The extract from Lysimachia foenum-graecum (LFE) has been known to possess various instructive characters including anti-oxidant, anti-obesity, fungicidal activities. However, the accurate mechanism of those effects of LFE is not well known. In that respect, we evaluated the apoptotic effect and ant...
The extract from Lysimachia foenum-graecum (LFE) has been known to possess various instructive characters including anti-oxidant, anti-obesity, fungicidal activities. However, the accurate mechanism of those effects of LFE is not well known. In that respect, we evaluated the apoptotic effect and anti-cancer efficacy of extracts of LFE in MCF-7 breast cancer cells. In this study, we hypothesized that LFE may exert cancer cell apoptosis through regulating p53 and mitochondria-mediated apoptotic proteins. And this substance can generate ROS to cause free radical-induced apoptosis. Accordingly, the generation of ROS by LFE triggers the activation of p53 which are accompanied by pro-apoptotic protein activation and suppression of pro-survival proteins. We determined with MTT assay, flow cytometry for detection of intracellular ROS and Annexin V-PI staining, Western blotting. Consequently, our researches demonstrated that the treatment of LFE to breast cancer cells resulted in an activation of p53, Puma, Bax, cleaved-PARP and an inhibition of Bcl-2 expressions.
The extract from Lysimachia foenum-graecum (LFE) has been known to possess various instructive characters including anti-oxidant, anti-obesity, fungicidal activities. However, the accurate mechanism of those effects of LFE is not well known. In that respect, we evaluated the apoptotic effect and anti-cancer efficacy of extracts of LFE in MCF-7 breast cancer cells. In this study, we hypothesized that LFE may exert cancer cell apoptosis through regulating p53 and mitochondria-mediated apoptotic proteins. And this substance can generate ROS to cause free radical-induced apoptosis. Accordingly, the generation of ROS by LFE triggers the activation of p53 which are accompanied by pro-apoptotic protein activation and suppression of pro-survival proteins. We determined with MTT assay, flow cytometry for detection of intracellular ROS and Annexin V-PI staining, Western blotting. Consequently, our researches demonstrated that the treatment of LFE to breast cancer cells resulted in an activation of p53, Puma, Bax, cleaved-PARP and an inhibition of Bcl-2 expressions.
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문제 정의
5%를 나타냈다. NAC의 단독 처리 및 LFE와 병행 처리한 결과를 통하여 NAC의 처리로 인해 LFE의 ROS 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 동일한 조건으로 Western blotting을 실시하여 NAC과 LFE의 처리가 세포 내 신호전달 체계에 미치는 영향을 확인해보고자 하였다. 그 결과 p53은 NAC을 통한 항산화 조건에서 발현되지 않았으며, LFE와 병행 처리한 경우에도 발현이 증가하지 않는 것으로 나타났다.
또한 HT-29대장암세포에서 레스베라트롤의 처리에 따른 세포 내 ROS 증가에 의해서 AMPK가 활성화되어 apoptosis가 유도되며, 같은 세포에서 EGCG 처리 농도가 증가함에 따라 p53 과 PARP의 cleavage가 일어나는 원인이 ROS 증가에 의한 것임을 DCFH-DA 염색을 통해 확인한 바 있다 [15,16]. 따라서 본 연구에서는 MCF-7 세포에 LFE를 처리하였을 때 나타나는 세포증식억제 및 apoptosis 유도 효과가 LFE의 ROS 생성과 연관이 있을 것이라는 점을 확인하고자 하였다. 이를 확인하기 위하여 Fig.
이에 따라 MCF-7 유방암 세포에서 LFE의 처리에 따른 ROS의 증가가 세포 생존에 중요한 역할을 하는 p53의 활성을 조절하여 apoptosis 유도 과정에 중요한 역할을 할 것이라 예상하였다. 또한 p53에 의한 apoptosis 유도 분자인 Puma의 활성 및 세포의 생존 및 사멸에 관여하는 미토콘드리아 관련 단백질들인 Bcl-2, Bax의 조절을 확인하여 HT-29 세포에서의 apoptosis를 확인하고자 하였다. 우선 LFE를 농도별로 처리했을 때 p53, Puma, Bcl-2, Bax의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blotting을 실시하였다.
우선적으로 LFE 처리에 따른 암세포 억제 과정에 있어서 p53의 조절을 통한 apoptosis 유도효과를 확인하고, 이러한 p53이 LFE의 어떠한 작용에 의해 조절되는지 밝히고자 하였다. 또한 p53에 의해 조절되는 단백질인 Puma의 발현, 그리고 LFE가 세포의 apoptosis 유도 및 억제 과정에 관여하는 미토콘드리아 관련 단백질들인 Bcl-2, Bax 의 발현을 조절하는 과정 통해 LFE에 의한 HT-29 대장암 세포의 apoptosis 유도 과정의 세포 신호전달 경로를 확인하고자 한다
암세포는 세포 성장 및 증식을 유지하기 위하여 다량의 에너지, 지방 그리고 아미노산 등을 필요로 하며, 산화적 스트레스와 pro-survival 분자들의 조절, 그리고 항산화적 기능의 변환 등과 같은 방법으로 스스로를 보호하기 위한 방어수단을 만들어 낸다 [17]. 본 실험에서는 이러한 암세포의 자가방어 현상을 파괴하기 위한 수단으로써, ROS가 세포 산화환원반응 신호경로뿐만 아니라 세포의 산화적 손상을 유도한다는 점에 주목하여 실험을 진행하였다. 이에 따라 MCF-7 유방암 세포에서 LFE의 처리에 따른 ROS의 증가가 세포 생존에 중요한 역할을 하는 p53의 활성을 조절하여 apoptosis 유도 과정에 중요한 역할을 할 것이라 예상하였다.
따라서 세포 내 단백질 조절을 통한 암세포의 증식 억제와 apoptosis 유도가 암 억제에 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 본 연구에서는 LFE가 MCF-7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 LFE를 농도별로 처리하여 MTT assay를 통하여 암세포의 생존율을 측정하였다. Fig.
암 예방 및 치료를 위하여 항암제, 파이토케미컬, 그리고 최근에는 천연물 추출물을 이용하여 세포 내 신호 경로를 조절을 통한 apoptosis, angiogenesis, metastasis 등 다양한 분야의 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 MCF-7 유방암 세포에서 영릉향 추출물 (LFE)에 의해 생성되는 ROS를 이용한 apoptosis 유도 효과를 확인하였다. MTT assay를 이용하여 LFE의 처리에 따른 세포 생존율의 억제를 확인하였고, 이러한 세포증식억제가 apoptosis에 의한 것임을 PI-Annexin V staining을 통해 확인하였다.
본 연구에서는 여러 질병에 효과를 가진 영릉향 추출물 (LFE)을 항암 작용에 적용하여 MCF-7 유방암 세포에서 세포 신호경로 조절을 통한 암세포의 apoptosis 유도 효과를 알아보고자 하였다. 우선적으로 LFE 처리에 따른 암세포 억제 과정에 있어서 p53의 조절을 통한 apoptosis 유도효과를 확인하고, 이러한 p53이 LFE의 어떠한 작용에 의해 조절되는지 밝히고자 하였다.
본 연구에서는 여러 질병에 효과를 가진 영릉향 추출물 (LFE)을 항암 작용에 적용하여 MCF-7 유방암 세포에서 세포 신호경로 조절을 통한 암세포의 apoptosis 유도 효과를 알아보고자 하였다. 우선적으로 LFE 처리에 따른 암세포 억제 과정에 있어서 p53의 조절을 통한 apoptosis 유도효과를 확인하고, 이러한 p53이 LFE의 어떠한 작용에 의해 조절되는지 밝히고자 하였다. 또한 p53에 의해 조절되는 단백질인 Puma의 발현, 그리고 LFE가 세포의 apoptosis 유도 및 억제 과정에 관여하는 미토콘드리아 관련 단백질들인 Bcl-2, Bax 의 발현을 조절하는 과정 통해 LFE에 의한 HT-29 대장암 세포의 apoptosis 유도 과정의 세포 신호전달 경로를 확인하고자 한다
이러한 p53이 전사인자로서 활동하는 작용을 억제하는 물질인 pifithrin-α (PFT-α)를 이용하여 LFE에 의한 ROS 조건 형성과정에 있어서 p53의 역할에 대해 알아보고자 하였다.
전통적인 한약재로 잘 알려져있는 영릉향 (Lysimachia foenum-graecum)은 강한 향기가 있고, 맛은 달고 쓰며, 기의 순환을 촉진하여 통증, 치통, 염증 제거 그리고 항비만 효과가 있다고 알려져 있다 [2,3]. 하지만 영릉향의 암에 대한 연구는 아직까지 잘 이루어지지 않았으며, 이에 따라 본 연구에서는 영릉향을 이용하여 apoptosis 관련 단백질들의 조절을 확인하며, 이러한 apoptosis 유도 효과가 reactive oxygen species (ROS)의 생성에 의한 것임을 밝히고자 한다. ROS는 세포 내신호전달에 영향을 주는 매개체이며, 과도한 ROS의 생성은 세포 내 산화적 스트레스를 증가시켜 세포 손상을 유발하여 세포 기능 및 세포주기의 억제 그리고 apoptosis를 유도한다 [5,6].
제안 방법
1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하여 각각 p53 (1:1000), PARP (1:1000) Bcl-2 (1:1000), Puma (1:1000), Bax (1:1000), β-actin (1:1000)의 농도로 반응시켰으며.
1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하여 각각 p53 (1:1000), PARP (1:1000) Bcl-2 (1:1000), Puma (1:1000), Bax (1:1000), β-actin (1:1000)의 농도로 반응시켰으며. 2차 항체는 mouse (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), rabbit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 각각의 농도로 희석하여 반응시킨 다음 Blue X-ray film에 감광하여 결과를 관찰하였다.
5× Laemmli sample buffer (loading dye; 250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 40% glycerol, 4% β-mercaptoethanol, 0.08% bromophenol blue, 8% SDS)와 MCF-7 세포에서 추출한 단백질을 혼합하여 표본을 제작하였다.
Apoptosis는 FITC-Annexin V apoptosis detection kit (BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. Annexin V-PI staining을 위해, MCF-7 세포에 LFE를 농도별 (0, 10, 20, 50, 100 µg/mL)로 처리하였다.
Fig. 4를 통하여 LFE의 처리로 p53 의존적 ROS 산화과정을 통한 apoptosis 유도 관련 단백질 조절 관계를 살펴보았다. 그러므로 LFE에 의한 ROS 발생을 NAC을 통해 억제시킨 조건에서의 단백질 조절 양상을 살펴볼 필요가 있었다.
본 연구에서는 MCF-7 유방암 세포에서 영릉향 추출물 (LFE)에 의해 생성되는 ROS를 이용한 apoptosis 유도 효과를 확인하였다. MTT assay를 이용하여 LFE의 처리에 따른 세포 생존율의 억제를 확인하였고, 이러한 세포증식억제가 apoptosis에 의한 것임을 PI-Annexin V staining을 통해 확인하였다.또한 DCFH-DA염색을 통하여 LFE 에 의한 ROS 발생 증가를 확인한 후, LFE를 농도별로 처리했을 때 p53, Puma, Bax, Bcl-2와 같은 apoptosis 관련 단백질들의 발현이 조절됨을 Western blotting을 통하여 확인하였다.
24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음, 1×106cells/mL의 농도에서 binding buffer로 suspension하였다. 그 후 MCF-7 세포를 Annexin V-FITC와 prodipium iodide (PI)로15분간 염색한 후, Flow cytometry - FACS Canto (BectonDickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하여 결과를 관찰하였다.
세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음, 1×106 cells/mL의 농도에서 PBS 로 suspension하였다. 그 후 세포를 PBS에 suspension한 후, Flow cytometry - FACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하여 결과를 관찰하였다. 또한 12 well plate에 cover glass를 넣어 1×106cells/mL 로 분주하여 배양시키며, N-acetylcysteine (NAC)을 처리하고 30분 후에 LFE를 처리하였다.
또한 LFE에 의한 암세포증식 억제효과가 apoptosis에 의한 것인지 알아보기 위하여 MCF-7 세포에 LFE를 10µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL를 24시간 동안 처리한 후 Annexin V-PI staining을 통하여 apoptosis가 유도된 세포를 측정 하였다.
매 24시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)를 이용하여 세포를 부유상태로 만든 다음 세포를 1×106cells/mL로 분주하여 계대 배양하였다.
또한 12 well plate에 cover glass를 넣어 1×106cells/mL 로 분주하여 배양시키며, N-acetylcysteine (NAC)을 처리하고 30분 후에 LFE를 처리하였다. 물질처리 경과 시간에 따른 ROS 발생 관찰을 위해 시간에 맞추어 DCFH-DA를 처리하여 incubation시킨 후, fluorescence microscope (Carl Zeiss SMT AG, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
세포 내 ROS 측정을 위해, MCF-7 세포에 LFE를 농도별 (20, 50, 100 µg/mL)로 처리하였다.
이를 위하여 먼저 MTT assay를 통해 PFT-α를 단독 그리고 LFE 와 병행처리하였을 때의 세포 생존율을 확인하였다.
그러므로 LFE에 의한 ROS 발생을 NAC을 통해 억제시킨 조건에서의 단백질 조절 양상을 살펴볼 필요가 있었다. 이를 위하여 우선 MTT assay를 통해 NAC의 처리에 따른 세포 생존율의 변화를 관찰하였다. Fig 5(a)에서 나타내는 것과 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 LFE 50 µg/mL을 처리한 군은 약 60%, NAC 단독처리군에서 101%, 병행 처리군에서 99.
대상 데이터
MCF-7 세포는 America Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, MD)에서 분양 받았으며, 10% FBS (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics (100 mg/L streptomycin, 100 U/mL penicillin)가 포함된 RPMI 1640 media (Hyclone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO2 , 37oC 조건하에서 배양하였다. 매 24시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclone Laboratories Inc.
Pifithrin-α는 Calbiochem (San Diego, USA)에서 구입하였으며, DMSO에 용해하여 20 µg/ml stock으로 만들어 -20oC에 보관 하였다.
본 실험에 이용된 영릉향은 대전한약재시장에서 구입하였으며, 영릉향 분쇄가루 100 g에 에탄올 800 mL을 가하여 완전히 침지한 후, 상온에서 환류시키면서 추출하였다. 상기 추출 방법을 통해 제조된 영릉향 추출물을 감압농축기를 이용하여 감압농축한 후, 수득한 추출물은 -80oC에서 보관하였다.
데이터처리
각 자료는 3번이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p< 0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
실험설계에 대한 분석은 통계 프로그램인 SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA)의 Student's t-test로 검정하였다.
, Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번 시행하며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
(A) LFE inhibits cell proliferation in MCF-7 breast cancer cells. Cell viability was measured by MTT assay. Cells were treated with LFE 10~100 µg/ml for 24 h.
MTT assay를 이용하여 LFE의 처리에 따른 세포 생존율의 억제를 확인하였고, 이러한 세포증식억제가 apoptosis에 의한 것임을 PI-Annexin V staining을 통해 확인하였다.또한 DCFH-DA염색을 통하여 LFE 에 의한 ROS 발생 증가를 확인한 후, LFE를 농도별로 처리했을 때 p53, Puma, Bax, Bcl-2와 같은 apoptosis 관련 단백질들의 발현이 조절됨을 Western blotting을 통하여 확인하였다. PFT-α 를 이용하여 종양형성 억제자인 p53의 기능을 억제하였을 때, MCF-7 세포에서 LFE에 의한 apoptosis 유도 과정은 p53 중심적으로 일어남을 확인하였다.
또한 p53에 의한 apoptosis 유도 분자인 Puma의 활성 및 세포의 생존 및 사멸에 관여하는 미토콘드리아 관련 단백질들인 Bcl-2, Bax의 조절을 확인하여 HT-29 세포에서의 apoptosis를 확인하고자 하였다. 우선 LFE를 농도별로 처리했을 때 p53, Puma, Bcl-2, Bax의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig.
성능/효과
(a)에서 MCF-7 세포에 LFE를 농도별(0, 20, 50, 100 µg/mL)로 24시간 처리하여 flow cytometric 분석을 통해 DCF의 검출을 확인한 결과, LFE의 처리 농도가 증가함에 따라 ROS 수준이 증가한다는 것을 밝혀냈다.
(a)에서와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 LFE단독처리 군에서는 68.2%의 생존율을 나타냈으며, PFT-α 단독 처리시126.7%, LFE와 PFT-α병행처리 시에는 118.18%를나타냄을 관찰하였다.
(b)에서 나타내는 것과 같이 p53은 LFE 처리시 증가하며, PFT-α는 p53 자체의 발현을 억제하는 것이 아니기 때문에 PFT-α와 LFE 병행처리 시에도 증가됨을 확인하였다.
그 결과 Fig. 1(b)에서와 같이 LFE를 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포의 apoptosis가 유도 되었으며, 이를 통하여 LFE의 처리에 따른 HT-29 세포의 증식억제 효과는 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하였다.
Bcl-2는 LFE 단독처리에 의해 저해되어 Bax의 발현을 증가시키지만, PFT-α와 LFE 병행처리 시 p53의 작용이 억제된 조건에서는 Bcl-2의 저해를 통해 Bax의 발현이 증가하지 않는다는 것이 확인되었다.
3에서와 같이 LFE의 농도의 존적으로 p53의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. LFE의 처리에 따라 미토콘드리아에 존재하는 단백질인 Puma는 종양억제자인 p53의 조절로 인하여 그 발현이 증가하고, 또한 Bcl-2의 활성을 억제시킴으로써 Bax의 발현을 증가시키는 일련의 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 유방 암세포에서의 apoptosis 과정 중 p53과 Bcl-2는 매우 밀접한 관계를 가진 것으로 알려져 있으며, p53 돌연변이가 과발현될 경우 Bcl-2의 발현이 down-regulation된다 [18].
PFT-α 를 이용하여 종양형성 억제자인 p53의 기능을 억제하였을 때, MCF-7 세포에서 LFE에 의한 apoptosis 유도 과정은 p53 중심적으로 일어남을 확인하였다.
또한 Bcl-2cDNA를 encoding하고 있는 pCR-Bcl-2 plasmid를 transfection하여 Bcl-2를 과발현 시킨 MCF-7/Bcl-2 세포에서 genistein의처리로 Bcl-2의 억제, Bax, p53의 활성 그리고 PARP의 cleavage를 통한 apoptosis를 유도한 연구결과가 보고되어왔다 [19]. ROS를 통한 pro-apoptosis의 유도는 암세포의 apoptosis 유도 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 Bax의 활성과 Bcl-2 의 억제 및 caspase의 활성에 의해서 이루어진다는 선행연구와 본 연구의 결과를 바탕으로 LFE의 처리에 의하여 p53 그리고 미토콘드리아의 apoptosis 연관 단백질들인 Puma, Bcl-2, Bax와 같은 신호분자들의 조절이 이루어질 수 있다는 것을 확인하였다.
Bcl-2는 NAC과 LFE 병행 처리군에서 감소하는 것으로 나타난 것으로 보아, 항산화 조건에서도 LFE의 ROS 이외의 다른 경로를 통하여 직접적으로 저해할 수 있다는 것을 의미한다. 결과적으로 NAC의 처리에 따른 항산화 조건에서는 LFE에 의해 발생되는 ROS의 제거로 인해 p53에 의한 apoptosis 유도 효과가 감소한다는 것을 의미한다. 본 연구에서의 LFE에 의한 apoptosis 유도 과정이 일어남에 있어서 p53이 중심적인 역할을 하며, LFE에 의한 ROS는 p53의 활성에 의해 발생될 수 있다는 것을 바탕으로 향후 심화적인 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 보인다.
PFT-α 를 이용하여 종양형성 억제자인 p53의 기능을 억제하였을 때, MCF-7 세포에서 LFE에 의한 apoptosis 유도 과정은 p53 중심적으로 일어남을 확인하였다. 결론적으로, LFE에 의한 ROS 발생은 p53-dependent한 경로를 통해 이루어지며, 이를 통하여 암세포의 생존 및 apoptosis에 관여하는 단백질들을 조절하여 암세포의 증식억제 효과를 가진다는 것을 확인하였다.
우선 LFE를 농도별로 처리했을 때 p53, Puma, Bcl-2, Bax의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blotting을 실시하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 LFE의 농도의 존적으로 p53의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. LFE의 처리에 따라 미토콘드리아에 존재하는 단백질인 Puma는 종양억제자인 p53의 조절로 인하여 그 발현이 증가하고, 또한 Bcl-2의 활성을 억제시킴으로써 Bax의 발현을 증가시키는 일련의 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다.
그 결과 LFE 50 µg/mL를 단독으로 처리한 군에서는 시간이 지남에 따라 DCF 형광이 증가하는 것으로 보아 ROS 발현이 증가하고, NAC을 30분 선처리 후 LFE를 처리하였을 시에는 LFE에 의한 ROS의 발생이 억제되어 DCF에 의한 형광이 감소한 것을 확인하였다.
NAC의 단독 처리 및 LFE와 병행 처리한 결과를 통하여 NAC의 처리로 인해 LFE의 ROS 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 동일한 조건으로 Western blotting을 실시하여 NAC과 LFE의 처리가 세포 내 신호전달 체계에 미치는 영향을 확인해보고자 하였다. 그 결과 p53은 NAC을 통한 항산화 조건에서 발현되지 않았으며, LFE와 병행 처리한 경우에도 발현이 증가하지 않는 것으로 나타났다. 또한 Puma와 Bax 역시 LFE 단독 처리군 외에 NAC의 처리에 의해서 그 발현이 억제됨을 확인하였다.
선행 연구에 따르면 MCF-7 세포에서 천연 식물에서 추출한 stevioside의 처리로 인한 ROS의 생성이 mitochondrial transmembrane potential (MTP)의 변화를 유도하며, 이에 따라 미토콘드리아 연관 apoptotic 단백질들인 Bax, Bcl-2, Caspase-9의 조절되어 apoptosis를 일으킴이 밝혀졌다 [20]. 따라서 선행연구및 본 연구의 결과를 통해 MCF-7 세포에서의 apoptosis 유도는 식물 추출물에 의한 ROS생성과 그에 따른 p53의 활성을 통해 이루어 질 수 있음을 확인할 수 있다.
암은 비정상적인 세포 증식 또는 암세포의 apoptosis가 원활하게 이루어지지 않는 경우에 나타나는 질병으로 알려져 있다. 따라서 세포 내 단백질 조절을 통한 암세포의 증식 억제와 apoptosis 유도가 암 억제에 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 본 연구에서는 LFE가 MCF-7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 LFE를 농도별로 처리하여 MTT assay를 통하여 암세포의 생존율을 측정하였다.
그 결과 p53은 NAC을 통한 항산화 조건에서 발현되지 않았으며, LFE와 병행 처리한 경우에도 발현이 증가하지 않는 것으로 나타났다. 또한 Puma와 Bax 역시 LFE 단독 처리군 외에 NAC의 처리에 의해서 그 발현이 억제됨을 확인하였다. Bcl-2는 NAC과 LFE 병행 처리군에서 감소하는 것으로 나타난 것으로 보아, 항산화 조건에서도 LFE의 ROS 이외의 다른 경로를 통하여 직접적으로 저해할 수 있다는 것을 의미한다.
본 실험에 이용된 영릉향은 대전한약재시장에서 구입하였으며, 영릉향 분쇄가루 100 g에 에탄올 800 mL을 가하여 완전히 침지한 후, 상온에서 환류시키면서 추출하였다. 상기 추출 방법을 통해 제조된 영릉향 추출물을 감압농축기를 이용하여 감압농축한 후, 수득한 추출물은 -80oC에서 보관하였다. 상기 영릉향 추출물은 각 농도의 물질을 동일한 용량의 DMSO에 녹였고, -20oC에 냉동 보관하여 사용하였다.
18%를나타냄을 관찰하였다. 이러한 결과를 토대로 p53이 암세포의 증식에 있어서 중요한 역할을 하며, 전사인자로서 p53의 작용이 억제되었을 시 세포증식과 관련된 인자들이 활성화 됨을 알 수 있었다. 이와 같은 조건으로 Western blotting을 실시한 결과, Fig.
후속연구
본 연구에서의 LFE에 의한 apoptosis 유도 과정이 일어남에 있어서 p53이 중심적인 역할을 하며, LFE에 의한 ROS는 p53의 활성에 의해 발생될 수 있다는 것을 바탕으로 향후 심화적인 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 보인다. 더하여 Bcl-2의 조절과 같이, LFE의 ROS생성 기능뿐만 아니라 다양한 경로를 통한 apoptosis 유도 효과를 확인할 필요가 있을 것으로 보인다. 또한 암세포의 증식억제 및 ROS 생성을 통한 apoptosis유도 효과를 가진 신소재를 발견하였다는 점에서 앞으로 더 많은 in vitro, in vivo실험을 통하여 LFE를 이용한 항암효과를 확인해 볼 필요가 있을 것이다.
더하여 Bcl-2의 조절과 같이, LFE의 ROS생성 기능뿐만 아니라 다양한 경로를 통한 apoptosis 유도 효과를 확인할 필요가 있을 것으로 보인다. 또한 암세포의 증식억제 및 ROS 생성을 통한 apoptosis유도 효과를 가진 신소재를 발견하였다는 점에서 앞으로 더 많은 in vitro, in vivo실험을 통하여 LFE를 이용한 항암효과를 확인해 볼 필요가 있을 것이다.
결과적으로 NAC의 처리에 따른 항산화 조건에서는 LFE에 의해 발생되는 ROS의 제거로 인해 p53에 의한 apoptosis 유도 효과가 감소한다는 것을 의미한다. 본 연구에서의 LFE에 의한 apoptosis 유도 과정이 일어남에 있어서 p53이 중심적인 역할을 하며, LFE에 의한 ROS는 p53의 활성에 의해 발생될 수 있다는 것을 바탕으로 향후 심화적인 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 보인다. 더하여 Bcl-2의 조절과 같이, LFE의 ROS생성 기능뿐만 아니라 다양한 경로를 통한 apoptosis 유도 효과를 확인할 필요가 있을 것으로 보인다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
영릉향은 어떤 특징이 있는가?
전통적인 한약재로 잘 알려져 있는 영릉향 (Lysimachia foenum-graecum)은 강한 향기가 있고, 맛은 달고 쓰며, 기의 순환을 촉진하여 통증, 치통, 염증 제거 그리고 항비만 효과가 있다고 알려져 있다 [2,3]. 하지만 영릉향의 암에 대한 연구는 아직까지 잘 이루어지지 않았으며, 이에 따라 본 연구에서는 영릉향을 이용하여 apoptosis 관련 단백질들의 조절을 확인하며, 이러한 apoptosis 유도 효과가 reactive oxygen species (ROS)의 생성에 의한 것임을 밝히고자 한다.
유방암은 어떤 요인에 의해 발생하는가?
유방암은 전 세계적으로 여성들에게 가장 흔히 발병되는 질병으로 발생률이 꾸준히 증가하고 있으며, 이에 따른 사망률 또한 점차 증가하고 있다. 유방암은 여성의 에스트로겐 호르몬 의존성 암으로, 산업화에 의한 잘못된 식습관과 출산 문제 등 여러 가지 요인에 의해 발생한다 [1]. 항암제를 이용한암 치료는 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미치고, 내성을 가지게 된다는 문제점을 야기시키기 때문에 이를 대체할 수 있는 물질을 찾아내는 것이 중요한 과제로 여겨지고 있다.
reactive oxygen species란 무엇인가?
하지만 영릉향의 암에 대한 연구는 아직까지 잘 이루어지지 않았으며, 이에 따라 본 연구에서는 영릉향을 이용하여 apoptosis 관련 단백질들의 조절을 확인하며, 이러한 apoptosis 유도 효과가 reactive oxygen species (ROS)의 생성에 의한 것임을 밝히고자 한다. ROS는 세포 내신호전달에 영향을 주는 매개체이며, 과도한 ROS의 생성은 세포 내 산화적 스트레스를 증가시켜 세포 손상을 유발하여 세포 기능 및 세포주기의 억제 그리고 apoptosis를 유도한다 [5,6]. Apoptosis는 세포 내 외부에서 오는 신호에 의해 일련의 과정을 거치는데, 주로 p53, Bcl-2 family, Bax, Caspase 등이 연관되어 있는 것으로 알려져 있다 [4].
참고문헌 (20)
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