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문제 정의
- 본 연구에서는 가축사체 매몰지 토양을 대상으로 미생물 군집 구조를 분석하였다. 분석결과를 문(phylum)별로 구분해보면, A 토양은 Proteobacteria (100%), B 토양은 Actinobacteria (66.
가설 설정
- 17) A 토양에서 98% 비율로 나타난 Pseudomonas의 경우, 기회적(opportunistic) 미생물로 부식질을 이용하지 못하지만, 동물의 배설물, 동물 사체 등의 기질을 이용하여 높은 수준의 활성과 빠른 성장을 보이는 것으로 보고되어 있다.17) Arthrobacter는 토양에서 주로 발견되며, 포자(spore)를 형성하지 않고도 건조하거나 영양이 결핍된 환경에 대해 저항성이 높다. 또한 제초제, 카페인, 페놀, 유기물질 등 다양한 영양물질에 대한 분해능을 가진다.
제안 방법
- DNA template에서 16S rDNA 유전자 증폭은 V1에서 V3까지의 지점(region)을 목표로, primer 27f (5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 518r (5’-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’)를 기반으로 한 fusion primer를 사용하였고, 각 primer 20 pmol과 추출된 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.
- genomic DNA purification kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였다. DNA 추출 여부는 1.2% agarose gel에서 전기영동(electrophoresis)하여 확인하였다. 또한, Quant-iTTM PicoGreenⓇ dsDNA assay kit (Invitrogen, Calrsbad, CA, USA)를 이용한 DNA 정량 및 정성평가를 통해, DNA가 오염되지 않고 성공적으로 추출되었는지 검사하였다.
- 따라서, 대량의 가축 매몰지 토양이 환경에 노출되어 2차적인 환경오염을 일으킬 수 있는데, 아직까지 가축 매몰지 토양의 생물학적 안정성과 관련된 조사가 부족하다. 따라서, 본 연구에서는 구제역으로 인하여 조성된 3곳의 가축 매몰지에서 내부 토양을 채취하여, 분자생물학적 방법을 통해 미생물 군집구조를 분석하고, 생물학적 안정성을 평가하였다.
- 2% agarose gel에서 전기영동(electrophoresis)하여 확인하였다. 또한, Quant-iTTM PicoGreenⓇ dsDNA assay kit (Invitrogen, Calrsbad, CA, USA)를 이용한 DNA 정량 및 정성평가를 통해, DNA가 오염되지 않고 성공적으로 추출되었는지 검사하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 각각 bead에 부착하여 PCR을 하고 GS FLX titanium system (Roche, USA) 염기서열 분석기를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 진행하였다. 얻어진 염기서열은 Hidden Markov Model (HMM)과 blast search를 통해, non-16S read를 제거하고, profile을 생성하여 Eztaxon(http://www.eztaxon.org)12)으로 16S rDNA sequence를 비교 동정하였다. 최소 종 추정치(minimum number of operational taxonomic units)는 ACE13)와 Chao 114)를 통해 계산하였으며, 세균의 종다양성 분석은 Shannon 지수(index)15)를 이용하였다.
- 절차는 initial denaturation(94℃, 4분)을 한 후, denaturation (94℃, 30초), annealing(58℃, 4분 30초), extension (68℃, 30초)한 것을 50 cycle 반복 수행한 후 마지막으로 10℃에서 정지(Hold)하였다. 증폭된 PCR 산물은 각각 bead에 부착하여 PCR을 하고 GS FLX titanium system (Roche, USA) 염기서열 분석기를 이용하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 진행하였다. 얻어진 염기서열은 Hidden Markov Model (HMM)과 blast search를 통해, non-16S read를 제거하고, profile을 생성하여 Eztaxon(http://www.
- 토양 미생물의 DNA 추출을 위해 WizardⓇ genomic DNA purification kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였다. DNA 추출 여부는 1.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 3곳의 매몰지는 2011년 1월에 경기도에 조성된 것이다. 3곳 모두 구제역에 감염된 소와 돼지를 환경부가 고지한 가축 매몰지 환경관리지침2)을 기반으로 긴급 매몰한 지역이다.
- A와 B 지역의 경우 각각 소 58두와 123두를 매몰하였으며, C 지역은 돼지 3,708두를 매몰하였다. 본 연구에서는 2012년 초 가축사체를 재이설하는 과정에서 노출된 매몰지 내부 토양을 채취하여(2012년 4월) 분석하였다. 매몰지의 세부 현황은 Table 1에 제시하였다.
이론/모형
- 25 µL로 구성하였다. DNA 증폭을 위해 2720 thermal cycler 모델(Applied biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 emPCR 증폭(amplification)을 수행하였다. 절차는 initial denaturation(94℃, 4분)을 한 후, denaturation (94℃, 30초), annealing(58℃, 4분 30초), extension (68℃, 30초)한 것을 50 cycle 반복 수행한 후 마지막으로 10℃에서 정지(Hold)하였다.
- 최소 종 추정치(minimum number of operational taxonomic units)는 ACE13)와 Chao 114)를 통해 계산하였으며, 세균의 종다양성 분석은 Shannon 지수(index)15)를 이용하였다. 또한 전반적인 미생물 군집 구성의 차이를 계통발생학적(phylogenetic)으로 비교해보기 위하여 UniFrac 방법을 사용하였다.16)
- org)12)으로 16S rDNA sequence를 비교 동정하였다. 최소 종 추정치(minimum number of operational taxonomic units)는 ACE13)와 Chao 114)를 통해 계산하였으며, 세균의 종다양성 분석은 Shannon 지수(index)15)를 이용하였다. 또한 전반적인 미생물 군집 구성의 차이를 계통발생학적(phylogenetic)으로 비교해보기 위하여 UniFrac 방법을 사용하였다.
성능/효과
- Ralstonia는 대표적인 수소산화(hydrogenoxidizing) 박테리아로 수소화 효소(hydrogenase enzyme)를 지니고 있으며, 주로 물과 토양에서 발견된다.18) 종(species) 별로 살펴보면, B와 C 토양에서 Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa 등이 검출되었는데, B 토양에서 특히 Ralstonia pickettii가 전체 종 중 28.2%의 비율로 가장 높게 나타났다. Ralstonia pickettii는 비발효성(nonfermentative), 그람음성(gram negative), 간균(rod-type bacteria)으로 기회 감염균(opportunistic pathogen) 중 하나이다.
- 3) 구제역 바이러스는 열, 산 (pH 6.5 이하) 및 알칼리 (pH 11 이상)에 민감하여 감염성이 쉽게 약화될 수 있고, 상대습도 50% 이하일 때 급격히 생존력을 상실함으로, 실제로 가축 매몰지 침출수에서 바이러스 자체가 검출되었다는 보고는 현재까지 없다.3,4) 하지만, 매몰 처리된 사체 자체는 약 70%의 수분을 함유한 부패성 유기물질이므로, 가축사체의 부패가 진행됨에 따라 침출수가 발생할 수 있고, 병원성 미생물(Escherichia coli O157:H7, Campylobacter, Salmonella, Leptospira, Crystosporidium, Giardia 등)이 침출수와 함께 매몰지 주변 토양 및 지하수로 유입될 수 있는 잠재적인 위험성을 가지고 있다.
- 3곳의 토양 미생물 군집의 종 다양성을 비교하기 위하여 굴절곡선(refraction curve)을 분석한 결과(Fig. 2), A 토양이 sequencing read에 비해 operational taxonomic unit (OTU)값이 가장 작게 나와(125), 종다양성 정도가 다른 토양보다 낮은 것으로 판단된다. 한편, B 토양과 C 토양의 굴절곡선은 유사한 기울기를 나타내었다.
- 본 연구에서 분석한 토양에서는, 토양에서 발견되는 균들이 주로 검출되었고 Salmonella나 Campylobacter와 같은 병원성 미생물은 검출되지 않았다(Table 3). 또한 가축 매몰지 환경관리지침2)에서 제시한 생물학적 안정성 평가 지표미생물인 Clostridium perfringens도 검출되지 않아서, 본 연구에서 분석한 가축 매몰지 토양은 생물학적 오염도가 낮은 것으로 판단된다. 이는 가축 매몰과정에서 투입된 소독약 및 석회에 의한 발열과 pH의 급격한 상승(염기성화)으로 인하여, 균의 불활성화율이 커지고 병원균이 사멸하였기 때문으로 추측된다.
- coli, Pseudomonas 등 일반세균수의 변화를 조사한 결과, 온도와 영양조건에 따라 3월에 5 × 103 CFU/mL로 측정된 후 5-7월에는 그 수가 증가되었다가 11월에 급격히 감소하였다. 또한, 세균이 증식된 5-7월에는 침출수 유기물질의 분해도 빠르게 나타났으며, 세균증식에 따라 pH가 증가하였다.
- 미생물의 문(phylum) 분류 결과, A 토양의 경우 전체 토양미생물이 Proteobacteria (100%) 1개의 문으로 동정되었으며, B 토양의 미생물은 Actinobacteria (66.4%) > Proteobacteria (31.1%) > Bacteriodetes (2.1%) > Acidobacteria (0.3%) 순으로, C 토양의 경우에는 Actinobacteria (63.1%) > Proteobacteria (36.9%)로 분포하였다.
- 본 연구에서 분석한 토양에서는, 토양에서 발견되는 균들이 주로 검출되었고 Salmonella나 Campylobacter와 같은 병원성 미생물은 검출되지 않았다(Table 3). 또한 가축 매몰지 환경관리지침2)에서 제시한 생물학적 안정성 평가 지표미생물인 Clostridium perfringens도 검출되지 않아서, 본 연구에서 분석한 가축 매몰지 토양은 생물학적 오염도가 낮은 것으로 판단된다.
- Shannon 지수에 의하면, A 토양의 미생물 종 다양성이 가장 낮은 것으로 나타났으며, B와 C 토양은 유사한 수준이었다. 분석결과, Salmonella, Campylobacter 그리고 Clostridium perfringens과 같은 병원균도 발견되지 않았으나, 세균혈증을 일으키는 Ralstonia pickettii가 높은 농도로 관찰되었다. 본 연구에 사용된 가축 매몰지 토양은 침출수에 의한 미생물학적 오염도가 낮은 것으로 판단되지만, 가축매몰에 따른 병원성 미생물에 의한 토양의 잠재적 위해성을 평가하기 위하여 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 판단된다.
- 분석결과를 문(phylum)별로 구분해보면, A 토양은 Proteobacteria (100%), B 토양은 Actinobacteria (66.4%) > Proteobacteria (31.1%) > Bacteriodetes (2.1%) > Acidobacteria (0.3%), C 토양은 Actinobacteria (63.1%) > Proteobacteria (36.9%) 순으로 분포하였다.
- 9%)로 분포하였다. 속(genus)별로 구분해 보면, A 토양에서는 Pseudomonas가 98% 비율로 나타났고, B와 C 토양의 경우 Arthrobacter가 각각 68, 61%로 우점하였다. 또한, B 토양의 경우, Ralstonia (29%) > Pedobacter (2%) 순으로 추가적으로 검출되었다.
- 5 m 깊이로 토양에 묻은 후, 총 88주간 토양에서 미생물을 동정한 결과, 매립 후 1주 이내에 급속히 주변 토양에서 오염이 발생하고, 미생물 유출이 발생하였다. 실험기간 동안 4 종류의 미생물이 꾸준히 관찰되었으며, Clostridium은 봄철에 Salmonella와 Bacillus는 겨울철에 더 우세하게 측정되었다. Chapman23)은 E.
- 한편, B 토양과 C 토양의 굴절곡선은 유사한 기울기를 나타내었다. 종 다양성 지수를 Shannon 지수에 근거하여 분석한 결과, A 토양이 2.37, B 토양 3.45, C 토양 3.43으로 나타났다(Table 2). B와 C 토양은 유사한 수준이었으며, A 토양의 Shannon 지수 값이 가장 낮게 나타났다.
- B와 C 토양은 유사한 수준이었으며, A 토양의 Shannon 지수 값이 가장 낮게 나타났다. 최소 종 추정치는 ACE, Chao 1 방법으로 분석하였는데, A 토양에는 158 종, B 토양 281종, C 토양 242-254종이 존재하는 것으로 추정되었다(Table 2). 가축 매몰지 토양 미생물 군집간의 관계를 알아보기 위해 UniFrac 방법으로 분석한 결과를 Fig.
- 파이로시퀀싱 결과, A 토양에서는 12,697개, B 토양 6,723개, C 토양 6,868개의 16S rRNA gene sequence를 획득하였다(Table 2). 미생물의 문(phylum) 분류 결과, A 토양의 경우 전체 토양미생물이 Proteobacteria (100%) 1개의 문으로 동정되었으며, B 토양의 미생물은 Actinobacteria (66.
후속연구
- 분석결과, Salmonella, Campylobacter 그리고 Clostridium perfringens과 같은 병원균도 발견되지 않았으나, 세균혈증을 일으키는 Ralstonia pickettii가 높은 농도로 관찰되었다. 본 연구에 사용된 가축 매몰지 토양은 침출수에 의한 미생물학적 오염도가 낮은 것으로 판단되지만, 가축매몰에 따른 병원성 미생물에 의한 토양의 잠재적 위해성을 평가하기 위하여 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 판단된다.
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