Tris-Cl, pH 7~10, 1% Triton X-100, 그리고 1 mM indican)에 첨가해 3일간 반응시켰을 때, 4종의 균주에서 indican(1 mM) 으로부터 indigo로의 뚜렷한 전환 (1.6~33.8%)이 재확인되었다 (data not shown).
- 2). 염색이 되지 않았던 두 번째 발효액에서는 uncultured bacterium clone ambient alkaline이 대략 50%, Bacillus 계열이 30%를 차지하며 매우 제한된 종 편중현상이 관찰되었다 (data not shown). 고세균이나 곰팡이는 분석과정에서 배제하였다 (실제 영양 선택 배지에 발효액을 도말한 결과 확인되지 않았다).
- Indican에 대해 활성이 있는 균주로 선별된 4가지 균주에 대한 정확한 동정을 위해 배양 특성과 생리/생화학적 특성을 분석하였다 (Table 1). 우선, Gram-staining 결과 모두 양성균임이 확인되었다. 하지만 Gram-staining의 경우 일부 그람양성균은 그람음성으로 염색되는 경우가 있다.
- 전자의 경우는 가수분해 산물로 생성되는 glucose를 이용해 세포성장이 가능한 것으로 알려져 있다. 이러한 활성을 확인하고자 배당체인 indican을 유일 탄소원으로 첨가한 M9 최소영양배지에 배양하였을 때, 4개의 균주 (TPL19, AC84, W5044, 110-8)가 생장이 유도되었고 가수분해 산물인 indigo의 생성으로 인해 남색의 colony가 관찰되었다(Fig. 3). 결과적으로 인디칸을 가수분해할 수 있는 β-glucosidase를 지니고 있음이 확인되었으며, 균주 110-8의 경우는 X-gal을 가수분해 할 수 있는 glycosyl hydrolase를 생산함이 확인되었다.
- 자연적인 쪽 식물 발효 환경에 존재하는 균총을 바탕으로 인디고 환원의 순수 생물학적 접근 방법은 가능한 것으로 확인되었다. 메타지놈 분석결과를 바탕으로 배양 가능한 균주들의 추가 발굴과 이를 이용한 생물학적 인디고 환원법을 정립할 경우, 관련된 연구분야에 새로운 응응 가능성을 제시할 수 있을 것이다.
- 분석결과, 천연 발효액 중 염색이 가능했던 발효액에서는 Alkalibacterium이 우점하고 있었다. 전체적인 균총의 비율을 분석하면 71% Alkalibacteriums과 14% uncultured bacterium clone ambient alkaline (clone NN2-1), 그리고 나머지 균총의 주된 종으로는 Bacillus가 검출되었으나 이외에도 다양한 비배양종이나 미규명 종들이 확인되었다 (Fig. 2). 염색이 되지 않았던 두 번째 발효액에서는 uncultured bacterium clone ambient alkaline이 대략 50%, Bacillus 계열이 30%를 차지하며 매우 제한된 종 편중현상이 관찰되었다 (data not shown).
- 경우에 따라, 농화배양 배지의 선택성을 강화할 목적으로 인디칸을 배지에 추가로 첨가하였다. 준비된 배양액에 발효액을 희석배율에 따라 도말하고 30℃에서 4일간 배양하였을 때, 정상적으로 염색이 진행된 발효액에서 5개의 균주 (TPL19, Tibet-IBa2, AC84, W5044, 110-8)를 얻을 수 있었다. 복합균총 내에서의 미생물 상호작용이나 고체 배지의 특성으로 인해 제한된 균주만이 선별되었을 수도 있는 가능성을 고려해, 염료 발효액을 액체 배지에 희석하여 다시 액체 배지에 접종하고 균체의 성장이 확인되면 새로운 배지에 재희석해 종류가 다른 균주의 농화배양이 유도되는지를 확인하였으나, 종이 다른 새로운 균주는 선별되지 않았다.
후속연구
- 자연적인 쪽 식물 발효 환경에 존재하는 균총을 바탕으로 인디고 환원의 순수 생물학적 접근 방법은 가능한 것으로 확인되었다. 메타지놈 분석결과를 바탕으로 배양 가능한 균주들의 추가 발굴과 이를 이용한 생물학적 인디고 환원법을 정립할 경우, 관련된 연구분야에 새로운 응응 가능성을 제시할 수 있을 것이다.
- 결과적으로 선별된 4개 균주 모두 합성인디고에 대한 환원력을 가지고 있으며, 전반적으로 경과일에 따른 환원력이 다르게 나타남을 알 수 있었다. 선별된 4개 균주의 적정 배합을 통해 인디고의 환원개시일을 앞당기고, 높은 염착량을 나타낼 수 있는 환경을 유지하는 방법을 고안해야 할 것이다.
- 이때 박테리아에 대한 선택성의 증가를 위해 진핵미생물의 성장을 제한하는 항생제의 사용도 병행하였다. 염색이 되지 않는 발효액에서도 6개의 균주가 농화배양되었으나, 본 연구의 목적과 달라 후속 연구를 진행하지 않았다 (data not shown).
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